Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

51.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3234

⸱

14 lutego 2012

 ,  , 
1Centre for Neurobiology of Stress, Dept Biological Sciences, University of Toronto at Scarborough

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono >95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Streszczenie

Jednostronny model choroby Parkinsona (PD) u szczurów, indukowany za pomocą 6-hydroksydopaminy (6-OHDA), okazał się nieoceniony w pogłębianiu wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw objawów parkinsonowskich, ponieważ odtwarza on zmiany w obwodach i farmakologii jąder podstawy obserwowane u pacjentów z tą chorobą1-4. Jednakże precyzyjne zmiany komórkowe i molekularne zachodzące w synapsach korowo-prążkowiowych szlaków wyjściowych w obrębie prążkowia, będącego głównym regionem wejściowym jąder podstawy, pozostają nieznane, a uważa się, że jest to miejsce, w którym powstają patologiczne nieprawidłowości wywołujące objawy parkinsonowskie3,5.

W chorobie Parkinsona (PD) zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zmian w obwodach jąder podstawy po degeneracji drogi nigrostriatalnej zostało znacznie usprawnione dzięki opracowaniu myszy z bakteryjnym sztucznym chromosomem (BAC), wykazujących nadekspresję białek zielonej fluorescencji sterowanych przez promotory specyficzne dla dwóch dróg wyjściowych prążkowia (droga bezpośrednia: eGFP-D1; droga pośrednia: eGFP-D2 oraz eGFP-A2a)8, co umożliwiło ich badanie w izolacji. Na przykład niedawne badania zasugerowały występowanie patologicznych zmian w plastyczności synaptycznej u myszy z parkinsonizmem9,10. Badania te wykorzystywały jednak myszy młodzieńcze i ostre modele parkinsonizmu. Nie jest jasne, czy zmiany opisane u dorosłych szczurów ze stabilnymi uszkodzeniami wywołanymi przez 6-OHDA występują również w tych modelach. Inne grupy próbowały stworzyć stabilny, jednostronnie uszkodzony przez 6-OHDA dorosły model myszy z PD poprzez uszkodzenie pęczka przedmózgowego (MFB); niestety w tym badaniu wskaźnik śmiertelności był niezwykle wysoki, a jedynie 14% zwierząt przeżyło operację przez 21 dni lub dłużej11. W nowszych badaniach wywołano uszkodzenia w obrębie istoty czarnej przy niskim wskaźniku śmiertelności i utracie neuronów dopaminergicznych >80%, jednak ekspresja dyskinez indukowanych przez L-DOPA11,12,13,14 była w tych badaniach zmienna. Innym dobrze ugruntowanym modelem mysim PD jest mysz z uszkodzeniem wywołanym przez MPTP15. Chociaż model ten okazał się użyteczny w ocenie potencjalnych czynników neuroprotekcyjnych16, jest on mniej odpowiedni do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw objawów PD, ponieważ model ten często nie wywołuje deficytów motorycznych i wykazuje dużą zmienność w zakresie uszkodzenia17, 18.

Opracowaliśmy stabilny jednostronny model myszy z PD z uszkodzeniem indukowanym 6-OHDA poprzez bezpośrednią administrację 6-OHDA do MFB, co konsekwentnie powoduje utratę >95% dopaminy w prążkowiu (mierzonej za pomocą HPLC), a także wywołuje zaburzenia behawioralne obserwowane w dobrze scharakteryzowanym jednostronnym szczurzym modelu PD z uszkodzeniem indukowanym 6-OHDA. Ten nowo opracowany mysi model PD okaże się cennym narzędziem w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw powstawania objawów parkinsonowskich.

Protokół

1. Zakwaterowanie i przygotowanie myszy

  1. Utrzymuj kolonię myszy transgenicznych z BAC (bakteryjnym sztucznym chromosomem)8 (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB) w cyklu światło-ciemność 12:12 h, z nielimitowanym dostępem do pożywienia i wody. Są to czyste myszy FVB; nie ma potrzeby krzyżowania ich z żadną inną linią, ani w celu hodowli, ani w celu zapewnienia powodzenia procedury uszkodzenia 6-OHDA.
  2. W celu stworzenia modelu parkinsonowskiego, do operacji uszkodzenia 6-OHDA oraz operacji pozornych (sham) wymagane są dorosłe myszy w wieku od 31. do 42. dnia po urodzeniu (P31-42).
  3. Aby zmniejszyć ryzyko infekcji, podawaj Baytril (antybiotyk) w wodzie pitnej przez 24 godziny przed operacją.

2. Przygotowanie leków do zabiegu chirurgicznego

Przed wstrzyknięciem 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) gryzoniom zazwyczaj podaje się leki przygotowawcze w postaci desipraminy i pargyliny, aby zwiększyć selektywność i skuteczność tworzenia zmian wywołanych przez 6-OHDA. Desipramina, będąca inhibitorem wychwytu noradrenaliny / 5HT, zmniejsza wywoływane przez 6-OHDA wyczerpanie zapasów noradrenaliny i 5HT22, natomiast pargylina, będąca inhibitorem monoaminooksydazy, zwiększa wrażliwość zakończeń dopaminergicznych na 6-OHDA poprzez ograniczenie pozasynaptycznego rozkładu 6-hydroksydopaminy31.

