Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Podsumowanie

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono >95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Streszczenie

Jednostronny model choroby Parkinsona (PD) u szczurów, indukowany za pomocą 6-hydroksydopaminy (6-OHDA), okazał się nieoceniony w pogłębianiu wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw objawów parkinsonowskich, ponieważ odtwarza on zmiany w obwodach i farmakologii jąder podstawy obserwowane u pacjentów z tą chorobą^1-4. Jednakże precyzyjne zmiany komórkowe i molekularne zachodzące w synapsach korowo-prążkowiowych szlaków wyjściowych w obrębie prążkowia, będącego głównym regionem wejściowym jąder podstawy, pozostają nieznane, a uważa się, że jest to miejsce, w którym powstają patologiczne nieprawidłowości wywołujące objawy parkinsonowskie^3,5.

W chorobie Parkinsona (PD) zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zmian w obwodach jąder podstawy po degeneracji drogi nigrostriatalnej zostało znacznie usprawnione dzięki opracowaniu myszy z bakteryjnym sztucznym chromosomem (BAC), wykazujących nadekspresję białek zielonej fluorescencji sterowanych przez promotory specyficzne dla dwóch dróg wyjściowych prążkowia (droga bezpośrednia: eGFP-D1; droga pośrednia: eGFP-D2 oraz eGFP-A2a)⁸, co umożliwiło ich badanie w izolacji. Na przykład niedawne badania zasugerowały występowanie patologicznych zmian w plastyczności synaptycznej u myszy z parkinsonizmem^9,10. Badania te wykorzystywały jednak myszy młodzieńcze i ostre modele parkinsonizmu. Nie jest jasne, czy zmiany opisane u dorosłych szczurów ze stabilnymi uszkodzeniami wywołanymi przez 6-OHDA występują również w tych modelach. Inne grupy próbowały stworzyć stabilny, jednostronnie uszkodzony przez 6-OHDA dorosły model myszy z PD poprzez uszkodzenie pęczka przedmózgowego (MFB); niestety w tym badaniu wskaźnik śmiertelności był niezwykle wysoki, a jedynie 14% zwierząt przeżyło operację przez 21 dni lub dłużej¹¹. W nowszych badaniach wywołano uszkodzenia w obrębie istoty czarnej przy niskim wskaźniku śmiertelności i utracie neuronów dopaminergicznych >80%, jednak ekspresja dyskinez indukowanych przez L-DOPA^11,12,13,14 była w tych badaniach zmienna. Innym dobrze ugruntowanym modelem mysim PD jest mysz z uszkodzeniem wywołanym przez MPTP¹⁵. Chociaż model ten okazał się użyteczny w ocenie potencjalnych czynników neuroprotekcyjnych¹⁶, jest on mniej odpowiedni do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw objawów PD, ponieważ model ten często nie wywołuje deficytów motorycznych i wykazuje dużą zmienność w zakresie uszkodzenia^{17, 18}.

Opracowaliśmy stabilny jednostronny model myszy z PD z uszkodzeniem indukowanym 6-OHDA poprzez bezpośrednią administrację 6-OHDA do MFB, co konsekwentnie powoduje utratę >95% dopaminy w prążkowiu (mierzonej za pomocą HPLC), a także wywołuje zaburzenia behawioralne obserwowane w dobrze scharakteryzowanym jednostronnym szczurzym modelu PD z uszkodzeniem indukowanym 6-OHDA. Ten nowo opracowany mysi model PD okaże się cennym narzędziem w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw powstawania objawów parkinsonowskich.

Protokół

1. Zakwaterowanie i przygotowanie myszy

1. Utrzymuj kolonię myszy transgenicznych z napędem bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC)⁸ (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB) w 12:12 h cyklu światło-ciemność z wolnym dostępem do pokarmu i wody. Myszy te są czystymi myszami FVB i nie ma potrzeby krzyżowania ich z żadną inną linią, ani w celach hodowlanych, ani w celu zapewnienia sukcesu procedury uszkodzenia 6-OHDA.
2. W celu wytworzenia modelu parkinsonowskiego do operacji uszkodzenia 6-OHDA oraz zabiegu pozorowanego (sham) wymagane są dorosłe myszy w wieku od 31. do 42. dnia po urodzeniu (P31-42).
3. Aby zmniejszyć ryzyko infekcji, podawaj Baytril (antybiotyk) w wodzie pitnej przez 24 godziny przed operacją.

2. Przygotowanie leków do zabiegu

Przed wstrzyknięciem 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) gryzoniom zazwyczaj podaje się leki przygotowawcze w postaci desipraminy i pargyliny, aby zwiększyć selektywność i skuteczność tworzenia zmian indukowanych przez 6-OHDA. Inhibitor wychwytu noradrenaliny / 5HT, desipramina, zmniejsza indukowane przez 6-OHDA wyczerpanie zapasów noradrenaliny i 5HT²², podczas gdy inhibitor monoaminooksydazy, pargylina, zwiększa wrażliwość zakończeń dopaminergicznych na 6-OHDA poprzez ograniczanie pozasynaptycznego rozkładu 6-hydroksydopaminy³¹.

