Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Podsumowanie

Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą z łatwością postępować zgodnie z tymi protokołami, aby wykorzystać EM z barwieniem negatywowym jako rutynową analizę, obok innych testów biochemicznych, do oceny swoich próbek białek.

Streszczenie

Mikroskopia elektronowa (EM) pojedynczych cząsteczek, zarówno w przypadku próbek biologicznych barwionych negatywnie, jak i mrożonych w stanie uwodnionym, stała się wszechstronnym narzędziem w biologii strukturalnej ¹. W ostatnich latach metoda ta odniosła wielki sukces w badaniu struktur białek i kompleksów makromolekularnych ^{2, 3}. W porównaniu z kriomikroskopią elektronową (cryoEM), w której zamrożone i uwodnione próbki białek są zatopione w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego ⁴, barwienie negatywne jest prostszą metodą przygotowania próbek, polegającą na zatopieniu białek w cienkiej warstwie wysuszonej soli ciężkiego metalu w celu zwiększenia kontrastu preparatu ⁵. Zwiększony kontrast w EM z barwieniem negatywnym pozwala na badanie stosunkowo małych próbek biologicznych. Poza wyznaczaniem struktury trójwymiarowej (3D) oczyszczonych białek lub kompleksów białkowych ⁶, metoda ta może być wykorzystywana w znacznie szerszym zakresie. Na przykład EM z barwieniem negatywnym może być łatwo użyta do wizualizacji oczyszczonych próbek białek, pozwalając uzyskać informacje takie jak homogeniczność lub heterogeniczność próbki, tworzenie kompleksów białkowych lub dużych agregatów, a także po prostu do oceny jakości preparatu białkowego.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy pełny protokół wykorzystania EM do obserwacji próbek białek barwionych negatywnie, począwszy od przygotowania siatek pokrytych węglem do EM z barwieniem negatywnym, aż po pozyskiwanie obrazów próbek barwionych negatywnie w mikroskopie elektronowym pracującym przy napięciu przyspieszającym 120kV. Protokoły te są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i mogą być z łatwością wdrożone przez początkujących użytkowników.

Protokół

1. Przygotowanie siatek EM do napylania węgla

1. Napełnić duży szklany zlew odmierniczy wodą destylowaną.
2. Za pomocą szklanej pipety nanieść jedną kroplę kolodionu (~20μl, 2% w octanie amylu, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) na powierzchnię wody. Kolodion rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę tworzywa na granicy woda/powietrze; Uwaga: Pierwsza kropla kolodionu może posłużyć do oczyszczenia powierzchni wody z cząsteczek kurzu. Po usunięciu filmu z pierwszej kropli powierzchnia wody jest wolna od kurzu.
3. Umieszczać pojedynczo siatki EM, siatki Gilder Cu o gęstości 400 lub 200 mesh zakupione od Ted Pella Inc. (USA), na warstwie tworzywa pływającej na powierzchni wody; Zazwyczaj umieszczamy od 50 do 100 siatek w układzie gęstego upakowania, błyszczącą stroną siatki skierowaną w dół, w stronę warstwy tworzywa (Rys. 1A). Uwaga: Siatki 200 mesh są odpowiednie do rutynowych siatek EM do barwienia negatywowego, natomiast siatki 200 mesh nadają się do zbierania obrazów par nachylenia.
4. Wyciąć kawałek papieru o wymiarach nieco większych niż obszar, w którym siatki zostały rozmieszczone na warstwie tworzywa. Ostrożnie położyć papier na wierzchu siatki (Rys. 1B) i poczekać, aż papier stanie się całkowicie mokry (Rys. 1C). Uwaga: Różne rodzaje papieru mają różną szybkość wchłaniania wody. Ważne jest, aby papier nie chłonął wody zbyt szybko. Na przykład zwykły papier filtracyjny nie nadaje się do tego celu, ponieważ chłonie wodę zbyt szybko i tworzy wiele zmarszczek. Film węglowy wykonany ze zmarszczonego papieru nie jest płaski, a zatem nie nadaje się do zbierania obrazów par nachylenia dla 3D rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym. Należy przetestować różne rodzaje papieru, aby znaleźć odpowiedni. W naszym laboratorium stosujemy papier z notatników kupionych w lokalnym sklepie spożywczym. Czasami za odpowiedni uznawano również papier gazetowy. Inną opcją jest użycie stosunkowo grubego papieru ryżowego stosowanego w kaligrafii chińskiej/japońskiej.
5. Szybko wykonać nacięcia w filmie z tworzywa wokół i blisko namoczonego papieru. Bezzwłocznie po tym użyć pęsety, aby podnieść papier z siatkami uwięzionymi między filmem z tworzywa a papierem. Umieścić papier w szalce Petri z siatkami skierowanymi do góry w celu wysuszenia na powietrzu (Rys. 1D); Uwaga: Ważne jest, aby pozwolić papierowi wyschnąć naturalnie. Zbyt szybkie suszenie powoduje powstanie wielu zmarszczek w papierze.

