Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Podsumowanie

Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą z łatwością postępować zgodnie z tymi protokołami, aby wykorzystać EM z barwieniem negatywowym jako rutynową analizę, obok innych testów biochemicznych, do oceny swoich próbek białek.

Streszczenie

Mikroskopia elektronowa (EM) pojedynczych cząsteczek, zarówno w przypadku próbek biologicznych barwionych negatywnie, jak i mrożonych w stanie uwodnionym, stała się wszechstronnym narzędziem w biologii strukturalnej ¹. W ostatnich latach metoda ta odniosła wielki sukces w badaniu struktur białek i kompleksów makromolekularnych ^{2, 3}. W porównaniu z kriomikroskopią elektronową (cryoEM), w której zamrożone i uwodnione próbki białek są zatopione w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego ⁴, barwienie negatywne jest prostszą metodą przygotowania próbek, polegającą na zatopieniu białek w cienkiej warstwie wysuszonej soli ciężkiego metalu w celu zwiększenia kontrastu preparatu ⁵. Zwiększony kontrast w EM z barwieniem negatywnym pozwala na badanie stosunkowo małych próbek biologicznych. Poza wyznaczaniem struktury trójwymiarowej (3D) oczyszczonych białek lub kompleksów białkowych ⁶, metoda ta może być wykorzystywana w znacznie szerszym zakresie. Na przykład EM z barwieniem negatywnym może być łatwo użyta do wizualizacji oczyszczonych próbek białek, pozwalając uzyskać informacje takie jak homogeniczność lub heterogeniczność próbki, tworzenie kompleksów białkowych lub dużych agregatów, a także po prostu do oceny jakości preparatu białkowego.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy pełny protokół wykorzystania EM do obserwacji próbek białek barwionych negatywnie, począwszy od przygotowania siatek pokrytych węglem do EM z barwieniem negatywnym, aż po pozyskiwanie obrazów próbek barwionych negatywnie w mikroskopie elektronowym pracującym przy napięciu przyspieszającym 120kV. Protokoły te są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i mogą być z łatwością wdrożone przez początkujących użytkowników.

Protokół

1. Przygotowanie siatek EM do napylania węglem

1. Napełnić duży zlew szklany wodą destylowaną.
2. Za pomocą pipety szklanej nanieść jedną kroplę kolodionu (~20μl, 2% w octanie amylu, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) na powierzchnię wody. Kolodion rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę plastyczną na granicy woda/powietrze; Uwaga: pierwszą kroplę kolodionu można wykorzystać do oczyszczenia powierzchni wody z cząsteczek kurzu. Po usunięciu błony z pierwszej kropli powierzchnia wody jest wolna od kurzu.
3. Umieszczać pojedynczo siatki EM, siatki miedziane Gilder o gęstości 400 lub 200 oczek zakupione od Ted Pella Inc. (USA), na warstwie plastycznej pływającej na powierzchni wody; zazwyczaj umieszczamy od 50 do 100 siatek w gęstym układzie, błyszczącą stroną siatki skierowaną w dół, w stronę warstwy plastycznej (Rys. 1A). Uwaga: siatki o gęstości 400 oczek są odpowiednie do rutynowych przygotowań do EM z barwieniem negatywowym, natomiast siatki o gęstości 200 oczek nadają się do zbierania obrazów par nachylenia.
4. Wyciąć kawałek papieru o wymiarach nieco większych niż obszar, w którym siatki zostały rozmieszczone na warstwie plastycznej. Ostrożnie położyć papier na wierzchu siatek (Rys. 1B) i poczekać, aż papier całkowicie nasiąknie (Rys. 1C). Uwaga: różne rodzaje papieru mają różną szybkość absorpcji wody. Ważne jest, aby papier nie chłonął wody zbyt szybko. Na przykład zwykły papier filtracyjny nie nadaje się do tego celu, ponieważ absorbuje wodę zbyt szybko i tworzy wiele zmarszczek. Błona węglowa wykonana z pogniecionego papieru nie jest płaska, a zatem nie nadaje się do zbierania obrazów par nachylenia do 3D rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym. Należy przetestować różne rodzaje papieru, aby znaleźć odpowiedni. W naszym laboratorium stosujemy papiery z notatników kupowanych w lokalnym sklepie spożywczym. Czasami za odpowiedni uznawany był również papier gazetowy. Inną opcją jest zastosowanie stosunkowo grubego papieru ryżowego używanego w kaligrafii chińskiej/japońskiej.
5. Szybko wykonać nacięcia w błonie plastycznej wokół i blisko namoczonego papieru. Następnie niezwłocznie użyć pęsety, aby podnieść papier z siatkami uwięzionymi między błoną plastyczną a papierem. Umieścić papier w szalce Petri z siatkami skierowanymi do góry w celu wysuszenia na powietrzu (Rys. 1D); Uwaga: ważne jest, aby pozwolić papierowi wyschnąć na powietrzu. Zbyt szybkie suszenie powoduje powstanie wielu zmarszczek w papierze.

