Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą barwienia ujemnego EM: od przygotowania siatki do akwizycji obrazu

Summary

Wizualizacja próbek białek za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest przydatny do ilościowej analizy strukturalnej, takiej jak obliczanie rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, a także do jakościowego badania jakości preparatów białkowych. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą łatwo postępować zgodnie z tymi protokołami i wykorzystywać ujemne barwienie EM jako rutynowy test, oprócz innych testów biochemicznych, do oceny próbek białek.

Abstract

Mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek (EM), zarówno negatywnie barwionych, jak i mrożonych uwodnionych próbek biologicznych, stała się wszechstronnym narzędziem w biologii strukturalnej ¹. W ostatnich latach metoda ta odniosła duży sukces w badaniu struktur białek i kompleksów makromolekularnych ^{2, 3}. W porównaniu z kriomikroskopią elektronową (cryoEM), w której zamrożone uwodnione próbki białek są osadzone w cienkiej warstwie lodu szklistego ⁴, barwienie ujemne jest prostszą metodą przygotowania próbki, w której próbki białek są osadzane w cienkiej warstwie wysuszonej soli metali ciężkich w celu zwiększenia kontrastu próbki ⁵. Zwiększony kontrast negatywnego barwienia EM pozwala na badanie stosunkowo małych próbek biologicznych. Oprócz wyznaczania trójwymiarowej (3D) struktury oczyszczonych białek lub kompleksów ^białkowych6, metoda ta może być stosowana do znacznie szerszych celów. Na przykład barwienie ujemne EM może być łatwo wykorzystane do wizualizacji oczyszczonych próbek białek, uzyskania informacji, takich jak jednorodność/heterogeniczność próbki, tworzenie kompleksów białkowych lub dużych zespołów, lub po prostu do oceny jakości preparatu białkowego.

W tym artykule wideo prezentujemy kompletny protokół użycia EM do obserwacji negatywnie zabarwionej próbki białka, od przygotowania siatek pokrytych węglem do negatywnego barwienia EM do pozyskiwania obrazów ujemnie zabarwionej próbki w mikroskopie elektronowym działającym przy napięciu przyspieszającym 120kV. Protokoły te są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i mogą być łatwo przestrzegane przez początkujących użytkowników.

Protocol

1. Przygotowanie siatek EM do powlekania węglowego

1. Napełnij dużą szklaną zlewkę wodą destylowaną.
2. Użyj szklanej pipety, aby upuścić pojedynczą kroplę kolodionu (~20 μl, 2% w octanie amylu, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) na powierzchnię wody. Kolodion rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę tworzywa sztucznego na powierzchni wody/powietrza; Uwaga: Pierwsza kropla kolodionu może być użyta do oczyszczenia powierzchni wody z wszelkich cząstek kurzu. Po usunięciu folii z pierwszej kropli powierzchnia wody jest wolna od kurzu.
3. Umieść siatki EM, siatki Gilder Cu o oczkach 400 lub 200 zakupionych od Ted Pella Inc. (USA), jeden po drugim na warstwie tworzywa sztucznego unoszącej się na powierzchni wody; Zwykle umieszczamy 50 ~ 100 siatek w ścisłym upakowaniu, z błyszczącą stroną siatki skierowaną w dół do warstwy tworzywa sztucznego (rys. 1A). Uwaga: Siatki o oczkach 400 są dobre do rutynowych siatek EM o ujemnych plamach; podczas gdy siatki 200 są dobre do zbierania obrazów z parą pochylenia.
4. Wytnij kawałek papieru o wymiarach nieco większych niż obszar, w którym siatki są umieszczone na warstwie tworzywa sztucznego. Ostrożnie umieść papier na siatce (rys. 1B) i poczekaj, aż papier całkowicie się zamoczy (rys. 1C). Uwaga: Różne rodzaje papieru mają różne współczynniki absorpcji wody. Ważne jest, aby papier nie wchłaniał wody zbyt szybko. Na przykład zwykła bibuła filtracyjna nie nadaje się do tego celu, ponieważ zbyt szybko wchłania wodę i powoduje wiele zmarszczek. Folia węglowa wykonana z pomarszczonego papieru nie jest płaska, a zatem nie nadaje się do zbierania obrazów par pochyleń w celu losowej stożkowej rekonstrukcji 3D. Aby znaleźć odpowiedni, trzeba przetestować różne papiery. W naszym laboratorium korzystaliśmy z papierów z notesów kupionych w osiedlowym sklepie spożywczym. Czasami okazywało się, że odpowiedni jest również papier gazetowy. Inną opcją jest użycie stosunkowo grubego papieru ryżowego używanego do kaligrafii chińskiej/japońskiej.
5. Szybko wykonaj nacięcia na plastikowej folii wokół i w pobliżu nasączonego papieru. Zaraz potem użyj kleszczy, aby podnieść papier z kratkami umieszczonymi między folią a papierem. Umieść papier na szalce Petriego kratkami skierowanymi do góry w celu wyschnięcia na powietrzu (rys. 1D); Uwaga: Ważne jest, aby papier wyschł na powietrzu. Zbyt szybkie schnięcie generuje wiele zagnieceń na papierze.