  1. Leki przygotowawcze (hydrochlorowodorek desipraminy (HCl) i HCl pargyliny) mogą być sporządzane w dużych objętościach i przechowywane w temperaturze -80°C do momentu użycia. Odważ odpowiednią ilość chlorowodorku desipraminy, aby zapewnić każdemu myszy dawkę 25 mg/kg dla liczby zwierząt, które zostaną poddane operacji w danym dniu. Mała masa ciała myszy sprawia, że precyzyjne podanie niewielkich objętości jest trudne; dlatego należy przygotować chlorowodorek desipraminy w stężeniu 2,5 mg/ml i podać zwierzęciu w objętości 10 ml/kg. Należy uwzględnić masę komponentu solnego związku, aby uzyskać prawidłowe stężenie. Korekta masy soli HCl w chlorowodorku desipraminy: Masa cząsteczkowa (MW) chlorowodorku desipraminy: 302,84; MW HCl: 36,46; MW wolnej zasady: 266,38. Współczynnik korekcyjny: 302,84 / 266,38 = 1,137. Dla 10 ml roztworu: = 2,5 mg/ml desipraminy x 10,0 ml x Współczynnik korekcyjny = 2,5 mg/ml x 10,0 ml x 1,137 = 28,43 mg chlorowodorku desipraminy.
  2. Odważ odpowiednią ilość chlorowodorku pargyliny, aby zapewnić dawkę 5 mg/kg dla każdego myszy z grupy zwierząt poddawanych operacji w danym dniu. Uwzględnij składnik solny związku, zgodnie z powyższym opisem. Ze względu na niską masę ciała myszy precyzyjne podawanie małych objętości jest utrudnione; dlatego należy przygotować chlorowodorek pargyliny w stężeniu 0,5 mg/ml i podawać zwierzęciu w dawce 10 ml/kg.
    Należy uwzględnić masę soli HCl w przypadku chlorowodorku pargyliny:
    Masa cząsteczkowa pargiliny HCl: 195,69 Masa cząsteczkowa HCl: 36,46
    MW wolnej zasady: 159,23 Współczynnik korekcyjny: 195,69 / 159,23 = 1.229
    Aby przygotować 10 ml roztworu, odważone należy:
    = 0,5 mg/ml pargyliny x 10,0 ml x współczynnik korekcyjny
    = 0,5 mg/ml x 10,0 ml x 1,229
    = 6,15 mg chlorowodorku pargyliny
  3. Wymieszać 28,43 mg chlorowodorku desipraminy i 6,15 mg chlorowodorku pargyliny w szklanym cylindrze miernym o pojemności 10 ml, a następnie dodać 8 ml sterylnej soli fizjologicznej (0,9%). Wymieszać w wstrząsarce typu vortex i podgrzać do 45°C do momentu rozpuszczenia mieszaniny. pH roztworu będzie teraz wynosić około 3, co w przypadku podania myszom spowoduje dyskomfort oraz powikłania pooperacyjne dotyczące funkcjonowania układu moczowego i pokarmowego. Dodawać kroplami NaOH (1M), aż pH osiągnie wartość 7,4. Uzupełnić objętość do 10 ml sterylną solą fizjologiczną (0,9%) i wymieszać na wirówce typu vortex. Opisać, opatrzyć datą i zamrozić w temperaturze ~80°CZ uwagi na to, że pargylina HCl nie rozpuszcza się w soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej, przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego należy przechowywać mieszaninę do premedykacji w kąpieli wodnej podgrzanej do 37°C na sali operacyjnej.
  4. Roztwory 6-OHDA należy przygotować bezpośrednio przed operacjami. Jako rozpuszczalnik do przygotowania roztworu bromku 6-OHDA (6-OHDA.Br) stosuje się sterylną sól fizjologiczną (0,9%) zawierającą kwas askorbinowy (0,2%). Kwas askorbinowy jest niezbędny do stabilizacji 6-OHDA.Br, ponieważ zapobiega utlenianiu 6-OHDA.Br do formy nieaktywnej. Odważone 0,2 g kwasu askorbinowego należy wsypać do pustego cylindra mierniczego o pojemności 1 l, dopełnić sterylną solą fizjologiczną (0,9%) do objętości 1 l i wymieszać. Należy opisać naczynie, wpisać datę i przechowywać w temperaturze ~80°C do momentu użycia.
  5. Odważ odpowiednią ilość 6-OHDA.HBr, aby przygotować roztwór o stężeniu 15,0 mg/ml, przeznaczony dla każdej myszy. 3.0 μgPonieważ 6-OHDA.Br jest wrażliwy na światło i ciepło, należy unikać jego ekspozycji na światło oraz umieścić go na lodzie przed ważeniem.
    Uwzględnij masę soli HBr w 6-OHDA.HBr:
    Masa cząsteczkowa 6-OHDA.HBr: 250,09 Masa cząsteczkowa HBr: 79,9 Masa cząsteczkowa wolnej zasady: 170,19
    Współczynnik korekcyjny: 250,09 / 170,19 = 1.47
    Dla 0,5 ml roztworu odważyć:
    = 15,0 mg/ml 6-OHDA x 0,5 ml x Współczynnik korekcji
    = 15,0 mg/ml 6-OHDA x 0,5 ml x 1,47
    = 11,03 mg 6-OHDA.HBr
  6. Odważ 6-OHDA.HBr do sterylnej probówki o pojemności 1,0 ml owiniętej folią aluminiową i dodaj 0,5 ml nośnika (sterylna sól fizjologiczna (0,9%), kwas askorbinowy 0,02%, pH 7,4). Mieszaj w wibratorze laboratoryjnym (vortex) do całkowitego rozpuszczenia mieszaniny, opisz probówkę i natychmiast umieść na lodzie do czasu użycia. Należy pamiętać, że roztwór 6-OHDA musi zostać wykorzystany w ciągu około 6 godzin od przygotowania. Jeśli roztwór zmieni kolor na ciemnobrązowy bezpośrednio po przygotowaniu lub w trakcie operacji, świadczy to o utlenieniu 6-OHDA.HBr, w wyniku czego przestaje on być skuteczną neurotoksyną i musi zostać wylany, a roztwór przygotowany ponownie.
  7. W przypadku zwierząt w grupie pozorowanej należy przygotować objętość nośnika (sterylna sól fizjologiczna (0,9%), kwas askorbinowy 0,02% pH 7,4) równoważną tej, którą otrzymają zwierzęta z uszkodzeniem wywołanym przez 6-OHDA; nośnik należy umieścić w sterylnej probówce o pojemności 1,0 ml owiniętej folią aluminiową, opisać i natychmiast umieścić w lodzie do momentu użycia.