2. Powlekanie siatek karbonem

1. Urządzenie do napylania węgla używane w naszym laboratorium to Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Nasz system jest wyposażony w monitor grubości filmu Cressington, który mierzy grubość napylonej warstwy węgla w oparciu o zasadę, że częstotliwość drgań kryształu kwarcu zmienia się pod wpływem masy filmu osadzonego na jego powierzchni. Jednak opisany tutaj protokół nie wymaga monitora grubości, ponieważ często nie jest on dostępny w każdym laboratorium.
2. Należy zaostrzyć pręcik węglowy za pomocą ostrzałki (Ted Pella), a następnie umieścić pręciki węglowe w urządzeniu do napylania (Rys. 2A). Dwa pręciki, jeden z ostrym końcem, a drugi z płaskim, są ustawione naprzeciw siebie.
3. Należy nanieść smar próżniowy na połowę matowego obszaru szkiełka przedmiotowego i umieścić je obok siatek (Rys. 2B). Tylko połowa matowego obszaru szkiełka powinna być pokryta smarem próżniowym. Uwaga: obszar ze smarem próżniowym nie zmieni koloru po napylaniu węgla. Kontrast między sąsiadującymi obszarami ze smarem i bez niego pozwala na oszacowanie grubości napylonego węgla.
4. Należy położyć papier z siatkami na stole urządzenia do napylania węgla. Szkiełko przedmiotowe należy umieścić obok siatek (Rys. 2C). Uwaga: można również najpierw przenieść siatki pokryte folią plastikową na szkiełko przedmiotowe przed napylaniem, aby zapobiec odpadaniu wielu siatek z papieru.
5. Należy odpompować komorę próżniową i poczekać, aż próżnia osiągnie poziom 10^-5 Torr. Uwaga: napylanie przy niższej próżni często generuje wiele iskier, co skutkuje obecnością wielu dużych cząstek węgla na siatce.
6. Należy bardzo powoli zwiększać natężenie prądu. Ostry koniec pręcika węglowego w miarę wzrostu natężenia prądu najpierw stanie się czerwony, a następnie biały. Nie należy patrzeć bezpośrednio na jasno świecący koniec gołym okiem. Należy przestać zwiększać natężenie prądu w momencie rozpoczęcia napylania. Szkiełko przedmiotowe zmieni kolor z białego na jasnoszary, a następnie na ciemnoszary. Ciemność szkiełek koreluje z grubością napylanej warstwy węgla. Aby zakończyć napylanie po osiągnięciu pożądanej grubości, należy wyłączyć prąd (Rys. 2D). Uwaga: 1) Po wielokrotnych procesach napylania węgla, węgiel osadzony na wewnętrznej stronie szklanego klosza może przyciemnić jego kolor. Powoduje to, że napylona warstwa węgla wydaje się grubsza, niż jest w rzeczywistości. 2) Jeden zaostrzony pręcik węglowy można wykorzystać do kilku napyleń. Ostrość końcówki stopniowo zmniejsza się po każdym procesie. Maksymalne natężenie prądu zależy od ostrości pręcika węglowego. Świeżo zaostrzony pręcik o mniejszej średnicy wymaga relatywnie niższego natężenia prądu do odparowania węgla. Późniejsze napylania mogą wymagać nieco wyższego natężenia prądu.
7. Należy odpowietrzyć komorę próżniową i wyjąć napylone siatki do późniejszego użycia.
   Uwaga 1. Bardziej dokładną metodą kontrolowania grubości węgla jest zastosowanie monitora grubości filmu. Można również przeprowadzić jakościową kalibrację koloru względem dokładnej grubości zmierzonej monitorem. Przydatna grubość węgla dla tej techniki wynosi od 3 do 7 nm.