2. Siatki z powłoką węglową

1. Maszyna do powlekania węglem używana w naszym laboratorium to Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Nasz system wyposażony jest w monitor grubości filmu Cressington, który mierzy grubość powlekanej folii węglowej w oparciu o zasadę, że częstotliwość oscylacji kryształu kwarcu zmienia się pod wpływem masy osadzonej warstwy na jego powierzchni. Opisany tutaj protokół nie wymaga jednak monitora grubości, ponieważ często nie jest on dostępny w każdym laboratorium.
2. Naostrz pręt węglowy za pomocą ostrzałki (Ted Pella) i załaduj pręty węglowe do maszyny do powlekania węglem (rys. 2A). Dwa pręty, jeden z ostrą końcówką, a drugi z płaskim końcem, są umieszczone obok siebie.
3. Nałożenie smaru próżniowego na połowę oszronionej powierzchni szkiełka i umieszczenie go obok kratek (rys. 2B). Tylko połowa matowej powierzchni szkiełka powinna być pokryta smarem próżniowym. Uwaga: Obszar ze smarem próżniowym nie zmieni koloru po pokryciu węglowym. Kontrast między sąsiednimi obszarami ze smarem próżniowym i bez niego pozwala oszacować grubość pokrytego węgla.
4. Umieść papier z kratkami na stoliku maszyny do powlekania węglowego. Umieść szkiełko obok kratek (rys. 2C). Uwaga: Można również najpierw przenieść siatki pokryte folią z tworzywa sztucznego na szkiełko przed powlekaniem, w przypadku gdy wiele siatek odpadnie z papieru.
5. Przepompuj komorę próżniową i poczekaj, aż próżnia osiągnie poziom ^10-5 Torr. Uwaga: powlekanie niższą próżnią często generuje wiele iskier, co skutkuje wieloma dużymi cząstkami węgla na siatce.
6. Zwiększaj prąd bardzo powoli. Ostra końcówka pręta węglowego najpierw zmieni kolor na czerwony, a następnie biały wraz ze wzrostem prądu. Nie patrz na końcówkę o wysokiej jasności bezpośrednio gołym okiem. Przestań zwiększać prąd, gdy rozpocznie się powlekanie. Szkiełko zmieni kolor z białego na jasnoszary, a następnie ciemnoszary. Ciemność szkiełek koreluje z grubością powlekanej folii węglowej. Wyłącz prąd, aby zatrzymać powlekanie po osiągnięciu żądanej grubości (rys. 2D). Uwaga: 1) Po wielokrotnych procesach powlekania węglowego, powlekany węgiel z wnętrza szklanego słoika może przyciemnić jego kolor. To sprawia, że powlekana folia węglowa wydaje się grubsza niż jest w rzeczywistości. 2) Jeden zaostrzony pręt węglowy może być użyty do kilku powłok. Ostrość końcówki jest stopniowo zmniejszana po każdej warstwie. Na maksymalny prąd ma wpływ ostrość pręta węglowego. Świeżo naostrzony pręt o mniejszej średnicy wymaga stosunkowo mniejszego prądu do odparowania węgla. Późniejsze powlekanie może wymagać nieco większego prądu.
7. Odpowietrz komorę próżniową i usuń powlekane kratki do późniejszego użycia.
   Uwaga 1. Dokładniejszą metodą kontrolowania grubości węgla jest użycie monitora grubości folii. Można też jakościowo skalibrować kolor w stosunku do dokładnej grubości zmierzonej przez monitor. Użyteczna grubość węgla dla tej techniki wynosi od 3 do 7 nm.