1. Leki premedykacyjne (hydrochlorzecynę desipraminy (HCl) i hydrochlorzecynę pargyliny (HCl)) można przygotować w dużych objętościach i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu użycia. Odważ odpowiednią ilość hydrochlorzecyny desipraminy, aby dostarczyć każdej myszy dawkę 25 mg/kg, uwzględniając liczbę zwierząt, które zostaną poddane operacji w danym dniu. Niska masa myszy sprawia, że precyzyjne podawanie małych objętości jest trudne; dlatego należy przygotować hydrochlorzecynę desipraminy o stężeniu 2,5 mg/ml i podawać zwierzęciu w objętości 10 ml/kg. Należy uwzględnić masę komponentu solnego związku, aby osiągnąć prawidłowe stężenie. Korekta masy soli HCl w hydrochlorzecynie desipraminy: masa cząsteczkowa (MW) hydrochlorzecyny desipraminy HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW wolnej zasady: 266,38 Współczynnik korekcyjny: 302,84 / 266,38 = 1,137 Dla 10 ml roztworu: = 2,5 mg/ml desipraminy x 10,0 ml x Współczynnik korekcyjny = 2,5 mg/ml x 10,0 ml x 1,137 = 28,43 mg hydrochlorzecyny desipraminy
2. Odważ odpowiednią ilość hydrochlorzecyny pargyliny, aby dostarczyć każdej myszy dawkę 5 mg/kg dla liczby zwierząt poddawanych operacji w danym dniu. Wykonaj korektę dla komponentu solnego związku zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Niska masa myszy sprawia, że precyzyjne podawanie małych objętości jest trudne; dlatego należy przygotować hydrochlorzecynę pargyliny o stężeniu 0,5 mg/ml i podawać zwierzęciu w objętości 10 ml/kg.
   Korekta masy soli HCl w hydrochlorzecynie pargyliny:
   MW hydrochlorzecyny pargyliny HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
   MW wolnej zasady: 159,23 Współczynnik korekcyjny: 195,69 / 159,23 = 1,229
   Dla 10 ml roztworu odważ:
   = 0,5 mg/ml pargyliny x 10,0 ml x Współczynnik korekcyjny
   = 0,5 mg/ml x 10,0 ml x 1,229
   = 6,15 mg hydrochlorzecyny pargyliny
3. Połącz 28,43 mg hydrochlorzecyny desipraminy i 6,15 mg hydrochlorzecyny pargyliny w szklanym cylindrze miernym o pojemności 10 ml i dodaj 8 ml sterylnej soli fizjologicznej (0,9%). Mieszaj w wortexie i podgrzewaj do 45°C, aż mieszanina zostanie rozpuszczona. pH roztworu będzie teraz wynosić około 3, co po podaniu myszom spowodowałoby dyskomfort i powikłania pooperacyjne dotyczące funkcji dróg moczowych i przewodu pokarmowego. Dodawaj krople NaOH (1M), aż pH osiągnie wartość 7,4. Uzupełnij objętość do 10 ml sterylną solą fizjologiczną (0,9%) i wymieszaj w wortexie. Oznacz etykietą, datą i zamroź w temperaturze ~80°C. Ponieważ hydrochlorzecyna pargyliny nie jest rozpuszczalna w soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej, przez cały okres przeprowadzania zabiegów przechowuj mieszaninę premedykacyjną w kąpieli wodnej podgrzanej do 37°C w sali operacyjnej.
4. Roztwory 6-OHDA muszą być przygotowywane bezpośrednio przed operacjami. Jako rozpuszczalnik dla hydrobromku 6-OHDA (6-OHDA.Br) stosuje się sterylną sól fizjologiczną (0,9%) zawierającą kwas askorbinowy (0,2%). Kwas askorbinowy jest niezbędny do stabilizacji 6-OHDA.Br, ponieważ zapobiega utlenianiu 6-OHDA.Br do formy nieaktywnej. Odważ 0,2 g kwasu askorbinowego, dodaj go do pustego cylindra miernego o pojemności 1 L, uzupełnij do 1 L sterylną solą fizjologiczną (0,9%) i wymieszaj. Oznacz etykietą, datą i przechowuj w temperaturze ~80°C do momentu użycia.
5. Odważ odpowiednią ilość 6-OHDA.HBr, aby przygotować roztwór o stężeniu 15,0 mg/ml, tak aby dostarczyć każdej myszy 3,0 μg. Ponieważ 6-OHDA.Br jest wrażliwy na światło i ciepło, unikaj ekspozycji na światło i przed ważeniem umieść substancję na lodzie.
   Korekta masy soli HBr w 6-OHDA.HBr:
   MW 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW wolnej zasady: 170,19
   Współczynnik korekcyjny: 250,09 / 170,19 = 1,47
   Dla 0,5 ml roztworu odważ:
   = 15,0 mg/ml 6-OHDA x 0,5 ml x Współczynnik korekcyjny
   = 15,0 mg/ml 6-OHDA x 0,5 ml x 1,47
   = 11,03 mg 6-OHDA.HBr
6. Odważ 6-OHDA.HBr do sterylnej probówki o pojemności 1,0 ml owiniętej folią aluminiową i dodaj 0,5 ml rozpuszczalnika (sterylna sól fizjologiczna (0,9%), kwas askorbinowy 0,02% pH 7,4). Mieszaj w wortexie, aż mieszanina zostanie rozpuszczona, opisz i natychmiast umieść na lodzie do czasu użycia. Należy pamiętać, że roztwór 6-OHDA musi zostać zużyty w ciągu około 6 godzin od przygotowania. Jeśli roztwór stanie się ciemnobrązowy bezpośrednio po przygotowaniu lub w trakcie operacji, oznacza to, że 6-OHDA.HBr uległ utlenieniu i nie jest już skuteczną neurotoksyną, w związku z czym musi zostać wylany i przygotowany ponownie.
7. Dla zwierząt poddanych operacji pozorowanej (sham) przygotuj równą objętość rozpuszczalnika (sterylna sól fizjologiczna (0,9%), kwas askorbinowy 0,02% pH 7,4), jaką otrzymają zwierzęta z uszkodzeniami wywołanymi przez 6-OHDA; umieść go w sterylnej probówce 1,0 ml owiniętej folią aluminiową, opisz i natychmiast umieść na lodzie do czasu użycia.