2. Powlekanie siatek węglem

1. Urządzenie do napylania węgla wykorzystywane w naszym laboratorium to Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Nasz system jest wyposażony w monitor grubości warstwy Cressington, który mierzy grubość napylonej warstwy węgla w oparciu o zasadę, zgodnie z którą częstotliwość drgań kryształu kwarcu zmienia się pod wpływem masy warstwy osadzonej na jego powierzchni. Jednak opisany tutaj protokół nie wymaga monitora grubości, ponieważ często nie jest on dostępny w każdym laboratorium.
2. Naostrz pręcik węglowy za pomocą ostrzałki (Ted Pella) i umieść pręciki węglowe w urządzeniu do napylania węgla (Rys. 2A). Dwa pręciki, jeden z ostrą końcówką, a drugi z płaskim końcem, są umieszczane naprzeciw siebie.
3. Nałóż smar próżniowy na połowę matowego obszaru szkiełka przedmiotowego i umieść je obok siatek (Rys. 2B). Tylko połowa matowego obszaru szkiełka powinna być pokryta smarem próżniowym. Uwaga: Obszar ze smarem próżniowym nie zmieni koloru po napyleniu węgla. Kontrast między sąsiadującymi obszarami ze smarem i bez smaru pozwala na oszacowanie grubości napylonej warstwy węgla.
4. Umieść papier z siatkami na stole urządzenia do napylania węgla. Umieść szkiełko przedmiotowe obok siatek (Rys. 2C). Uwaga: Można również najpierw przenieść siatki pokryte folią plastikową na szkiełko przedmiotowe przed napylaniem, w przypadku gdy wiele siatek odpada z papieru.
5. Odpompuj powietrze z komory próżniowej i poczekaj, aż próżnia osiągnie poziom 10^-5 Torr. Uwaga: napylanie przy niższej próżni często generuje wiele iskier, co skutkuje obecnością wielu dużych cząsteczek węgla na siatce.
6. Zwiększ natężenie prądu bardzo powoli. Ostra końcówka pręcika węglowego najpierw stanie się czerwona, a następnie biała wraz ze wzrostem natężenia prądu. Nie patrz bezpośrednio na jasno świecącą końcówkę gołym okiem. Przestań zwiększać natężenie prądu, gdy rozpocznie się napylanie. Szkiełko przedmiotowe zmieni kolor z białego na jasnoszary, a następnie na ciemnoszary. Intensywność zabarwienia szkiełka koreluje z grubością napylanej warstwy węgla. Wyłącz prąd, aby przerwać napylanie, gdy zostanie osiągnięta pożądana grubość (Rys. 2D). Uwaga: 1) Po wielokrotnych procesach napylania węgla, węgiel osadzony na wewnętrznej stronie szklanego klosza może ściemnieć. Powoduje to, że napylona warstwa węgla wydaje się grubsza niż jest w rzeczywistości. 2) Jeden naostrzony pręcik węglowy może być użyty do kilku napyleń. Ostrość końcówki stopniowo zmniejsza się po każdym napyleniu. Maksymalne natężenie prądu zależy od ostrości pręcika węglowego. Świeżo naostrzony pręcik o mniejszej średnicy wymaga względnie niższego natężenia prądu do odparowania węgla. Późniejsze napylenia mogą wymagać nieco wyższego natężenia prądu.
7. Wypuść powietrze do komory próżniowej i wyjmij napylone siatki do późniejszego użycia.
   Uwaga 1. Dokładniejszą metodą kontrolowania grubości węgla jest zastosowanie monitora grubości warstwy. Można również przeprowadzić jakościową kalibrację koloru względem dokładnej grubości zmierzonej monitorem. Przydatna grubość węgla dla tej techniki wynosi od 3 do 7 nm.