To jest prosta i łatwa metoda przygotowania dużej ilości siatek pokrytych węglem, zwykle ~100 siatek na przygotowanie. Siatki zawierają cienką warstwę tworzywa sztucznego, która zwykle nie wpływa na jakość negatywnie zabarwionego obrazu. Jednak siatki przygotowane w tej metodzie nie nadają się do krioEM. Tę warstwę plastiku można usunąć, mocząc kratki w chloroformie przez kilka godzin.

3. Przygotowanie roztworu mrówczanu uranylu (0,75%) do negatywnego zabarwienia EM. Szczegółowy protokół został opisany wcześniej ⁵

1. Odważyć 37,5 mg mrówczanu uranylu do małej zlewki;
2. Dodaj 5 ml wrzącej wody i mieszaj przez 5 minut w ciemności;
3. Dodaj 10 μl 5M NaOH, kontynuuj mieszanie przez 5 minut;
4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (Fisherbrand, filtr strzykawkowy 13 mm, 0,2 μm, nylon niesterylny, numer katalogowy 09-720-5) i przechowywać przefiltrowany roztwór w 8 ml probówce Falcon pokrytej folią aluminiową;
   nuta. Proszek mrówczanu uranylu można kupić w Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), numer katalogowy 22451. Roztwór mrówczanu uranylu jest wrażliwy na światło i należy go trzymać z dala od bezpośredniego światła, na przykład przykrywając probówkę Falcon folią aluminiową. Świeżo przygotowany roztwór ma jasnożółty kolor (ryc. 3A). Roztwór plamy można przechowywać na stole przez jeden do dwóch tygodni, zanim zacznie się wytrącać. Mrówczan uranylu jest kwaśny o pH ~4. Dodanie NaOH zwiększa pH, ale dodanie go zbyt szybko lub w nadmiarze może spowodować wytrącanie się plamy. Oprócz generowania kontrastu, mrówczan uranylu utrwala również próbkę białka. Ponieważ szybkość wiązania jest tak szybka, niskie pH zwykle nie wpływa na ogólną konformację białka ani tworzenie kompleksów białkowych ⁷.

4. Protokół przygotowania siatki EM do barwienia ujemnego. Protokół ten został szczegółowo opisany wcześniej ⁵

1. Siatka z powłoką węglową z wyładowaniem jarzeniowym, wykorzystująca system PELCO easiGlow GlowDischarge (Ted Pella Inc., USA). Używany prąd wynosi 15 mA, a siatki są rozładowywane jarzeniowo przez 30 sekund. Uwaga. Kratki rozładowujące jarzenie powinny być używane wkrótce po rozładowaniu żarzenia. Często używamy kratek w czasie krótszym niż 2 godziny po wyładowaniu jarzeniowym.
2. Umieść dwie krople wody destylowanej o pojemności 20 μl i dwie krople roztworu mrówczanu uranylu o pojemności 25 μl na kawałku parafilmu (ryc. 3B).
3. Przytrzymaj rozżarzoną siatkę za pomocą kleszczyków antykapilarnych o odwrotnej sile, stroną pokrytą węglem skierowaną do góry. Uwaga: Konieczne jest użycie kleszczy antykapilarnych. W przeciwnym razie próbka cieczy zostanie zassana z siatek przez siłę kapilarną między kleszczami.
4. Nałóż 2 μl próbki białka na siatkę jarzeniową i odczekaj 30 sekund. Uwaga: Czas oczekiwania i długość wyładowania jarzeniowego wpływają na stężenie białek zaadsorbowanych w siatce. Bardzo rozcieńczone próbki wymagają dłuższych czasów adsorpcji. Jednak długotrwała adsorpcja może zmienić stężenie buforu, ponieważ para wodna. Osiągnięcie prawidłowego rozkładu cząstek w siatce wymaga nieco metody prób i błędów.
5. Zetrzyj próbkę za pomocą bibuły filtracyjnej.
6. Dotknij powierzchni siatki do kropli wody, a następnie zetrzyj wodę bibułą filtracyjną. Powtórz z 2. kroplą wody.
7. Dotknij krótko powierzchni siatki do pierwszej kropli plamy. Zetrzyj roztwór plamy bibułą filtracyjną.
8. Dotykaj powierzchni siatki do drugiej kropli plamy przez 20 sekund. Zetrzyj roztwór plamy bibułą filtracyjną.
9. Wysuszyć siatkę za pomocą próżni. Uwaga: kratki można również pozostawić na ławce lub w okapie chemicznym do wyschnięcia na powietrzu. Zaletą suszenia próżniowego jest to, że można natychmiast obserwować siatki w EM. Możliwym artefaktem generowanym przez szybkie schnięcie jest nierówna plama.