3. Przygotowanie aparatury chirurgicznej

Narzędzia chirurgiczne przed operacją muszą zostać wysterylizowane w autoklawie. Pomiędzy kolejnymi zabiegami narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w 95% etanolu, a następnie poddać działaniu temperatury 250°C przez 2 minuty. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi odpowiednich komisji ds. opieki nad zwierzętami w danej instytucji i kraju.

  1. Przed przygotowaniem sprzętu należy oczyścić wszystkie powierzchnie i urządzenia alkoholem izopropylowym. Podczas pracy z czystym sprzętem chirurgicznym należy nosić sterylne rękawiczki.
  2. Przygotować klatkę regeneracyjną dla myszy z ręcznikami papierowymi na dnie. Umieścić ją pod lampą grzewczą lub na podkładce grzewczej.
  3. Przygotować wózek do znieczulania, upewniając się, że dopływ tlenu jest podłączony i otwarty, a zbiornik z izofluranem jest całkowicie pełny. Ustawić przepływ tlenu na 1 L/min, a stężenie izofluranu na 2-4%. Idealnie, jeśli aparat do znieczulania posiada dwa porty wylotowe, aby dostarczać mieszaninę tlenu i izofluranu do komory indukcyjnej oraz w celu utrzymania znieczulenia, gdy zwierzę znajduje się w ramie stereotaktycznej.
  4. Prawidłowy montaż aparatury infuzyjnej jest krytyczny dla zapewnienia skuteczności tworzenia uszkodzeń, ponieważ uwięzione powietrze lub zablokowane igły zmniejszają objętość 6-OHDA infundowaną w miejscu uszkodzenia. Zmontować aparaturę infuzyjną zgodnie z instrukcją przedstawioną na rysunku 1. Na jeden koniec rurki PEEK nałożyć jedną metalową nakrętkę RN (zestaw kompresyjny RN (złączka 1/16th cala)), następnie pierścień zaciskowy PEEK w kształcie kielicha, a potem standardowy pierścień zaciskowy PFA. Zorientować pierścienie tak, aby stożek standardowego pierścienia PFA wsunął się w pasującą część pierścienia PEEK. Umieścić całość w podwójnym złączu RN z małymi hubami (#1), upewniając się, że połączenie jest szczelne. W drugi koniec podwójnego złącza RN z małymi hubami włożyć igłę do wstrzykiwania o rozmiarze 33 gauge. Przeciągnąć igłę przez jedną z metalowych nakrętek RN i dokręcić. Upewnić się, że igła 33 gauge znajduje się pod kątem 180° względem podwójnego złącza RN z małymi hubami (#1). Na drugim końcu rurki PEEK nałożyć jedną z metalowych nakrętek RN, następnie pierścień PEEK, a potem pierścień PFA. Wsunąć zespół nakrętki i pierścieni do drugiego podwójnego złącza RN z małymi hubami i dokręcić połączenie. W drugi koniec drugiego podwójnego złącza RN z małymi hubami (#2) włożyć adapter luer do małego huba RN (adapter luer) i dokręcić połączenie.
  5. Następnie należy odpowietrzyć aparaturę infuzyjną (patrz Rysunek 1). Napełnić strzykawki Hamiltona o pojemności 250 μl i 1,0 μl sterylną wodą, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Podłączyć strzykawkę 250 μl do adaptera luer i nacisnąć tłok strzykawki 250 μl tak, aby woda wypłynęła przez igłę do wstrzykiwania 33 gauge na drugim końcu rurki. Kontynuować tłoczenie wody przez układ, jednocześnie wyciągając strzykawkę 250 μl z adaptera luer, pozostawiając małą kroplę wody na końcu adaptera luer. Nacisnąć tłok strzykawki 1,0 μl, aż zostanie wydzielona mała kropla wody. Ostrożnie włożyć strzykawkę 1,0 μl do adaptera luer, upewniając się, że kropla wody na strzykawce 1,0 μl połączy się z kroplą wody znajdującą się na adapterze luer, a następnie całkowicie wsunąć strzykawkę 1,0 μl do adaptera luer. Upewnić się, że w podwójnym złączu RN z małymi hubami nie ma pęcherzyków powietrza.
  6. Po odpowietrzeniu układu aparaturę perfuzyjną można przymocować do ramy stereotaktycznej i pompy infuzyjnej. Przymocować podwójne złącze RN z małymi hubami z dołączoną igłą 33 gauge do ramienia manipulatora ramy stereotaktycznej, a następnie przymocować strzykawkę 1,0 μl do pompy perfuzyjnej w taki sposób, aby po uruchomieniu pompy strzykawka była dociskana do uchwytu i nie mogła się poruszyć. Zaprogramować pompę infuzyjną na szybkość infuzji 0,1 μl/min.