3. Przygotowanie aparatury chirurgicznej

Narzędzia chirurgiczne przed operacją muszą zostać wysterylizowane w autoklawie. Pomiędzy kolejnymi zabiegami narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w 95% etanolu, a następnie poddać działaniu temperatury 250°C przez 2 minuty. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi odpowiednich komisji ds. opieki nad zwierzętami w danej instytucji oraz kraju.

1. Przed przygotowaniem aparatury należy oczyścić wszystkie powierzchnie i sprzęt alkoholem izopropylowym. Podczas pracy z czystym sprzętem chirurgicznym należy stosować sterylne rękawiczki.
2. Przygotować klatkę rekonwalescencyjną dla myszy z ręcznikami papierowymi na dnie. Umieścić ją pod lampą grzewczą lub na podkładce grzewczej.
3. Przygotować wózek do znieczulenia, upewniając się, że dopływ tlenu jest podłączony i otwarty, a zbiornik z izofluranem jest całkowicie pełny. Ustawić przepływ tlenu na 1 L/min, a stężenie izofluranu na 2-4%. Idealnie aparat znieczulający powinien posiadać dwa porty odpływowe, aby dostarczać mieszaninę tlenu i izofluranu odpowiednio do komory indukcyjnej oraz w celu podtrzymania znieczulenia, gdy zwierzę znajduje się w aparacie stereotaktycznym.
4. Prawidłowy montaż aparatury infuzyjnej jest kluczowy dla zapewnienia skutecznego wykonania uszkodzeń, ponieważ pęcherzyki powietrza lub zablokowane igły zmniejszają objętość 6-OHDA wstrzykiwaną w miejscu uszkodzenia. Zmontować aparaturę infuzyjną zgodnie z instrukcją przedstawioną na rysunku 1. Na jeden koniec rurki PEEK nałożyć metalową nakrętkę RN (zestaw kompresyjny RN (złączka 1/16^th cala)), następnie pierścień zaciskowy PEEK w kształcie kielicha, a potem standardowy pierścień zaciskowy PFA. Ustawić pierścienie tak, aby stożek standardowego pierścienia PFA wsunął się w dopasowaną część pierścienia PEEK. Włożyć całość do podwójnej złączki RN z małym gniazdem (#1), upewniając się, że połączenie jest szczelne. W drugi koniec podwójnej złączki RN z małym gniazdem włożyć igłę wstrzykującą o rozmiarze 33G. Przeciągnąć igłę przez jedną z metalowych nakrętek RN i dokręcić. Upewnić się, że igła 33G tworzy kąt 180° względem podwójnej złączki RN z małym gniazdem (#1). Na drugim końcu rurki PEEK nałożyć metalową nakrętkę RN, następnie pierścień PEEK, a potem pierścień PFA. Zespół nakrętki i pierścienia włożyć do drugiej podwójnej złączki RN z małym gniazdem i dokręcić połączenie. W drugi koniec drugiej podwójnej złączki RN z małym gniazdem (#2) włożyć adapter Luer do małego gniazda RN (adapter Luer) i dokręcić połączenie.
5. Następnie należy odpowietrzyć aparaturę infuzyjną (patrz Rysunek 1). Napełnić strzykawki Hamiltona o objętości 250 μl i 1,0 μl sterylną wodą, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Podłączyć strzykawkę 250 μl do adaptera Luer i nacisnąć tłok strzykawki 250 μl tak, aby woda wypłynęła przez igłę wstrzykującą 33G na drugim końcu rurki. Kontynuować przepychanie wody przez system, jednocześnie wyciągając strzykawkę 250 μl z adaptera Luer, pozostawiając małą kroplę wody na końcu adaptera. Nacisnąć tłok strzykawki 1,0 μl, aż zostanie wypchnięta mała kropla wody. Ostrożnie wsunąć strzykawkę 1,0 μl do adaptera Luer, dbając o to, aby kropla wody na strzykawce 1,0 μl połączyła się z kroplą wody znajdującą się na adapterze Luer, a następnie całkowicie wsunąć strzykawkę 1,0 μl do adaptera. Upewnić się, że w podwójnej złączce RN z małym gniazdem nie ma pęcherzyków powietrza.
6. Po odpowietrzeniu systemu można przymocować aparaturę perfuzyjną do aparatu stereotaktycznego i pompy infuzyjnej. Przymocować podwójną złączkę RN z małym gniazdem z zamocowaną igłą 33G do ramienia manipulatora aparatu stereotaktycznego, a następnie przymocować strzykawkę 1,0 μl do pompy perfuzyjnej w taki sposób, aby po uruchomieniu pompy strzykawka była docisnięta do zacisku i nie mogła się przesuwać. Zaprogramować pompę infuzyjną na szybkość infuzji 0,1 μl/min.