5. Transmisyjny mikroskop elektronowy

1. Mikroskop użyty w tej demonstracji to Tecnai T12 (firma FEI) wyposażony w kamerę CCD Gatan 4K x 4K.
2. Krótko sprawdzić ustawienie mikroskopu przed włożeniem próbki; Uwaga: Jest to potrzebne tylko raz na sesję EM. W mikroskopie modelowym można wcześniej zapisać prawie idealne wyrównanie. Załadowanie takiego pliku do wyrównania powinno przywrócić wyrównanie mikroskopu do stanu zbliżonego do idealnego.
3. Załaduj siatkę EM do standardowego uchwytu na próbki z pojedynczym przechyleniem.
4. Włóż uchwyt do CompuStage T12. Poczekaj na zakończenie cyklu pompowania.
5. Włóż uchwyt do kolumny.
6. Ustaw ostrość próbki i ustaw żądane rozmycie, zwykle -1.5um. Uwaga: Ustawianie ostrości można uzyskać poprzez ręczne ustawianie ostrości przy użyciu metody minimalnego kontrastu lub za pomocą kamery CCD do przechwytywania obrazów na żywo i obliczania na żywo widma mocy Fouriera.
7. Nagrywanie obrazu za pomocą kamery CCD;
8. Na obrazach ujemnie wybarwionych próbek białek białka są często widoczne z białym kontrastem, tj. białą gęstością na ciemniejszym tle. Należy zauważyć, że chociaż stężenia białek w różnych obszarach tej samej siatki są zwykle dość podobne, obserwuje się różne poziomy barwienia w różnych obszarach tej samej siatki. Czasami obszary mogą mieć nierównomierne zabarwienie lub nawet pozytywne zabarwienie (białko wydaje się ciemne na jasnym tle), podczas gdy inne obszary mają idealne zabarwienie. Często konieczne jest przeszukanie siatki, aby zlokalizować dobry obszar do obrazowania.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady typowych dobrych obrazów próbek barwionych negatywnie, ferrytyna śledziony konia (Rysunek 4A), Fab (Ryc. 4B), archeonowy proteasom 20S (Ryc. 4C) i nukleosom (Ryc. 4D), są pokazane.

Rysunek 1. Przygotowanie siatek powlekanych węglem do barwienia ujemnego EM. A) Umieszczanie siatek EM pojedynczo w zamkniętym układzie pakowania na powierzchni folii kolodionowej. B) Umieszczenie kartki papieru nieco większej niż powierzchnia kratek. C) Poczekaj, aż papier całkowicie się zamocz. D) Podnieś papier wraz z kratkami do wyschnięcia na powietrzu.

Rysunek 2. Powlekanie siatek EM węglem. A) Ustaw parownik węglowy: umieść dwa pręty węglowe w aparacie do powlekania, przy czym jeden pręt (po lewej) jest zaostrzony do końcówki punktowej. Drugi pręt (po prawej) ma płaską powierzchnię i styka się z końcówką końcówki tego po przeciwnej stronie. B) Umieść niewielką ilość smaru próżniowego po jednej stronie szkiełka podstawowego. Obszar w czarnej ramce pokryty jest smarem próżniowym. C) Ustaw siatki do powlekania. Szkiełka podstawowe służą do utrzymywania papieru na miejscu. Grot strzałki wskazuje obszar ze smarem próżniowym. D) Po pokryciu kolor szkiełka pokrytego smarem próżniowym nie zmienia koloru. Kontrast wskazuje na grubość powlekanego węgla.

Rysunek 3. Ilustrowanie procedury barwienia negatywnego. A) Świeżo przygotowany (po lewej) roztwór mrówczanu uranylu jest przezroczysty bez śladu wytrącania się. Po 1 ~ 2 tygodniach osady zaczynają gromadzić się na dnie dna rury. B) Umieść dwie krople (~25 μl) wody destylowanej i dwie krople roztworu mrówczanu uranylu w kawałku parafilmu. Użyj pary kleszczyków antykapilarnych, aby przytrzymać rozżarzoną, pokrytą węglem siatkę EM z włókna węglowego stroną do góry. Kroplę próbki (~2μl) umieszcza się w siatce. C) Po odczekaniu 30 sekund osusz roztwór bibułą filtracyjną. D) Odwróć siatkę, aby dotknąć strony próbki siatki z pierwszą kroplą wody. Powtórz kroki C i D, aby zakończyć proces barwienia.