4. Operacja jednostronnej lekcji 6-OHDA

  1. Na trzydzieści minut przed rozpoczęciem procedur zważ każde zwierzę i zapisz jego masę. Podaj ogólnoustrojowo hydrochlorowodorek desypraminy (2,5 mg/ml, Sigma Aldrich) oraz hydrochlorowodorek pargyliny (0,5 mg/ml, Sigma Aldrich) (w 0,9% jałowej soli fizjologicznej, pH 7,4) w dawce 10 ml/kg poprzez wstrzyknięcie dosytronne (i.p.) jednej myszy, używając igły 27g przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml. Na przykład mysz o masie 30,0 g otrzyma 300 μl przedoperacyjnej medykacji. Rozgrzej dysk grzejny i umieść go pod uchwytami usznymi i siekacznymi. Dysk grzejny pomoże utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji oraz zapewni optymalną wysokość zwierzęcia, aby dopasować uchwyty uszne i siekaczne aparatury stereotaktycznej.
  2. Piętnaście minut po podaniu roztworu chlorowodorku desipraminy i chlorowodorku pargyliny umieść mysz w zamkniętej komorze do znieczulania i znieczul zwierzę poprzez inhalację izofluranu (2-3% w O2)2). Zwierzę uznaje się za wystarczająco znieczulone, gdy nie wykazuje reakcji na uciśnięcie tylnej kończyny ani odruchu mrugania.
  3. Wygoli górną część głowy myszy i nałóż miejscowy środek przeciwbólowy lidokainę bezpośrednio na skórę za pomocą waty. Pięć minut po aplikacji lidokainy zdezynfekuj głowę zwierzęcia roztworem betadyny.
  4. Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym przystosowanym dla myszy. Najpierw unieruchom zwierzę w uchwytach do siekaczy (ustawienie uchwytów: od -3,0 do +2,0 mm), nakładając maskę anestezjologiczną na pysk zwierzęcia. Ustaw przepływ tlenu na 1 l/min oraz stężenie izofluranu na 1,5-2%. Uchwyty do siekaczy powinny znajdować się na takim poziomie względem uchwytów małżowin usznych, aby górna część czaszki była w poziomie. Wsuń uchwyty małżowin usznych (średnica 5,0 mm). O poprawnym wsunięciu uchwytów świadczy fakt, że głowa znajduje się całkowicie w poziomie i nie przesuwa się w żadnym kierunku.
  5. Nacinając wzdłuż linii środkowej skórę na szczycie głowy myszy za pomocą ostrza skalpela, odsunąć skórę. Powierzchnię czaszki osuszyć gazą.
  6. Naciśnij tłok w 1.0 μl strzykawki i umieść igłę wtryskową o rozmiarze 33 G w probówce o objętości 1 ml, owiniętej folią aluminiową, zawierającej roztwór 6-OHDA (15 mg/ml). Powoli odciągnij tłok 1.0 μl strzykawką, utrzymując igłę iniekcyjną o rozmiarze 33G zanurzoną w roztworze 6-OHDA (15 mg/ml).
  7. Wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłuż linii pośrodkowej czaszki. Przesuń końcówkę igły w kierunku Bregma, a następnie podaj niewielką ilość roztworu 6-OHDA z igły o rozmiarze 33 G, aby utworzyła małą kroplę. Powoli opuszczaj końcówkę igły w stronę Bregma; w momencie, gdy kropla dotknie Bregma, przestań przesuwać igłę i zanotuj te współrzędne. Cofnij igłę o 2 mm w kierunku grzbietowym, a następnie przesuń ją wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku rostralno-kaudalnym w stronę Lambda. Podaj niewielką ilość roztworu 6-OHDA z igły o rozmiarze 33 G, aby utworzyła małą kroplę. Powoli opuszczaj końcówkę igły w stronę Lambda; w momencie, gdy kropla dotknie Lambda, przestań przesuwać igłę i zanotuj te współrzędne. Współrzędne przyśrodkowo-boczne (ML) oraz grzbietowo-brzuszne (DV) powinny być identyczne dla Bregma i Lambda; jeśli tak nie jest, odpowiednio skoryguj pasek do ciętych zębów dla współrzędnych AP oraz uchwyty do uszu dla współrzędnych ML. Przesuń igłę na współrzędne AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm względem Bregma, zgodnie z Mouse Brain Atlas in Stereotaxic Co-ordinates.25Wycofać igłę, a następnie wykonać otwór w czaszce za pomocą igły o rozmiarze 25 G.
  8. Przenieś igłę wstrzykującą do powyższych współrzędnych i wprowadź ją do DV: -5 mm. Wprowadź substancję. 0.2 μl 6-OHDA lub nośnika jednostronnie do wiązki przedniego pola mózgu z szybkością 0.1 μl/min (3 μg łącznie). Po zakończeniu podawania 6-OHDA lub nośnika należy pozostawić igłę w miejscu wkłucia na kolejne pięć minut, aby umożliwić dyfuzję substancji z miejsca iniekcji.
  9. Powoli wycofaj igłę.
  10. Zamknąć nacięcie skóry głowy za pomocą trzech szwów i podać podskórnie (s.c.) 1 ml roztworu Lactated Ringer's.
  11. Usuń zwierzę z ramki stereotaktycznej i umieść je w klatce regeneracyjnej do momentu odzyskania przytomności.