Jest to prosta i łatwa metoda przygotowania dużej ilości siatek pokrytych węglem, zazwyczaj ok. 100 siatek na jedną partię. Siatki zawierają cienką warstwę plastiku, która zazwyczaj nie wpływa na jakość obrazu po barwieniu negatywowym. Jednak siatki przygotowane tą metodą nie nadają się do krio-EM. Warstwę plastiku można usunąć, mocząc siatki w chloroformie przez kilka godzin.

3. Przygotowanie roztworu formatu uranylu (0,75%) do EM z barwieniem negatywowym. Szczegółowy protokół został opisany wcześniej ⁵

1. Odważyć 37,5mg formatu uranylu do małego zlewki;
2. Dodać 5 ml wrzącej wody i mieszać przez 5 minut w ciemności;
3. Dodać 10μl 5M NaOH i kontynuować mieszanie przez 5 minut;
4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (Fisherbrand, 13mm syringe filter, 0.2μm, Nylon non-sterile, numer katalogowy 09-720-5) i przechowywać przefiltrowany roztwór w probówce Falcon 8ml owiniętej folią aluminiową;
   Uwaga. Proszek formatu uranylu można nabyć od Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), numer katalogowy 22451. Roztwór formatu uranylu jest światłoczuły i powinien być przechowywany z dala od bezpośredniego światła, na przykład poprzez owinięcie probówki Falcon folią aluminiową. Świeżo przygotowany roztwór ma jasną żółtą barwę (Rys. 3A). Roztwór barwiący może być przechowywany na blacie od jednego do dwóch tygodni przed wystąpieniem wytrącania. Format uranylu ma odczyn kwasowy z pH ~4. Dodanie NaOH podnosi wartość pH, jednak zbyt szybkie dodanie lub dodanie nadmiaru tej substancji może spowodować wytrącenie barwnika. Poza generowaniem kontrastu, format uranylu utrwala również próbkę białka. Ze względu na bardzo szybkie tempo utrwalania, niskie pH zazwyczaj nie wpływa na ogólne konformacje białek ani na tworzenie kompleksów białkowych ⁷.

4. Protokół przygotowania siatki EM do barwienia negatywnego. Protokół ten został opisany szczegółowo wcześniej ⁵

1. Powlekanie siatki karbonem za pomocą wyładowań żarowych, z wykorzystaniem systemu PELCO easiGlow GlowDischarge (Ted Pella Inc., USA). Zastosowany prąd wynosi 15 mA, a czas wyładowań żarowych dla siatek to 30 sec. Uwaga. Siatki poddane wyładowaniom żarowym należy wykorzystać krótko po zabiegu. Często używamy siatek w czasie krótszym niż 2 godziny po wyładowaniu.
2. Nanieście dwie krople wody destylowanej o objętości 20μl oraz dwie krople roztworu formatu uranylu o objętości 25μl na kawałek parafilmu (Rys. 3B).
3. Przytrzymajcie siatkę po wyładowaniu żarowym za pomocą antykapilarnych pęset z siłą odpychającą, stroną powleczoną karbonem do góry. Uwaga: konieczne jest użycie pęset antykapilarnych. W przeciwnym razie próbka ciekła zostanie odessana z siatek przez siłę kapilarną między ramionami pęsety.
4. Nanieście 2μl próbki białka na siatkę po wyładowaniu żarowym i odczekajcie 30 sec. Uwaga: czas oczekiwania oraz czas trwania wyładowań żarowych wpływają na stężenie białek zaadsorbowanych na siatce. Bardzo rozcieńczone próbki wymagają dłuższego czasu adsorpcji. Jednak przedłużona adsorpcja może zmienić stężenie buforu z powodu parowania wody. Osiągnięcie odpowiedniego rozkładu cząsteczek na siatce wymaga pewnego podejścia metodą prób i błędów.
5. Odsączcie nadmiar próbki za pomocą papieru filtracyjnego.
6. Dotknijcie powierzchnią siatki kropli wody, a następnie odsączcie wodę papierem filtracyjnym. Powtórzcie czynność z drugą kroplą wody.
7. Krótko dotknijcie powierzchnią siatki pierwszej kropli barwnika. Odsączcie roztwór barwnika papierem filtracyjnym.
8. Dotknijcie powierzchnią siatki drugiej kropli barwnika na 20 seconds. Odsączcie roztwór barwnika papierem filtracyjnym.
9. Osuszcie siatkę w próżni. Uwaga: można również pozostawić siatki na blacie lub w dygestorium do wyschnięcia na powietrzu. Zaletą suszenia w próżni jest możliwość natychmiastowej obserwacji siatek w EM. Możliwym artefaktem powstałym w wyniku szybkiego suszenia jest nierównomierne zabarwienie.