Jest to prosta i łatwa metoda przygotowania dużej ilości siatek pokrytych węglem, zazwyczaj około 100 siatek na jedną partię. Siatki zawierają cienką warstwę plastiku, która zazwyczaj nie wpływa na jakość obrazu uzyskanego metodą barwienia negatywnego. Jednak siatki przygotowane tą metodą nie nadają się do cryoEM. Warstwę plastiku można usunąć, mocząc siatki w chloroformie przez kilka godzin.

3. Przygotowanie roztworu formatu uranylu (0,75%) do kontrastowania negatywnego w EM. Szczegółowy protokół został opisany wcześniej ⁵

1. Odważyć 37,5mg mrachianu uranylu do małego zlewki;
2. Dodać 5 ml wrzącej wody i mieszać przez 5 minut w ciemności;
3. Dodać 10μl 5M NaOH i kontynuować mieszanie przez 5 minut;
4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (Fisherbrand, filtr strzykawkowy 13mm, 0,2μm, nylonowy niesterylny, numer katalogowy 09-720-5) i przechowywać przefiltrowany roztwór w probówce Falcon o pojemności 8ml owiniętej folią aluminiową;
   Uwaga. Proszek mrachianu uranylu można nabyć w firmie Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), numer katalogowy 22451. Roztwór mrachianu uranylu jest światłoczuły i należy go chronić przed bezpośrednim światłem, na przykład poprzez owinięcie probówki Falcon folią aluminiową. Świeżo przygotowany roztwór ma jasny żółty kolor (Rys. 3A). Roztwór barwiący może być przechowywany na blacie od jednego do dwóch tygodni, zanim zacznie wytrącać osad. Mrachian uranylu jest kwasowy z pH ~4. Dodanie NaOH podnosi pH, jednak zbyt szybkie dodanie lub dodanie nadmiaru może spowodować wytrącenie barwnika. Poza generowaniem kontrastu, mrachian uranylu utrwala również próbkę białka. Ze względu na bardzo szybkie tempo utrwalania, niskie pH zazwyczaj nie wpływa na ogólną konformację białek ani na tworzenie się kompleksów białkowych ⁷.

4. Protokół przygotowania siatki EM do barwienia negatywowego. Protokół ten został opisany szczegółowo we wcześniejszej publikacji ⁵

1. Powlekanie siatki węglem w procesie wyładowań żarowych przy użyciu systemu PELCO easiGlow GlowDischarge (Ted Pella Inc., USA). Zastosowano prąd 15 mA, a czas wyładowań żarowych dla siatek wynosił 30 sec. Uwaga. Siatki poddane wyładowaniom żarowym należy wykorzystać krótko po zabiegu. Często używamy siatek w czasie krótszym niż 2 godziny po wyładowaniu.
2. Na kawałku parafilmu umieść dwie krople wody destylowanej o objętości 20 µl oraz dwie krople roztworu formatu uranylu o objętości 25 µl (Rys. 3B).
3. Przytrzymaj siatkę po wyładowaniu żarowym za pomocą antykapilarnych pęset o przeciwstawnym nacisku, stroną powleczoną węglem do góry. Uwaga: Konieczne jest użycie pęset antykapilarnych. W przeciwnym razie próbka ciekła zostanie zassana z siatek przez siły kapilarne występujące między ramionami pęsety.
4. Nanieś 2 µl próbki białka na siatkę po wyładowaniu żarowym i odczekaj 30 sec. Uwaga: Czas oczekiwania oraz czas trwania wyładowania żarowego wpływają na stężenie białek zaadsorbowanych na siatce. Bardzo rozcieńczone próbki wymagają dłuższego czasu adsorpcji. Jednak przedłużona adsorpcja może zmienić stężenie buforu z powodu parowania wody. Osiągnięcie właściwego rozmieszczenia cząsteczek na siatce wymaga pewnego podejścia metodą prób i błędów.
5. Odsącz próbkę za pomocą papieru filtrującego.
6. Dotknij powierzchni siatki kropli wody, a następnie odsącz wodę papierem filtrującym. Powtórz czynność z drugą kroplą wody.
7. Krótko dotknij powierzchni siatki pierwszej kropli barwnika. Odsącz roztwór barwnika papierem filtrującym.
8. Dotknij powierzchni siatki drugiej kropli barwnika na 20 seconds. Odsącz roztwór barwnika papierem filtrującym.
9. Wysusz siatkę w próżni. Uwaga: można również pozostawić siatki na stole laboratoryjnym lub w dygestorium do wyschnięcia na powietrzu. Zaletą suszenia próżniowego jest możliwość natychmiastowej obserwacji siatek w EM. Potencjalnym artefaktem wynikającym z szybkiego suszenia jest nierównomierne zabarwienie.