4. Operacja jednostronnej lekcji 6-OHDA

1. Na trzydzieści minut przed operacjami zważ każde zwierzę i zapisz jego masę. Podaj systemicznie hydrochlororek desipraminy (2,5 mg/ml, Sigma Aldrich) i hydrochlororek pargyliny (0,5 mg/ml, Sigma Aldrich) (w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, pH 7,4) w dawce 10 ml/kg poprzez wstrzyknięcie doszprytnowe (i.p.) myszy, używając igły 27g przymocowanej do strzykawki 1 ml. Na przykład mysz o masie 30,0 g otrzyma 300 μl premedykacji. Rozgrzej dysk grzewczy i umieść go pod uchwytami usznymi i siekaczowymi. Dysk grzewczy pomoże utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji oraz zapewni optymalną wysokość dopasowania uchwytów usznych i siekaczowych ramy stereotaktycznej.
2. Piętnaście minut po podaniu roztworu HCl desipraminy i HCl pargyliny umieść mysz w zamkniętej komorze anestezjologicznej i podaj znieczulenie drogą wziewną izofluranem (2-3% w O₂). Zwierzę jest odpowiednio znieczulone, gdy nie wykazuje reakcji na uciśnięcie tylnej łapy i nie posiada odruchu mrugania.
3. Ogól górną część głowy myszy i nanieś miejscowy środek przeciwbólowy lidokainę bezpośrednio na skórę za pomocą waty. Pięć minut po aplikacji lidokainy zdezynfekuj głowę zwierzęcia roztworem betadyny.
4. Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej przystosowanej dla myszy. Najpierw unieruchom zwierzę w uchwytach siekaczowych (ustawienie uchwytu siekaczowego: od -3,0 do +2,0 mm), nakładając maskę anestezjologiczną na pysk zwierzęcia. Ustaw przepływ tlenu na 1 L/min, a stężenie izofluranu na 1,5-2%. Uchwyt siekaczowy powinien znajdować się na takim poziomie względem uchwytów usznych, aby góra czaszki była w poziomie. Wsuń uchwyty uszne (średnica 5,0 mm). Uchwyty uszne zostały włożone prawidłowo, gdy głowa jest całkowicie płaska i nie można jej przesuwać w żadnym kierunku.
5. Nacinaj wzdłuż linii środkowej skóry na szczycie głowy myszy za pomocą ostrza skalpela i odsunie skórę. Osusz powierzchnię czaszki za pomocą gazy.
6. Naciśnij tłok strzykawki 1,0 μl i wprowadź igłę wstrzykującą o rozmiarze 33G do probówki 1 ml owiniętej folią aluminiową, zawierającej roztwór 6-OHDA (15 mg/ml). Powoli wciągnij tłok strzykawki 1,0 μl, utrzymując igłę 33G zanurzoną w roztworze 6-OHDA (15 mg/ml).
7. Wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłuż linii środkowej czaszki. Przesuń końcówkę igły w kierunku Bregma, podaj niewielką ilość roztworu 6-OHDA z igły 33G, aby utworzyła się mała kropelka. Powoli opuszczaj końcówkę igły do Bregma; gdy kropelka dotknie Bregma, przestań przesuwać końcówkę igły i zapisz te współrzędne. Cofnij igłę o 2 mm w kierunku grzbietowym i przesuń się wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku rostralno-kaudalnym w stronę lambda. Podaj niewielką ilość roztworu 6-OHDA z igły 33G, aby utworzyła się mała kropelka. Powoli opuszczaj końcówkę igły do Lambda; gdy kropelka dotknie Lambda, przestań przesuwać końcówkę igły i zapisz te współrzędne. Współrzędne przyśrodkowo-boczne (ML) oraz grzbietowo-brzuszne (DV) powinny być identyczne dla Bregma i Lambda; jeśli tak nie jest, odpowiednio skoryguj uchwyt siekaczowy dla współrzędnych AP oraz uchwyty uszne dla współrzędnych ML. Przesuń igłę na współrzędne AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm względem Bregma, zgodnie z atlasem mózgu myszy w współrzędnych stereotaktycznych²⁵. Cofnij igłę i wykonaj otwór w czaszce za pomocą igły 25G.
8. Wprowadź igłę z powrotem na powyższe współrzędne i wsuń ją do poziomu DV: -5 mm. Wstrzyknij 0,2 μl 6-OHDA lub nośnika jednostronnie do wiązki przedmózgowej z prędkością 0,1 μl/min (łącznie 3 μg). Po zakończeniu podawania 6-OHDA lub nośnika pozostaw igłę w miejscu przez kolejne pięć minut, aby umożliwić dyfuzję poza miejsce wstrzyknięcia.
9. Powoli wycofaj igłę.
10. Zamknij nacięcie skóry głowy za pomocą trzech szwów i podaj podskórnie (s.c.) 1 ml roztworu Ringer'a z mleczanami.
11. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść w klatce regeneracyjnej do czasu odzyskania przytomności.