5. Transmisyjny mikroskop elektronowy

1. Mikroskop użyty w tej demonstracji to Tecnai T12 (FEI Company) wyposażony w kamerę CCD Gatan 4K x 4K.
2. Przed włożeniem próbki należy krótko sprawdzić wyrównanie mikroskopu; uwaga: jest to konieczne tylko raz na sesję EM. W mikroskopie modelowym można wcześniej zapisać niemal idealne wyrównanie. Załadowanie takiego pliku wyrównania powinno przywrócić ustawienia mikroskopu do stanu niemal idealnego.
3. Załaduj siatkę EM do standardowego uchwytu próbek z pojedynczym pochyleniem.
4. Wsuń uchwyt do CompuStage mikroskopu T12. Poczekaj na zakończenie cyklu pompowania.
5. Wsuń uchwyt do kolumny.
6. Ustaw ostrość próbki i wybierz pożądany defokus, zazwyczaj -1.5um. Uwaga: ustawienie ostrości można przeprowadzić ręcznie metodą minimalnego kontrastu lub za pomocą kamery CCD poprzez rejestrację obrazów na żywo i obliczanie widma mocy Fouriera w czasie rzeczywistym.
7. Zarejestruj obraz za pomocą kamery CCD;
8. Na obrazach próbek białek barwionych negatywnie białka są często widoczne jako biały kontrast, tzn. biała gęstość na ciemniejszym tle. Należy zauważyć, że choć stężenia białek w różnych obszarach tej samej siatki są zazwyczaj bardzo zbliżone, można zaobserwować różne poziomy zabarwienia w różnych miejscach tej samej siatki. Czasami obszary mogą mieć nierównomierne zabarwienie, a nawet zabarwienie pozytywne (białko wydaje się ciemne na jasnym tle), podczas gdy inne obszary mają idealne zabarwienie. Często konieczne jest przeszukanie siatki w celu znalezienia odpowiedniego obszaru do obrazowania.

6. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono przykłady typowych, wysokiej jakości obrazów próbek barwionych negatywnie: ferrytyny śledziony konia (Rysunek 4A), fragmentu Fab (Rys. 4B), archeonowego proteasomu 20S (Rys. 4C) oraz nukleosomu (Rys. 4D).

Rycina 1. Przygotowanie siatek pokrytych węglem do EM z barwieniem negatywowym. A) Umieszczanie siatek EM jedna po drugiej w gęstym układzie na powierzchni filmu kolodionowego. B) Położenie kawałka papieru nieco większego niż obszar zajmowany przez siatki. C) Oczekiwanie do całkowitego namoczenia papieru. D) Podniesienie papieru wraz z siatkami w celu wysuszenia na powietrzu.

Rysunek 2. Pokrywanie siatek EM węglem. A) Przygotowanie parownika węglowego: umieszczenie dwóch prętów węglowych w aparaturze do powlekania, przy czym jeden pręt (po lewej) jest zaostrzony na końcu. Drugi pręt (po prawej) ma płaską powierzchnię i styka się z ostrzem pręta znajdującego się po przeciwnej stronie. B) Nanoszenie niewielkiej ilości smaru próżniowego na jedną stronę szkiełka przedmiotowego. Obszar wewnątrz czarnej ramki zawiera smar próżniowy. C) Przygotowanie siatek do powlekania. Szkiełka przedmiotowe służą do utrzymania papieru w pozycji. Groty strzałek wskazują obszary ze smarem próżniowym. D) Po powlekaniu kolor szkiełka pokrytego smarem próżniowym nie zmienia się. Kontrast wskazuje grubość naniesionej warstwy węgla.

Rysunek 3. Ilustracja procedury barwienia negatywowego. A) Świeżo przygotowany (po lewej) roztwór formatu uranylu jest przezroczysty i nie wykazuje obecności osadów. Po 1~2 tygodniach na dnie probówki zaczynają gromadzić się osady. B) Nanieść dwie krople (~25μl) wody destylowanej i dwie krople roztworu formatu uranylu na kawałek parafilmu. Za pomocą pęsety antykapilarnej należy chwycić siatkę EM powlekaną węglem po wyładowaniu żarowym, stroną węglową do góry. Na siatkę nanosi się kroplę próbki (~2μl). C) Po odczekaniu 30 sekund należy odsączyć nadmiar roztworu papierem filtracyjnym. D) Obrócić siatkę tak, aby strona z próbką dotknęła pierwszej kropli wody. Powtórzyć kroki C i D, aby zakończyć proces barwienia.