5. Transmisyjny mikroskop elektronowy

1. Mikroskop użyty w tej prezentacji to Tecnai T12 (firma FEI), wyposażony w kamerę CCD Gatan 4K x 4K.
2. Przed wprowadzeniem próbki należy krótko sprawdzić ustawienie mikroskopu; Uwaga: jest to konieczne tylko raz na sesję EM. W mikroskopie modelowym można wcześniej zapisać niemal idealne ustawienia. Wczytanie takiego pliku ustawień powinno przywrócić wyrównanie mikroskopu do stanu niemal idealnego.
3. Załaduj siatkę EM do standardowego uchwytu próbek z pojedynczym nachyleniem.
4. Wsuń uchwyt do modułu CompuStage mikroskopu T12. Odczekaj do zakończenia cyklu pompowania.
5. Wprowadź uchwyt do kolumny.
6. Ustaw ostrość preparatu i wybierz pożądany defokus, zazwyczaj -1.5um. Uwaga: ostrość można uzyskać albo poprzez ręczne ustawianie metodą minimalnego kontrastu, albo za pomocą kamery CCD do przechwytywania obrazów na żywo i obliczania widma mocy Fouriera w czasie rzeczywistym.
7. Rejestruj obraz za pomocą kamery CCD;
8. Na obrazach próbek białek barwionych negatywnie białka są często widoczne jako biały kontrast, tzn. biała gęstość na ciemniejszym tle. Należy zauważyć, że choć stężenia białek w różnych obszarach tej samej siatki są zazwyczaj bardzo podobne, można zaobserwować różny stopień zabarwienia w różnych obszarach tej samej siatki. Czasami obszary mogą mieć nierównomierne zabarwienie lub nawet zabarwienie pozytywne (białko wydaje się ciemne na jasnym tle), podczas gdy inne obszary mają idealne zabarwienie. Często konieczne jest przeszukanie siatki w celu znalezienia odpowiedniego obszaru do obrazowania.

6. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono przykłady typowych, wysokiej jakości obrazów próbek barwionych negatywnie: ferrytyny zmielonej śledziony konia (Rycina 4A), fragmentu Fab (Ryc. 4B), proteasomu 20S archeonów (Ryc. 4C) oraz nukleosomu (Ryc. 4D).

Rycina 1. Przygotowanie siatek powlekanych węglem do EM z barwieniem negatywowym. A) Umieszczanie siatek EM jedna po drugiej w gęstym układzie na powierzchni błony z kolodionu. B) Położenie kawałka papieru nieco większego niż obszar zajmowany przez siatki. C) Oczekiwanie do całkowitego namoczenia papieru. D) Podniesienie papieru wraz z siatkami w celu wysuszenia na powietrzu.

Rysunek 2. Pokrywanie siatek EM węglem. A) Przygotowanie naparowarki węglowej: umieszczenie dwóch prętów węglowych w aparacie do pokrywania, przy czym jeden pręt (po lewej) jest zaostrzony na końcu. Drugi pręt (po prawej) ma płaską powierzchnię i styka się z ostrzem pręta znajdującego się po przeciwnej stronie. B) Nałożenie niewielkiej ilości smaru próżniowego na jedną stronę szkiełka przedmiotowego. Obszar w czarnej ramce zawiera smar próżniowy. C) Przygotowanie siatek do pokrywania. Szkiełka przedmiotowe służą do utrzymania papieru w pozycji. Groty strzałek wskazują obszar ze smarem próżniowym. D) Po pokrywaniu kolor szkiełka pokrytego smarem próżniowym nie ulega zmianie. Kontrast wskazuje grubość naniesionego węgla.

Rycina 3. Ilustracja procedury barwienia negatywnego. A) Świeżo przygotowany (po lewej) roztwór formatu uranylu jest przezroczysty i nie wykazuje obecności osadów. Po 1~2 tygodniach na dnie probówki zaczynają gromadzić się osady. B) Na kawałku parafilmu należy umieścić dwie krople (~25μl) wody destylowanej oraz dwie krople roztworu formatu uranylu. Za pomocą pęsety antykapilarnej należy utrzymać siatkę EM powleczoną węglem, poddaną wyładowaniom żarowym, stroną węglową do góry. Na siatkę nanosi się kroplę próbki (~2μl). C) Po odczekaniu 30 sekund nadmiar roztworu należy odsączyć papierem filtracyjnym. D) Obrócić siatkę tak, aby strona z próbką dotknęła pierwszej kropli wody. Powtórzyć kroki C i D, aby zakończyć proces barwienia.