5. Opieka pooperacyjna nad zwierzętami z uszkodzeniami wywołanymi 6-OHDA

1. Umieścić zwierzęta w klatkach (3 myszy/klatka) i zapewnić im swobodny dostęp do pokarmu oraz wody z cukrem (10 mM). W pojemnikach na pokarm na dnie klatki należy podać Nutra-gel oraz KMR (zamiennik mleka dla kociąt), aby pobudzić apetyt i motorykę przewodu pokarmowego.
2. Przez 2 tygodnie po operacji codziennie kontrolować stan myszy²⁴. Podczas każdej kontroli szczególną uwagę należy zwrócić na czujność zwierzęcia, oceniając jego zdolność do poruszania się po klatce. Należy również obserwować pobór pokarmu i wody z ostatniego okresu obserwacji, a także obecność i konsystencję odchodów. Powszechnym powikłaniem pooperacyjnym jest odwodnienie, objawiające się powolnym powrotem skóry do stanu pierwotnego po uszczypnięciu. W przypadku wystąpienia tego objawu należy podawać 1 ml roztworu Ringera z mleczanami s.c. przez 1 tydzień lub do momentu ustąpienia objawów. W przypadku samców należy uważnie obserwować narządy płciowe pod kątem wypadania prącia, co objawia się jego zaczerwienieniem. Jeśli to nastąpi, należy nałożyć żel mucol na prącie dotkniętego zwierzęcia i podawać 1 ml roztworu Ringera z mleczanami s.c. przez 1 tydzień lub do momentu ustąpienia objawów.
3. Codziennie ważyć zwierzęta, aby monitorować zmiany masy ciała.
4. W przypadku, gdy wstrzyknięcie i.p. spowodowało niewielkie rozdarcia w obrębie przewodu pokarmowego, może dojść do zakażenia jamy brzusznej. Należy zatem ocenić obecność zakażenia w obrębie brzucha, co objawia się jego opuchlizną i wzdęciem. W takim przypadku należy podawać Baytril w wodzie pitnej przez 3-4 dni lub do momentu ustąpienia objawów.

6. Ocena objawów parkinsonowskich

W celu oszacowania zakresu uszkodzenia, ocenę behawioralną przeprowadzono od 14 do 21 dni po operacyjnym wywołaniu uszkodzenia za pomocą 6-OHDA, kiedy poziom deficytu dopaminy jest maksymalny i stabilny²⁶.

1. Po wstrzyknięciu dożylnie (i.p.) 0,01 ml/g 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, umieść myszy w szklanych cylindrach (11 cm x 9,5 cm) i rejestruj ich aktywność za pomocą kamery wideo (CG9, Sanyo).
2. Oglądając nagranie, policz liczbę pełnych obrotów o 360° wykonanych zarówno w kierunku ipsy- jak i kontralateralnym względem miejsca uszkodzenia.
3. Im większa tendencja do obrotów ipsilateralnych, tym bardziej parkinsonowskie jest zwierzę, dlatego oblicz odsetek obrotów ipsilateralnych jako procent całkowitego zachowania rotacyjnego (suma obrotów kontralateralnych i ipsilateralnych).