5. Opieka pooperacyjna nad zwierzętami z uszkodzeniem wywołanym przez 6-OHDA

  1. Umieść zwierzęta w klatkach (3 myszy/klatka) i zapewnij im swobodny dostęp do pokarmu oraz wody z cukrem (10 mM). W pojemnikach na pokarm na dnie klatki podawaj Nutra-gel oraz KMR (mleko zastępcze dla kociąt), aby pobudzić apetyt i motorykę przewodu pokarmowego.
  2. Przez 2 tygodnie po zabiegu przeprowadzaj codzienną inspekcję myszy24. Podczas każdej inspekcji należy zwrócić szczególną uwagę na czujność zwierzęcia, oceniając jego zdolność do poruszania się po klatce. Należy również obserwować spożycie pokarmu i wody z ostatniego okresu obserwacji oraz obecność i konsystencję kału. Częstym powikłaniem pooperacyjnym jest odwodnienie, objawiające się powolnym powrotem skóry do pierwotnego położenia po uszczypnięciu. W takim przypadku podawaj 1 ml roztworu Lactated Ringer's s.c. przez 1 tydzień lub do momentu ustąpienia objawów. W przypadku samców należy uważnie obserwować narządy płciowe pod kątem wypadnięcia prącia, rozpoznawanego po zaczerwienieniu prącia. Jeśli wystąpi taka sytuacja, nałóż żel mucol na prącie dotkniętego zwierzęcia i podawaj 1 ml roztworu Lactated Ringer's s.c. przez 1 tydzień lub do momentu ustąpienia objawów.
  3. Codziennie waż zwierzęta, aby monitorować zmiany masy ciała.
  4. W sytuacji, gdy wstrzyknięcie i.p. spowodowało niewielkie przerwanie ciągłości przewodu pokarmowego, może dojść do infekcji jamy brzusznej. Należy zatem oceniać obecność infekcji brzusznej, objawiającej się obrzękiem i wzdęciem brzucha. Leczyć poprzez podawanie Baytrilu w wodzie pitnej przez 3-4 dni lub do momentu ustąpienia objawów.

6. Ocena objawów parkinsonowskich

Aby ocenić zakres uszkodzenia, ocenę behawioralną przeprowadzono od 14 do 21 dni po operacji uszkodzenia 6-OHDA, kiedy poziom wyczerpania dopaminy jest maksymalny i stabilny26.

  1. Po wstrzyknięciu do jam brzusznych (i.p.) 0,01 ml/g 0,9% jałowej soli fizjologicznej, umieść myszy w szklanych cylindrach (11 cm x 9,5 cm) i zarejestruj ich aktywność za pomocą kamery wideo (CG9, Sanyo).
  2. Podczas oglądania nagrania policz liczbę pełnych obrotów o 360° wykonanych zarówno w kierunku ipsylateralnym, jak i kontralateralnym względem miejsca uszkodzenia.
  3. Im większa jest tendencja do obrotów ipsylateralnych, tym silniejsze są objawy parkinsonowskie u zwierzęcia; oblicz zatem proporcję obrotów ipsylateralnych jako procent całkowitego zachowania rotacyjnego (obrotów kontralateralnych i ipsylateralnych).