Rycina 4. Przykłady obrazów EM próbek białek barwionych negatywnie. A) Ferrytyna z śledziony konia, B) fragment wiążący antygen (Fab), C) archeony 20S proteasom oraz D) nukleosom. Wszystkie obrazy zarejestrowano przy tym samym powiększeniu. Pasek skali wynosi 20nm.

Dyskusja

Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym (EM) jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do badania struktur 3D oczyszczonych próbek białek, na przykład przy użyciu metody losowego nachylenia stożkowego (random conical tilt) ⁸, która wymaga zebrania pary obrazów – jednego z preparatu nachylonego pod kątem 60° i jednego z tego samego obszaru, ale bez nachylenia – w celu obliczenia rekonstrukcji 3D kompleksów makromolekularnych. Ponadto EM z barwieniem negatywowym może mieć wiele innych zastosowań, takich jak przesiewanie dwuwymiarowych (2D) kryształów białek błonowych ⁹, wizualizacja kompleksów białkowych w różnych konformacjach ¹⁰ lub po prostu wizualizacja homogeniczności i/lub heterogeniczności oczyszczonych próbek białek, co pozwala na uzyskanie informacji zwrotnych w celu udoskonalenia procedur oczyszczania białek itp. Może to być niezwykle użyteczna metoda dla biochemików. W niniejszym artykule przedstawiliśmy protokoły obejmujące etapy od przygotowania siatek pokrytych węglem po pozyskiwanie obrazów próbek białek barwionych negatywowo w mikroskopie elektronowym. Jak tutaj pokazano, procedura jest dość prosta i łatwa do przeprowadzenia. W przypadku próby obliczenia rekonstrukcji 3D obserwowanej próbki metodą losowego nachylenia stożkowego konieczne jest wykonanie par obrazów z nachyleniem. Jeżeli jednak celem jest analiza pojedynczych cząsteczek (single particle analysis), wystarczy wiele obrazów bez nachylenia. W obu przypadkach wymagane jest dalsze przetwarzanie obrazów, co wykracza poza zakres niniejszego artykułu wideo.

Jak w przypadku każdej metody, protokoły mogą ulegać modyfikacjom. Formian uranylu bardzo dobrze sprawdza się jako odczynnik do barwienia negatywowego w większości przypadków. Octan uranylu to kolejny powszechnie stosowany odczynnik do barwienia negatywowego. Działa on bardzo podobnie do formianu uranylu, lecz charakteryzuje się większym rozmiarem ziarna i w wielu przypadkach niższym kontrastem niż formian uranylu. Zaletą stosowania octanu uranylu jest to, że roztwór ten zachowuje stabilność dłużej niż formian uranylu, dzięki czemu nie ma konieczności przygotowywania świeżego roztworu co jeden lub dwa tygodnie. Zarówno formian, jak i octan uranylu mają odczyn kwasowy. Naturalną obawą jest fakt, że niskie pH może wywołać zmiany w badanej próbce białka. Oba roztwory barwiące pełnią również funkcję utrwalaczy białek. Wcześniejsze badanie wykazało, że oba szybko utrwalają próbki białek ⁷. Szybkie utrwalanie sprawia, że niskie pH ma mniejsze znaczenie. W procesie barwienia próbka białka zostaje utrwalona, zanim niskie pH zdąży wywołać jakiekolwiek zmiany. Niemniej jednak inne odczynniki do barwienia negatywowego, takie jak molibdan amonu i kwas fosfowolframowy, mogą przynieść lepsze wyniki w barwieniu próbek, gdy niskie pH jest problematyczne ⁷. Zarówno molibdan amonu, jak i kwas fosfowolframowy mają pH zbliżone do obojętnego, lecz kontrast próbek białek uzyskany przy użyciu tych barwników jest zazwyczaj gorszy niż w przypadku formianu uranylu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolodium	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml, 2% w octanie amylu
Siatki miedziane Gilder Cu	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200 mesh
Naparowarka węglowa z wysoką próżnią Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella, Inc.	9260
Dwustronnie zaostrzone pręty węglowe	Ted Pella, Inc.	58
Formian uranylu	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	czystość 99.9%
System wyładowań GlowDischarge PELCO easiGlow	Ted Pella, Inc.	91000	Kupić w lokalnej aptece
Papier filtracyjny Whatman #1	Fisher Scientific	09-805E