7. Oznaczanie zawartości dopaminy w prążkowiu metodą HPLC

1. Przynajmniej 21 dni po operacji uszkodzenia 6-OHDA i po zakończeniu badań behawioralnych uśmierć myszy poprzez przedawkowanie anestetyku i ostrożnie wyjmij mózg. Pobierz jeden przekrój prążkowia (230 μm) z każdej półkuli u każdej myszy, natychmiast po sekcjonowaniu zamroź go gwałtownie i przechowuj w temperaturze -80°C do czasu przygotowania próbek prążkowia.
2. Bufor do próbek HPLC (0,1 M PCA z 2 mM glutationem) zapobiega rozpadowi dopaminy wyekstrahowanej z próbek prążkowia.
   Na 100 ml buforu do próbek:
   = 100 ml H₂O klasy HPLC
   = 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
   = 61,5 mg glutationu (zredukowanego)
   Odmierz H₂O klasy HPLC, dodaj PCA, rozpuść glutation w roztworze, dokładnie wymieszaj i przefiltruj. Bufor do próbek można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
3. Rozmroź przekroje prążkowia na lodzie, następnie zhomogenizuj w 200 μl buforu do próbek, używając ultradźwiękowego rozbijacza komórek (Fisher Sonic, USA). Próbki przez cały czas trzymaj na lodzie i homogenizuj każdą próbkę trzy razy po 10 sekund, zapewniając schłodzenie próbek pomiędzy cyklami homogenizacji.
4. Odbierz 20 μl każdej zhomogenizowanej próbki (przechowuj w -80°C) do analizy białka.
5. Odwiruj próbki (20 800 x g, 20 min (4°C, Eppendorf 58- 04R, USA)), następnie usuń supernatant i przefiltruj przez membranę PVDF 0,2 μm (Pall, Kat#: 1935-28143-310) i zamroź w -80°C do czasu analizy HPLC. Zachowaj osad białkowy jako materiał zapasowy do analizy białka.
6. Przygotowanie fazy ruchomej dla HPLC w celu przepływu przez kolumnę HPLC.
   Na 1 L fazy ruchomej:
   60 mM NaH₂PO₄.H₂O (jednowodny wodorofosforan sodu) = 8,27 g
   30 mM kwas cytrynowy = 5,7 g
   0,13 mM dwuwodny dwusód sodowy kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) = 48 mg
   0,16 mM dodecylosiarczan sodu (SDS) = 45 mg
   850 ml wody klasy HPLC (Caledon, Kat#: 8801-7)
   15% v/v acetonitrylu-190 (pH 3,35) = 150 ml klasy HPLC (Caledon, Kat#: 1401-7)
   ~2 μl 10 M NaOH (w H2O klasy HPLC)
   Wszystkie odczynniki powinny mieć czystość ≥99,0% i w miarę możliwości być klasy HPLC. Woda i acetonitryl muszą być klasy HPLC. Fazy ruchomej należy użyć w ciągu jednego tygodnia od przygotowania. Używaj dedykowanego, czystego szkła i mieszadeł magnetycznych wyłącznie do przygotowania fazy ruchomej (szklany cylinder mierniczy 1 L i co najmniej dwie szklane kolby 1 L). Przed przygotowaniem fazy ruchomej przygotuj dwie czyste kolby 1 L, jedną do sporządzenia roztworu i drugą do jego przelania podczas filtracji i odgazowywania. Pozostaw fazę ruchomą w obiegu HPLC na całą noc i przed użyciem sprawdź, czy linia bazowa jest płaska.
7. Odmierz 700 ml wody klasy HPLC do szklanego cylindra mierniczego i rozpuść w niej NaH₂PO₄.H₂O, kwas cytrynowy, EDTA i SDS. Dopełnij wodą do 850 ml.
8. Dostrój pH do 3,35 za pomocą 10 M NaOH, następnie dodaj acetonitryl i wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła powlekanego teflonem.
9. Włóż mieszadło do drugiej czystej, pustej kolby 1 L i przefiltruj fazę ruchomą pod próżnią przez filtr Millipore HVLP 0,22 μm: (Kat#: SLGP033RS). Przed filtracją zwilż filtr w mieszaninie H₂O/ACN w proporcji 85:15. Po pełnym przefiltrowaniu odgazuj fazę ruchomą, mieszając ją pod próżnią przez co najmniej 10 min.
10. Przygotuj standardy, względem których mierzona będzie koncentracja dopaminy w próbkach prążkowia. Standardy są przepuszczane przez HPLC na początku i na końcu każdej serii próbek prążkowia. Roztwór zapasu dopaminy o stężeniu 1 mg/ml można przygotować wcześniej i przechowywać w alikwotach 20 μl w temperaturze -80°C. Aby przygotować roztwór zapasu, rozpuść 5 mg dopaminy w 5 ml buforu do próbek (patrz wyżej) i dokładnie wymieszaj. Rozpocznij przygotowywanie standardów, pobierając 5 μl roztworu zapasu 1 mg/ml, dodając go do 2,5 ml buforu do próbek i dokładnie mieszając, aby uzyskać roztwór dopaminy o stężeniu 2 μg/ml.
11. Przez HPLC przepuszczane są cztery standardy w celu stworzenia krzywej koncentracji. Dla dopaminy koncentracje wynoszą: 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml i 12,5 ng/ml. Aby uzyskać te cztery koncentracje dopaminy, pobierz 10 μl roztworu dopaminy 2 μg/ml przygotowanego w punkcie 7.10) i dodaj do 190 μl buforu do próbek, aby otrzymać roztwór dopaminy o stężeniu 100 ng/ml. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenie 1:1 roztworu dopaminy 100 ng/ml buforem do próbek. Po prostu pobierz 100 μl dopaminy 100 ng/ml, dodaj 100 μl buforu do próbek i wymieszaj, aby uzyskać dopaminę 50 ng/ml, następnie pobierz 100 μl dopaminy 50 ng/ml, dodaj 100 μl buforu do próbek i wymieszaj, aby uzyskać dopaminę 25 ng/ml i tak dalej.
12. Aby przygotować system HPLC (pompa binarna Waters 1525μ, autosampler 717plus, kolumna przeciwprądowa Symmetry C-18 (15 cm x 4,6 mm i.d., wielkość cząstek 5 μm) (30°C), detektor elektrochemiczny (ESA Coulochem III) wyposażony w dwuelektrodową celę analityczną (ESA 5011A) i sterowany oprogramowaniem Breeze (Waters)), najpierw przepłucz system fazą ruchomą, wybierając protokół płukania w oprogramowaniu komputerowym lub postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Pozwala to zastąpić wszystkie poprzednie roztwory w systemie HPLC świeżą fazą ruchomą.
13. Ustaw potencjały elektrochemiczne na odpowiednio 400 mV i -300 mV dla pierwszej i drugiej elektrody. Następnie zrównoważ system, uruchamiając go przez co najmniej 2 godziny, a najlepiej przez noc, z fazą ruchomą przy szybkości przepływu 1 ml/min. Podczas równoważenia cele powinny być włączone, a odczyt linii bazowej monitorowany; gdy odczyt stanie się stabilny, system jest gotowy do użycia. Przez pierwszą godzinę równoważenia pozwól, aby faza ruchoma opuszczająca system trafiała do pojemnika na odpady, po czym możesz pozwolić na recyrkulację fazy ruchomej w systemie HPLC, wkładając wąż wylotowy do kolby z fazą ruchomą.
14. Rozmroź próbki prążkowia na lodzie, a następnie wstrzyknij 20 μl każdego standardu dopaminy, po których wstrzyknij 2 x 20 μl każdej próbki, a następnie kolejne 20 μl każdego standardu dopaminy do zrównoważonego systemu HPLC przy szybkości przepływu fazy ruchomej 1 ml/min.
15. Użyj oprogramowania systemu HPLC do analizy pola powierzchni pików dopaminy uzyskanych ze standardów i próbek. Porównanie pola powierzchni pików dopaminy obecnych w próbkach prążkowia z krzywą koncentracji standardowej dopaminy pozwoli określić ilość dopaminy obecną w 20 μl każdej próbki prążkowia. Przeskaluj tę wartość, aby obliczyć całkowitą ilość dopaminy w całym przekroju prążkowia.
16. Wykonaj standardową analizę białka na 20 μl homogenatu prążkowia odłożonego w punkcie 7.4). Pozwoli to zmierzyć ilość białka obecną w próbkach prążkowia w mg/ml. Na tej podstawie oblicz ilość dopaminy w próbkach prążkowia jako wartość w ng/mg, co umożliwi porównanie stężeń dopaminy między półkulami i między myszami.

