Przewody wysiewane komórkami Schwanna do regeneracji aksonów po urazie rdzenia kręgowego

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Lee, Y., et.al. Przeszczep komórek Schwanna do przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje zastosowanie piezoelektrycznego przewodu polimerowego wysianego komórkami Schwanna w celu promowania regeneracji aksonów w rdzeniu kręgowym szczura przeciętym przez sieć. Przewód zapewnia przewodnictwo strukturalne, a jego właściwości bioelektryczne stymulują wzrost neurytów. Komórki Schwanna w przewodzie wydzielają czynniki neurotroficzne, wspierając mostek aksonalny między kikutami rostralnymi i ogonowymi.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przekrój w T8

Umieść zwijacz wokół T7 do T9. Po usunięciu wszystkich blaszek upewnij się, że przerwy między wyrostkami poprzecznymi są widoczne, szczególnie w T8. Sprawdź również kości wzdłuż długości po obu stronach między T7 a T9, aby upewnić się, że nie ma żadnych fragmentów kości wystających na zewnątrz.
UWAGA: Ta przerwa w T8 jest ważna dla wykonania pełnego przecięcia. Kręgi na całej długości powinny zostać usunięte w celu łatwiejszego wprowadzenia przewodu.
Przetnij korzenie grzbietowe i brzuszne powyżej i poniżej T8 za pomocą kątowych nożyczek sprężynowych. Dodaj sól fizjologiczną do rdzenia kręgowego i poczekaj, aż krew zacznie krzepnąć.
UWAGA: Ten krok jest ważny dla prawidłowego wprowadzenia przewodu.
Umieść kątowe nożyczki sprężynowe nad rdzeniem kręgowym w szczelinach między wyrostkami poprzecznymi w T8 i wykonaj jedno cięcie, aby całkowicie przeciąć rdzeń kręgowy. Umieść mały kawałek sprasowanej pianki w powstałej szczelinie 2-2,5 mm i natychmiast dodaj sól fizjologiczną do tego obszaru.

2. Wstawianie kanału

Czekając, aż odcięte kikuty przewodu osiągną hemostazę, wyjmij przewód z 1x PBS. Pokrój trójkąty absorpcyjne na cienkie, długie kawałki i umieść je w przewodzie, aby usunąć nadmiar PBS. Sprawdź, czy wstępnie wycięte okna są otwarte.
Usuń sól fizjologiczną i krew za pomocą cienkich, długich kawałków trójkątów absorpcyjnych. Podnieś dwa kikuty rdzenia kręgowego za pomocą mikroszpatułki, aby zapewnić dobrą separację. Delikatnie podnieś kikut rostralny za pomocą mikroszpatułki i nasuń przewód na pień tak, aby okna były skierowane do siebie. Upewnij się, że cały kikut jest włożony i nie ma nadmiernego krwawienia do przewodu.
Delikatnie podnieś kikut ogonowy i wsuń drugi koniec przewodu na kikut. Upewnij się, że cały kikut jest włożony, a okna znajdują się na powierzchni grzbietowej (Rysunek 1A).

3. Komórka Schwanna (SC) / Przygotowanie i wstrzyknięcie matrycy iniekcyjnej Czekając

aż odcięta pępowina osiągnie hemostazę, usuń pożywkę powyżej granulki GFP-SC. Zawiesić GFP-SC w 10 μl zimnego DMEM/F12. Dodać 10 μl zimnego żelu do wstrzykiwań do zawiesiny komórek i dobrze wymieszać, wielokrotnie pipetując. Mieszaninę GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do momentu zakończenia wprowadzania przewodu.
Po upewnieniu się, że okienka na powierzchni grzbietowej są otwarte (rysunek 1A), wstrzyknąć 20 μl mieszaniny GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań do przewodu przez jedno z wstępnie wyciętych okienek za pomocą końcówki ładującej western blot i mikropipety. Jeśli mieszanina SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań przepełni przewód, usuń nadmiar za pomocą trójkątów absorpcyjnych. Zamknąć okna po wstrzyknięciu; szycie nie jest potrzebne (ryc. 1B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Zamknięcie okna po wstrzyknięciu SC/DMEM/F12/matrycy. Okna otwierane są poprzez odchylenie każdej klapy po umieszczeniu przewodu między kikutami rostralnymi i ogonowymi (A). Okna zamykają się po wstrzyknięciu (