Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Podsumowanie

Komórki natural killer stanowią niewielką populację limfocytów. W niniejszym materiale pokazujemy, jak izolować te komórki z ludzkiej krwi metodą selekcji negatywnej, wykorzystując zestaw firmy StemCell Technologies. Uzyskane komórki są żywe i nieoznaczone przeciwciałami, w związku z czym nadają się do zastosowania w wielu procedurach.

Streszczenie

Komórki natural killer (NK) to duże ziarniste limfocyty cytotoksyczne należące do wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają główną rolę w walce z nowotworami i infekcjami, ale biorą także udział w wczesnych etapach ciąży i odrzucaniu przeszczepów. Komórki te występują we krwi obwodowej, z której można je wyizolować. Izolacja komórek może odbywać się za pomocą selekcji pozytywnej lub negatywnej. W selekcji pozytywnej stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko markerowi powierzchniowemu występującemu wyłącznie na komórkach będących przedmiotem zainteresowania, natomiast w selekcji negatywnej wykorzystuje się koktajle przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym obecnym na wszystkich komórkach z wyjątkiem komórek docelowych. Ta druga technika daje korzyść w postaci pozostawienia komórek docelowych wolnych od przeciwciał, co zmniejsza ryzyko niepożądanej aktywacji lub różnicowania komórek. W tym protokole wideo demonstrujemy, jak oddzielić komórki NK z ludzkiej krwi poprzez selekcję negatywną, korzystając z zestawu RosetteSep firmy StemCell technologies. Procedura polega na pobraniu ludzkiej krwi obwodowej (zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyczną w celu ochrony uczestników) i zmieszaniu jej z koktajlem przeciwciał, które zwiążą się z markerami nieobecnymi na komórkach NK, ale obecnymi na wszystkich pozostałych komórkach mononuklearnych we krwi obwodowej (np. limfocytach T, monocytach...). Przeciwciała zawarte w koktajle są skoniugowane z przeciwciałami skierowanymi przeciwko glikoforynie A na erytrocytach. W rezultacie wszystkie niepożądane komórki oraz krwinki czerwone zostaną uwięzione w kompleksach. Mieszanina krwi i koktajlu przeciwciał jest następnie rozcieńczana, nakładana na gradient Histopaque i wirowana. Komórki NK (>80% czystości) można zebrać na granicy fazy między Histopaque a rozcieńczonym osoczem. Podobne koktajle są dostępne do wzbogacania innych populacji komórek, takich jak ludzkie limfocyty T.

Protokół

Szczegółowy protokół jest dołączony do każdego koktajlu izolacyjnego Rosette Sep i jest dostępny online na stronie internetowej firmy StemCell Technologies ¹.

Dyskusja

Komórki wyizolowane za pomocą tej techniki mogą zostać następnie rozdzielone na różne populacje przy użyciu innych zestawów do separacji komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koktajl Rosette Sep dla ludzkich komórek NK	Odczynnik	Stem Cell Technologies	15065
PBS, sterylny, 1x	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14040-058
Pł Tk (FCS, FBS)	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	16140-071
Histopaque-1077	Odczynnik	Sigma-Aldrich	10771
PBS uzupełniony o 2% FCS oraz roztwory Histopaque muszą zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem procedury.