8. Reprezentatywne wyniki

Od piętnastu do dwudziestu jeden dni po operacji wywołania uszkodzenia 6-OHDA, gdy proces obumierania komórek wywołany neurotoksyną zostanie zakończony26, pomiar spontanicznych rotacji o 360° po podaniu soli fizjologicznej (i.p.)²⁸ może służyć do oceny skuteczności uszkodzenia 6-OHDA (Rycina 2). Ta metoda oceny behawioralnej jest prosta i szybka oraz pozwala uniknąć potencjalnych efektów torowania wywołanych przez związki dopaminergiczne, takie jak testy z amfetaminą lub apomorfina. Ponadto ocena rotacji spontanicznych jest lepszym wskaźnikiem dla zwierząt z ubytkiem dopaminy <95% w porównaniu z testem ułożenia łap przednich²⁷. Poprzez korelację poziomów dopaminy w prążkowiu z próbek prążkowia (przygotowanych po zakończeniu badań behawioralnych za pomocą HPLC) z procentową liczbą spontanicznych rotacji ipsyversalnych u każdego zwierzęcia, ustalono, że zwierzęta wykazujące 70% lub więcej rotacji ipsyversalnych w stronę uszkodzenia 6-OHDA utraciły >95% dopaminy w prążkowiu (Rycina 3)²⁷. Po częściowych uszkodzeniach pęczka przedniego mózgu wywołanych przez 6-OHDA (59,44±17,20) (Rycina 3), nie stwierdzono preferencji kierunku rotacji między stroną ipsyversalną a kontrawersalną podczas pomiaru rotacji spontanicznych (40,91±8,01) (Rycina 2). Zatem, analogicznie do wyników uzyskanych po podaniu 6-OHDA do MFB u szczurów, możliwe jest wywołanie głębokiej utraty dopaminergicznych neuronów nigro-prążkowiowych, a podanie soli fizjologicznej (i.p.) jest dokładną metodą przesiewową w celu oceny zakresu uszkodzenia 6-OHDA u tych zwierząt.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający montaż zestawu igły do wstrzykiwania w zabiegach tworzenia uszkodzeń indukowanych 6-OHDA.

Rysunek 2. Ocena zachowania rotacyjnego u myszy z grupą pozorowaną i myszy z uszkodzeniem indukowanym 6-OHDA. Spontaniczne rotacje u myszy z grupy pozorowanej i myszy z uszkodzeniem 6-OHDA. Dane przedstawiono jako średni procent rotacji ipsy-wersyjnych ± SEM, gdzie suma rotacji kontrawersyjnych i ipsy-wersyjnych wynosi 100%. Słupki białe: zwierzęta z grupy pozorowanej; słupki szare: zwierzęta z uszkodzeniem 6-OHDA z ubytkiem dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta, które przeszły operację uszkodzenia 6-OHDA i zostały uszkodzone częściowo. *** P<0,001 w porównaniu do zwierząt z grupy pozorowanej. Jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna (grupa pozorowana: n=17; uszkodzenie 6-OHDA (>95%): n=23; częściowe uszkodzenie 6-OHDA: n=3).