Rycina 4. Przykłady obrazów EM próbek białek barwionych negatywnie. A) Ferrytyna zmielonej śledziony konia, B) fragment wiążący antygen (Fab), C) archeonalny proteasom 20S oraz D) nukleosom. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy tym samym powiększeniu. Pasek skali wynosi 20nm.

Dyskusja

Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym (EM) jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do badania struktur 3D oczyszczonych próbek białek, na przykład przy użyciu metody losowego nachylenia stożkowego (random conical tilt) ⁸, która wymaga zebrania pary obrazów – jednego z preparatu nachylonego pod kątem 60° i jednego z tego samego obszaru, ale bez nachylenia – w celu obliczenia rekonstrukcji 3D kompleksów makromolekularnych. Ponadto EM z barwieniem negatywowym może mieć wiele innych zastosowań, takich jak przesiewanie dwuwymiarowych (2D) kryształów białek błonowych ⁹, wizualizacja kompleksów białkowych w różnych konformacjach ¹⁰ lub po prostu wizualizacja homogeniczności i/lub heterogeniczności oczyszczonych próbek białek, co pozwala na uzyskanie informacji zwrotnych w celu udoskonalenia procedur oczyszczania białek itp. Może to być niezwykle użyteczna metoda dla biochemików. W niniejszym artykule przedstawiliśmy protokoły obejmujące etapy od przygotowania siatek pokrytych węglem po pozyskiwanie obrazów próbek białek barwionych negatywowo w mikroskopie elektronowym. Jak tutaj pokazano, procedura jest dość prosta i łatwa do przeprowadzenia. W przypadku próby obliczenia rekonstrukcji 3D obserwowanej próbki metodą losowego nachylenia stożkowego konieczne jest wykonanie par obrazów z nachyleniem. Jeżeli jednak celem jest analiza pojedynczych cząsteczek (single particle analysis), wystarczy wiele obrazów bez nachylenia. W obu przypadkach wymagane jest dalsze przetwarzanie obrazów, co wykracza poza zakres niniejszego artykułu wideo.

Jak w przypadku każdej metody, protokoły mogą ulegać modyfikacjom. Formian uranylu bardzo dobrze sprawdza się jako odczynnik do barwienia negatywowego w większości przypadków. Octan uranylu to kolejny powszechnie stosowany odczynnik do barwienia negatywowego. Działa on bardzo podobnie do formianu uranylu, lecz charakteryzuje się większym rozmiarem ziarna i w wielu przypadkach niższym kontrastem niż formian uranylu. Zaletą stosowania octanu uranylu jest to, że roztwór ten zachowuje stabilność dłużej niż formian uranylu, dzięki czemu nie ma konieczności przygotowywania świeżego roztworu co jeden lub dwa tygodnie. Zarówno formian, jak i octan uranylu mają odczyn kwasowy. Naturalną obawą jest fakt, że niskie pH może wywołać zmiany w badanej próbce białka. Oba roztwory barwiące pełnią również funkcję utrwalaczy białek. Wcześniejsze badanie wykazało, że oba szybko utrwalają próbki białek ⁷. Szybkie utrwalanie sprawia, że niskie pH ma mniejsze znaczenie. W procesie barwienia próbka białka zostaje utrwalona, zanim niskie pH zdąży wywołać jakiekolwiek zmiany. Niemniej jednak inne odczynniki do barwienia negatywowego, takie jak molibdan amonu i kwas fosfowolframowy, mogą przynieść lepsze wyniki w barwieniu próbek, gdy niskie pH jest problematyczne ⁷. Zarówno molibdan amonu, jak i kwas fosfowolframowy mają pH zbliżone do obojętnego, lecz kontrast próbek białek uzyskany przy użyciu tych barwników jest zazwyczaj gorszy niż w przypadku formianu uranylu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolodium	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml, 2% w octanie amylu
Siatki miedziane Gilder Cu	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200 mesh
Naparowarka węglowa z wysoką próżnią Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella, Inc.	9260
Dwustronnie zaostrzone pręty węglowe	Ted Pella, Inc.	58
Formian uranylu	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	czystość 99.9%
System wyładowań GlowDischarge PELCO easiGlow	Ted Pella, Inc.	91000	Kupić w lokalnej aptece
Papier filtracyjny Whatman #1	Fisher Scientific	09-805E