7. Oznaczanie zawartości dopaminy w prążkowiu metodą HPLC

  1. Co najmniej 21 dni po operacji uszkodzenia 6-OHDA, po zakończeniu badań behawioralnych, uśmiercić myszy poprzez przedawkowanie znieczulenia i ostrożnie wyciąć mózg. Pobrać jeden plaster prążkowia (230 μm) z każdej półkuli od każdej myszy, natychmiast po sekcjonowaniu zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przygotowania próbek prążkowia.
  2. Bufor do próbek HPLC (0,1 M PCA z 2 mM glutationem) zapobiega rozkładowi dopaminy wyekstrahowanej z próbek prążkowia.
    Na 100 ml buforu do próbek:
    = 100 ml H2O klasy HPLC
    = 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
    = 61,5 mg glutationu (zredukowanego)
    Odmierzyć H2O klasy HPLC, dodać PCA, rozpuścić glutation w roztworze, dokładnie wymieszać i przefiltrować. Bufor do próbek można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
  3. Rozmrozić plastry prążkowia na lodzie, a następnie homogenizować w 200 μl buforu do próbek za pomocą ultradźwiękowego rozbijacza komórek (Fisher Sonic, USA). Próbki należy przez cały czas utrzymywać na lodzie i homogenizować każdą próbkę trzy razy po 10 sekund, zapewniając schłodzenie próbek pomiędzy cyklami homogenizacji.
  4. Odłożyć 20 μl każdej zhomogenizowanej próbki (przechowywać w -80°C) do oznaczania białka.
  5. Wirować próbki (20 800 x g, 20 min (4°C, Eppendorf 58- 04R, USA)), a następnie zebrać nadsącz, przefiltrować przez membranę PVDF 0,2 μm (Pall, nr kat.: 1935-28143-310) i zamrozić w -80°C do czasu analizy HPLC. Osad białkowy zachować jako materiał zapasowy do oznaczania białka.
  6. Przygotowanie fazy ruchomej do przepływu przez kolumnę HPLC.
    Na 1 L fazy ruchomej:
    60 mM NaH2PO4.H2O (jednopodstawny) = 8,27 g
    30 mM kwas cytrynowy = 5,7 g
    0,13 mM sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) bezwodna = 48 mg
    0,16 mM dodecylosiarczan sodu (SDS) = 45 mg
    850 ml wody klasy HPLC (Caledon, nr kat.: 8801-7)
    15% v/v acetonitrylu-190 (pH 3,35) = 150 ml klasy HPLC (Caledon, nr kat.: 1401-7)
    ~2 μl 10 M NaOH (w H2O klasy HPLC)
    Wszystkie odczynniki powinny mieć czystość ≥99,0% i w miarę możliwości być klasy HPLC. Woda i acetonitryl muszą być klasy HPLC. Fazę ruchomą należy wykorzystać w ciągu jednego tygodnia od przygotowania. Należy używać dedykowanego, czystego szkła laboratoryjnego i magnesów mieszających wyłącznie do przygotowania fazy ruchomej (szklany cylinder mierniczy 1 L i co najmniej dwie szklane kolby 1 L). Przed przygotowaniem fazy ruchomej przygotować dwie czyste kolby 1 L, jedną do sporządzenia roztworu i drugą do jego przelania podczas filtracji i odgazowywania. Pozostawić fazę ruchomą w obiegu w systemie HPLC przez noc i sprawdzić, czy linia bazowa jest płaska przed rozpoczęciem pracy.
  7. Odmierzyć 700 ml wody klasy HPLC do szklanego cylindra mierniczego i rozpuścić w niej NaH2PO4.H2O, kwas cytrynowy, EDTA i SDS. Dopełnić wodą do objętości 850 ml.
  8. Dostosować pH do wartości 3,35 za pomocą 10 M NaOH, a następnie dodać acetonitryl i wymieszać roztwór za pomocą magnesu mieszającego pokrytego teflonem.
  9. Umieścić magnes mieszający w drugiej czystej, pustej kolbie 1 L i przefiltrować fazę ruchomą pod próżnią przez filtr Millipore HVLP 0,22 μm (nr kat.: SLGP033RS). Przed filtracją zwilżyć filtr roztworem H2O/ACN 85:15. Po pełnym przefiltrowaniu odgazować fazę ruchomą, mieszając ją pod próżnią przez co najmniej 10 min.
  10. Przygotować wzorce, względem których mierzona będzie koncentracja dopaminy w próbkach prążkowia. Wzorce analizuje się w systemie HPLC na początku i na końcu każdej serii próbek prążkowia. Roztwór stokowy dopaminy 1 mg/ml można przygotować wcześniej i przechowywać w alikwotach 20 μl w -80°C. Aby przygotować roztwór stokowy, rozpuścić 5 mg dopaminy w 5 ml buforu do próbek (patrz wyżej) i dokładnie wymieszać. Rozpocząć przygotowanie wzorców, pobierając 5 μl roztworu stokowego 1 mg/ml, dodając go do 2,5 ml buforu do próbek i dokładnie mieszając w celu uzyskania roztworu dopaminy 2 μg/ml.
  11. W celu stworzenia krzywej koncentracji w systemie HPLC analizuje się cztery wzorce. Dla dopaminy są to stężenia: 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml oraz 12,5 ng/ml. Aby uzyskać te cztery stężenia dopaminy, należy pobrać 10 μl roztworu dopaminy 2 μg/ml (przygotowanego w pkt 7.10) i dodać do 190 μl buforu do próbek, co da roztwór dopaminy 100 ng/ml. Następnie wykonać seryjne rozcieńczenie 1:1 roztworu dopaminy 100 ng/ml buforem do próbek. Należy pobrać 100 μl dopaminy 100 ng/ml, dodać 100 μl buforu do próbek i wymieszać, aby uzyskać 50 ng/ml dopaminy, następnie pobrać 100 μl dopaminy 50 ng/ml, dodać 100 μl buforu do próbek i wymieszać, aby uzyskać 25 ng/ml dopaminy, i tak dalej.
  12. Aby przygotować system HPLC (pompa binarna Waters 1525μ, aut sampler 717plus, kolumna w odwróconej fazie Symmetry C-18 (15 cm x 4,6 mm i.d., wielkość cząstek 5 μm) (30°C), detektor elektrochemiczny (ESA Coulochem III) wyposażony w dwuelektrodową celę analityczną (ESA 5011A) sterowany oprogramowaniem Breeze (Waters)), najpierw przepłukać system fazą ruchomą, wybierając protokół płukania w oprogramowaniu komputerowym lub postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Pozwala to na wymianę wszystkich poprzednich roztworów w systemie HPLC na świeżą fazę ruchomą.
  13. Ustawić potencjały elektrochemiczne na 400 mV i -300 mV odpowiednio dla pierwszej i drugiej elektrody. Następnie ustabilizować system, uruchamiając go przez co najmniej 2 godziny, a najlepiej przez noc, z przepływem fazy ruchomej 1 ml/min. Podczas stabilizacji cele powinny być włączone, a odczyt linii bazowej monitorowany; gdy odczyt stanie się stabilny, system jest gotowy do użycia. Przez pierwszą godzinę stabilizacji faza ruchoma opuszczająca system powinna trafiać do pojemnika na odpady, po czym można umożliwić recyrkulację fazy ruchomej w systemie HPLC, wprowadzając wąż wylotowy do kolby z fazą ruchomą.
  14. Rozmrozić próbki prążkowia na lodzie, a następnie wstrzyknąć do ustabilizowanego systemu HPLC 20 μl każdego wzorca dopaminy, następnie 2 x 20 μl każdej próbki i kolejne 20 μl każdego wzorca dopaminy przy przepływie fazy ruchomej 1 ml/min.
  15. Użyć oprogramowania systemu HPLC do analizy pola powierzchni pików dopaminy uzyskanych dla wzorców i próbek. Porównanie pola powierzchni pików dopaminy obecnych w próbkach prążkowia z krzywą koncentracji wzorca dopaminy pozwoli określić ilość dopaminy obecnej w 20 μl każdej próbki prążkowia. Przeliczyć tę wartość, aby wyznaczyć całkowitą ilość dopaminy w całym plastrze prążkowia.
  16. Wykonać standardowe oznaczanie białka w 20 μl homogenatu prążkowia odłożonego w pkt 7.4). Pozwoli to zmierzyć ilość białka w próbkach prążkowia w mg/ml. Na tej podstawie obliczyć ilość dopaminy w próbkach prążkowia jako wartość w ng/mg, co umożliwi porównanie stężeń dopaminy między półkulami oraz między myszami.