Rysunek 3. Ocena poziomów dopaminy w prążkowiu u myszy w grupie kontrolnej (sham) oraz z uszkodzeniami wywołanymi 6-OHDA przy użyciu metody HPLC. Zawartość dopaminy w prążkowiu określono w półkulach operowanych i nieoperowanych u zwierząt z grupy sham oraz zwierząt z uszkodzeniami 6-OHDA. Dane przedstawiono jako średni procent ± SEM poziomów dopaminy w prążkowiu nieoperowanym. Słupki białe: zwierzęta z grupy sham; słupki szare: zwierzęta z uszkodzeniami 6-OHDA z utratą dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta poddane operacji uszkodzenia 6-OHDA z częściowym uszkodzeniem. *** P<0,001, ** P<0,01 w porównaniu do zwierząt z grupy sham. Jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna (grupa sham: n=17, uszkodzenie 6-OHDA (>95%): n=23, częściowe uszkodzenie 6-OHDA: n=3).

Rysunek 4. Ocena immunoreaktywności hydroksylazy tyrozynowej w SNc u myszy w grupie pozorowanej i z uszkodzeniem 6-OHDA. Jako marker utraty komórek dopaminergicznych w istocie czarnej części zwartej (SNc), utratę immunohistochemicznej reaktywności na hydroksylazę tyrozynową (TH) w półkulach operowanych i nieoperowanych zwierząt w grupie pozorowanej oraz z uszkodzeniem 6-OHDA określono zgodnie z opisem w Thiele et al. In Press. Dane przedstawiono jako średni procent ± SEM komórek dodatnich pod kątem TH w nieoperowanym prążkowiu. Słupki białe: zwierzęta w grupie pozorowanej; słupki szare: zwierzęta z uszkodzeniem 6-OHDA z utratą dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta poddane operacji uszkodzenia 6-OHDA z częściowym uszkodzeniem. *** P<0.001, ** P<0.01 w porównaniu do zwierząt w grupie pozorowanej. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z następującym testem porównań wielokrotnych Dunna (grupa pozorowana: n=17, uszkodzenie 6-OHDA (>95%): n=23, częściowe uszkodzenie 6-OHDA: n=3).

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje metodę tworzenia stabilnego, jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z uszkodzeniem wywołanym 6-OHDA, który charakteryzuje się bardzo wysoką powtarzalnością, wysokim współczynnikiem sukcesu uszkodzenia oraz niską śmiertelnością. Sukces operacji uszkodzenia 6-OHDA można łatwo oszacować poprzez pomiar spontanicznych zachowań rotacyjnych, gdzie >70% rotacji ipsyversyjnych wskazuje na >95% ubytku dopaminy w uszkodzonym prążkowiu²⁷. Ilościowe oznaczenie poziomu dopaminy w p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
desypramina HCl	Sigma-Aldrich	D125	25mg/kg
pargilina HCl	Sigma-Aldrich	P8013	5mg/kg
6-OHDA HBr	Sigma-Aldrich	H116	3mg / mysz
aparat stereotaktyczny	Kopf Instruments	Model 900
uchwyty uszne dla myszy	Kopf Instruments	Model 921 Zygoma Ear Cups
belka do siekaczy myszy	Kopf Instruments	Model 923B
maska do znieczulania myszy	Kopf Instruments	Model 923B
zestaw do napełniania (zawierający strzykawkę 250ml)	Hamilton Co	PRMKIT 81120
zestaw złączy kompresyjnych RN (1 mm)	Hamilton Co	55750-01
przewód PEEK z zestawu złączy kompresyjnych RN< (1/16th cala)	Hamilton Co	55751-01
podwójny łącznik RN z małym hubem	Hamilton Co	55752-01
adapter Luer do małego huba RN	Hamilton Co	55753-01
strzykawka 1ml 25S model 7001KH	Hamilton Co	80100
*zestaw 6 wymiennych igieł (RN) 33G. Wymiar 1 cal z ścięciem 45<°	Hamilton Co	7803-05
Nożyczki	Fine Science Tools	14084-08
Skalpel	Fine Science Tools	10003-12
Ostrza do skalpela	Fine Science Tools	10035-20
Pinceta	Fine Science Tools	11608-15
Kleszczyki hemostatyczne	Fine Science Tools	13004-14
izofluran	Abbott Laboratories	02241315	2-3%
Nici chirurgiczne (Vicryl 4.0)	Syneture	SS-683
Sterylizator	Fine Science Tools	18000-45
Pompa infuzyjna	Harvard Apparatus	PhD 22/2000
Igły (27G)	BD Biosciences	305109
Igły (25G)	BD Biosciences	305127
Strzykawki (1ml)	BD Biosciences	309692
Wózek do znieczulania	LEI medical	M2000
Baytril	CDMV, St. hyacinthe, QC	102207
Lidokaina	CDMV, St. hyacinthe, QC	3914
Roztwór Betadyny	CDMV, St. hyacinthe, QC	19955