Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia metodę obrazowania bioluminescencyjnego in vivo genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych wstrzykniętych do mózgu myszy. Proces obejmuje wstrzyknięcie lucyferyny, przygotowanie obrazowania i wykrywanie sygnałów bioluminescencyjnych z przeszczepionych komórek w miejscu wstrzyknięcia.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Obrazowanie in vivo

1. Przygotowanie lucyferyny
   1. Rozmrozić sól potasową D-lucyferyny w temperaturze pokojowej (RT) i przygotować świeży roztwór podstawowy D-lucyferyny w stężeniu 30 mg/ml w PBS.
   2. Wysterylizuj roztwór podstawowy przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
      UWAGA: Zaleca się natychmiastowe użycie roztworu roboczego. W razie potrzeby rozpuszczoną lucyferynę można przechowywać w temperaturze -20 °C. Jednak długotrwałe przechowywanie może spowodować degradację sygnału. Lucyferyna jest odczynnikiem wrażliwym na światło; Jeśli to możliwe, trzymaj go z dala od bezpośredniego światła. Można również rozważyć alternatywne podłoża, np. cycluc, w celu poprawy limitu rozdzielczości.
2. Obrazowanie
   1. Wstępna konfiguracja
      UWAGA: Obrazowanie bioluminescencyjne przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania in vivo (patrz Tabela Materiałów) składającego się z ciemnej komory i chłodzonego urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
      1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania Living Image i wybierz identyfikator użytkownika z listy rozwijanej.
      2. Kliknij przycisk Zainicjuj w wyświetlonym panelu sterowania. Po zakończeniu procesu inicjalizacji pole temperatury w panelu sterowania zmieni kolor na zielony.
      3. Na panelu sterowania zaznacz pola Luminescencyjne i Zdjęcie i wybierz Automatyczna ekspozycja (~60 s). Wybierz pole widzenia (dla tego protokołu wybrano D/12,5 cm). Wprowadź wysokość obiektu (1,5 cm) i wybierz opcję ustawienia ostrości na wysokości obiektu. Ręcznie ustaw następujące parametry: duże binning, f/2, zablokowany filtr wzbudzenia i otwarty filtr emisji.
   2. Określić ilość wstrzyknięcia D-lucyferyny przy 300 mg/kg masy ciała.
      UWAGA: Standardowa zalecana dawka to 150 mg/kg D-lucyferyny. Procedura ta została dostosowana zgodnie z protokołem informującym o wyższej czułości przy użyciu 300 mg/kg.
   3. Wstrzyknąć lucyferynę dootrzewnowo (i.p.).
      UWAGA: Jeśli zwierzę wymaga uspokojenia przed wstrzyknięciem, należy pamiętać, że może to wydłużyć czas maksymalnej ekspresji lucyferazy.
   4. Odczekaj 5 minut, a następnie znieczul zwierzęta ciągłym podawaniem izofluranu (4,5% w fazie indukcji i 1,5-2% w fazie podtrzymującej podczas procedury obrazowania).
   5. Nałóż lubrykant okulistyczny na oczy, a następnie ogol uspokojone zwierzęta w okolicy głowy za pomocą konwencjonalnej golarki do włosów. Umieść zwierzęta w komorze obrazowania i rozpocznij obrazowanie 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, klikając Acquire w panelu sterowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały eksploatacyjne
Filtr strzykawkowy; 0,22 μm	TPP	99722
Sprzęt
Poduszka grzewcza	Produkt do wyboru
	Perkin Elmer	122799
Etanol; 70%			Produkt z wyboru
Izofluran (Izofluran (eter 1-chlor-2,2,2-trifluoroetylo-difluorometylo)) 99,9%)	Provet AG	Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Lubrykant oftalmiczny (Retinol palmitat: 15 000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Wszystkie produkty farmaceutyczne zostały dostarczone przez aptekę kantonalną w Zurychu w Szwajcarii

System obrazowania In-Vivo (IVIS Lumina III z pakietem oprogramowania Living Imaging 4.2)Perkin Elmer CLS136334 Waporyzator Isoflurane Provet AG 330724 Farmaceutyki i odczynniki Sól potasowa D-Lucyferyna