8. Reprezentatywne wyniki

Od piętnastu do dwudziestu jeden dni po operacji uszkodzenia 6-OHDA, kiedy proces obumierania komórek wywołany neurotoksyną dobiegnie końca26, pomiar spontanicznych rotacji o 360° po podaniu soli fizjologicznej (i.p.)28 może zostać wykorzystany do oceny skuteczności uszkodzenia 6-OHDA (Rysunek 2). Ta metoda oceny behawioralnej jest prosta i szybka oraz pozwala uniknąć potencjalnych efektów uwrażliwiających wywołanych przezt przez związki dopaminergiczne, takie jak testy z amfetaminą lub apomorfiną. Ponadto ocena rotacji spontanicznych jest lepszym predyktorem u zwierząt z ubytkiem dopaminy <95% w porównaniu do testu ułożenia łap przednich27. Poprzez korelację poziomów dopaminy w prążkowiu z próbek prążkowia (przygotowanych po zakończeniu badań behawioralnych za pomocą HPLC) z procentową liczbą spontanicznych rotacji ipsyperywnych u każdego zwierzęcia, stwierdzono, że zwierzęta wykazujące 70% lub więcej rotacji ipsyperywnych w stronę uszkodzenia 6-OHDA utraciły >95% dopaminy w prążkowiu (Rysunek 3)27. Po częściowych uszkodzeniach wywołanych 6-OHDA (59,44±17,20) (Rysunek 3) wiązki przedniego pola mózgu, podczas pomiaru rotacji spontanicznych (40,91±8,01) (Rysunek 2) nie stwierdzono preferencji rotacyjnej między stroną ipsyperywną a kontralateralną. Zatem, podobnie jak zaobserwowano po podaniu 6-OHDA do MFB u szczurów, możliwe jest wywołanie głębokiej utraty dopaminergicznych neuronów prążkowiowo-czarnych, a podanie soli fizjologicznej (i.p.) jest dokładną metodą przesiewową w celu oceny zakresu uszkodzenia 6-OHDA u tych zwierząt.

Schemat układu równowagi statycznej, sprzęgacz podwójnego piasty, konfiguracja strzykawek, proces inicjacji RNA.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający montaż zestawu igły wstrzykiwanej do zabiegów polegających na wywołaniu uszkodzeń 6-OHDA.

Wykres słupkowy przedstawiający % rotacji ipsyperywnych/min dla grupy pozorowanej, z uszkodzeniem 6-OHDA oraz z częściowym uszkodzeniem 6-OHDA.

Rysunek 2. Ocena zachowań rotacyjnych u myszy poddanych operacji pozorowanej oraz myszy z uszkodzeniem 6-OHDA. Rotacje spontaniczne u myszy po operacji pozorowanej i myszy z uszkodzeniem 6-OHDA. Dane przedstawiono jako średni procent rotacji ipsyperywnych ± SEM, gdzie suma rotacji kontralateralnych i ipsyperywnych stanowi 100%. Słupki białe: zwierzęta po operacji pozorowanej; słupki szare: zwierzęta z uszkodzeniem 6-OHDA z utratą dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta po operacji uszkodzenia 6-OHDA z uszkodzeniem częściowym. *** P<0.001 w porównaniu do zwierząt po operacji pozorowanej. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem porównań wielokrotnych Dunna (operacja pozorowana: n=17; uszkodzenie 6-OHDA (>95%): n=23; częściowe uszkodzenie 6-OHDA: n=3).

Wykres słupkowy porównujący poziomy DA w prążkowiu po operacji pozorowanej i uszkodzeniach 6-OHDA; analiza statystyczna.