Rysunek 4. Przykłady obrazów EM ujemnie barwionych próbek białek. A) ferrytyna śledziony konia, B) fragment wiązania antygenu (Fab), C) proteasom archeonów 20S i D) nukleosom. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane w tym samym powiększeniu. Pasek skali wynosi 20 nm.

Discussion

Barwienie ujemne EM jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do badania struktur 3D oczyszczonych próbek białek, na przykład przy użyciu metody losowego stożkowego ^{nachylenia 8} , która wymaga zebrania pary obrazów, z których jeden pochodzi z próbki nachylonej pod kątem 60° i jeden z tego samego obszaru, ale niepochylonej, w celu obliczenia rekonstrukcji 3D kompleksów makromolekularnych. Ponadto barwienie ujemne EM może mieć wiele innych zastosowań, takich jak badania przesiewowe dwuwymiarowych (2D) kryształów białek błonowych ⁹, wizualizacja kompleksów białkowych w różnych konformacjach ¹⁰ lub po prostu wizualizacja jednorodności i / lub niejednorodności próbki oczyszczonych białek, dostarczając w ten sposób informacji zwrotnych w celu poprawy procedur oczyszczania białek itp. Może to być potężny test dla biochemików. W tym artykule przedstawiliśmy protokoły począwszy od przygotowania siatek pokrytych węglem, a skończywszy na zbieraniu obrazów ujemnie barwionych próbek białek w mikroskopie elektronowym. Jak pokazano tutaj, procedura jest dość prosta i łatwa do wykonania. W przypadku próby obliczenia rekonstrukcji 3D próbki obserwowanej metodą losowego nachylenia stożkowego, konieczne jest uzyskanie obrazów parami pochylenia. Jeśli jednak celem jest przeprowadzenie analizy pojedynczych cząstek, wystarczy wiele niepochylonych obrazów. W obu przypadkach wymagane jest dalsze przetwarzanie obrazu, co wykracza poza zakres tego artykułu wideo.

Jak w przypadku każdej metody, istnieją różnice w protokołach. Mrówczan uranylu w większości przypadków bardzo dobrze sprawdza się jako odczynnik do barwienia ujemnego. Octan uranylu jest kolejnym powszechnie stosowanym odczynnikiem do barwienia ujemnego. Działa bardzo podobnie do mrówczanu uranylu, ale ma większy rozmiar ziarna i, w wielu przypadkach, niższy kontrast niż mrówczan uranylu. Zaletą stosowania octanu uranylu jest to, że roztwór utrzymuje się dłużej niż mrówczan uranylu. Nie trzeba przygotowywać świeżego roztworu co tydzień lub dwa. Zarówno mrówczan uranylu, jak i octan są kwaśne. Oczywistą obawą jest to, że niskie pH może wywołać zmiany w badanej próbce białka. Oba roztwory barwników działają również jako utrwalacze białek. Wcześniejsze badanie wykazało, że oba szybko wiążą próbki białek ⁷. To szybkie utrwalenie sprawia, że niskie pH ma mniejsze znaczenie. Podczas procesu barwienia próbka białka zostaje utrwalona, zanim niskie pH zdąży wywołać jakiekolwiek zmiany. Niemniej jednak inne odczynniki do barwienia ujemnego, takie jak molibdenian amonu i kwas fosfowolframowy, mogą dawać lepsze wyniki barwienia próbek, gdy problemem jest niskie pH ⁷. Zarówno molibdenian amonu, jak i kwas fosfowolframowy mają w przybliżeniu neutralne pH, ale kontrast próbek białek generowanych przez te barwienia jest zwykle gorszy niż mrówczan uranylu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolodionowa	mikroskopia elektronowa Sciences	12620-30	30 ml, 2% w siatkach Gilder Cu z octanu amylu
	Ted Pella, Inc.	Siatka G400/G200	400/200
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon	Coater Ted Pella, Inc.	9260
Podwójnie spiczasty pręt węglowy	Ted Pella, Inc.	58
Nauka o mrówczanie uranylu	Mikroskopia elektronowa	16984-59-1	Czystość 99,9%
PELCO easiGlow GlowSystem wyładowczy	Ted Pella, Inc.	91000	Kup w lokalnej aptece
Whatman #1 Bibuła filtracyjna	Fisher Scientific	09-805E