Rycina 3. Ocena poziomu dopaminy w prążkowiu u myszy poddanych operacji pozorowanej oraz lekcji 6-OHDA z wykorzystaniem HPLC. Zawartość dopaminy w prążkowiu określono w półkuli operowanej i nieoperowanej u zwierząt z grupy pozorowanej oraz z grupą lekcji 6-OHDA. Dane przedstawiono jako średnią wartość procentową ± SEM poziomu dopaminy w prążkowiu nieoperowanym. Słupki białe: zwierzęta poddane operacji pozorowanej; słupki szare: zwierzęta z lekcją 6-OHDA z utratą dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta poddane operacji lekcji 6-OHDA z częściową lekcją. *** P<0.001, ** P<0.01 w porównaniu do zwierząt poddanych operacji pozorowanej. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z następującym testem porównań wielokrotnych Dunna (operacja pozorowana: n=17, lekcja 6-OHDA (>95%): n=23, częściowa lekcja 6-OHDA: n=3).

Wykres słupkowy porównujący komórki TH+ w SNc u szczurów po operacji pozorowanej i po uszkodzeniu 6-OHDA, badanie neurologiczne.

Rysunek 4. Ocena immunoreaktywności tyrozynowej hydroksylazy w SNc u myszy poddanych operacji pozorowanej oraz myszy z uszkodzeniem 6-OHDA. Jako marker utraty komórek dopaminergicznych w części zwartej istoty czarnej (SNc), utratę immunohistochemicznej reaktywności na tyrozynową hydroksylazę (TH) w półkulach operowanych i nieoperowanych u zwierząt z operacją pozorowaną oraz z uszkodzeniem 6-OHDA określono zgodnie z opisem w Thiele et al. In Press. Dane przedstawiono jako średni procent ± SEM komórek dodatnich pod kątem TH w nieoperowanym prążkowiu. Słupki białe: zwierzęta z operacją pozorowaną; słupki szare: zwierzęta z uszkodzeniem 6-OHDA z utratą dopaminy >95%; słupki czarne: zwierzęta poddane zabiegowi uszkodzenia 6-OHDA z częściowym uszkodzeniem. *** P<0.001, ** P<0.01 w porównaniu do zwierząt z operacją pozorowaną. Jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna (operacja pozorowana: n=17, uszkodzenie 6-OHDA (>95%): n=23, częściowe uszkodzenie 6-OHDA: n=3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje metodę tworzenia stabilnego, jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z uszkodzeniem wywołanym 6-OHDA, który charakteryzuje się bardzo wysoką powtarzalnością, wysokim współczynnikiem sukcesu uszkodzenia oraz niską śmiertelnością. Sukces operacji uszkodzenia 6-OHDA można łatwo oszacować poprzez pomiar spontanicznych zachowań rotacyjnych, gdzie >70% rotacji ipsyversyjnych wskazuje na >95% ubytku dopaminy w uszkodzonym prążkowiu27. Ilościowe oznaczenie poziomu dopaminy w p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Ministerstwo Spraw Zagranicznych i Handlu Międzynarodowego (Rząd Kanady), Fundusz Connaught Uniwersytetu w Toronto, Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji, NSERC, Fundację Krembil oraz Cure Parkinson’s Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
desypramina HClSigma-AldrichD12525mg/kg
pargilina HClSigma-AldrichP80135mg/kg
6-OHDA HBrSigma-AldrichH1163mg / mysz
aparat stereotaktycznyKopf InstrumentsModel 900
uchwyty uszne dla myszyKopf InstrumentsModel 921 Zygoma Ear Cups
belka do siekaczy myszyKopf InstrumentsModel 923B
maska do znieczulania myszyKopf InstrumentsModel 923B
zestaw do napełniania (zawierający strzykawkę 250ml)Hamilton CoPRMKIT 81120
zestaw złączy kompresyjnych RN (1 mm)Hamilton Co55750-01
przewód PEEK z zestawu złączy kompresyjnych RN< (1/16th cala) Hamilton Co55751-01
podwójny łącznik RN z małym hubemHamilton Co55752-01
adapter Luer do małego huba RNHamilton Co55753-01
strzykawka 1ml 25S model 7001KHHamilton Co80100
*zestaw 6 wymiennych igieł (RN) 33G. Wymiar 1 cal z ścięciem 45<°Hamilton Co7803-05
NożyczkiFine Science Tools14084-08
SkalpelFine Science Tools10003-12
Ostrza do skalpelaFine Science Tools10035-20
PincetaFine Science Tools11608-15
Kleszczyki hemostatyczneFine Science Tools13004-14
izofluranAbbott Laboratories022413152-3%
Nici chirurgiczne (Vicryl 4.0)SynetureSS-683
SterylizatorFine Science Tools18000-45
Pompa infuzyjnaHarvard ApparatusPhD 22/2000
Igły (27G)BD Biosciences305109
Igły (25G)BD Biosciences305127
Strzykawki (1ml)BD Biosciences309692
Wózek do znieczulaniaLEI medicalM2000
BaytrilCDMV, St. hyacinthe, QC102207
LidokainaCDMV, St. hyacinthe, QC3914
Roztwór BetadynyCDMV, St. hyacinthe, QC19955

Bibliografia

  1. Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
  2. Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
  3. Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
  4. Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
  5. Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
  6. Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
  7. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
  8. Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
  9. Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
  10. Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
  11. Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
  12. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  13. Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
  14. Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
  15. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
  16. Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
  17. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  18. Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
  19. Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
  20. Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
  21. Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
  22. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  23. Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
  24. Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
  25. Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
  26. Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
  27. Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
  28. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
  29. Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
  30. Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
  31. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lesja 6-OHDAchirurgia stereotaktycznaprzyśrodkowy pęczek przedmózgowiawyczerpanie dopaminyocena behawioralnaopieka pooperacyjnaaparat do infuzjirotacje spontaniczne
Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.