Artykuł metodologiczny

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

28.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3275

⸱

13 września 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Streszczenie

Serce myszy jest popularnym modelem w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na dostępność niskokosztowych technologii inżynierii genetycznej u tego gatunku. Fenotypowanie fizjologiczne układu sercowo-naczyniowego serca myszy można łatwo przeprowadzić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem różnych sond do pomiaru potencjału błonowego (Vm), przejściowych stężeń wapnia (CaT) oraz innych parametrów. Sprzężenie wzbudzenie-skurcz charakteryzuje się dynamiką potencjału czynnościowego i wapnia wewnątrzkomórkowego; dlatego niezwykle ważne jest jednoczesne mapowanie zarówno Vm, jak i CaT w tym samym miejscu serca1-4. Jednoczesne mapowanie optyczne z serc myszy perfundowanych w aparacie Langendorffa ma potencjał do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw niewydolności serca, arytmii, chorób metabolicznych i innych schorzeń serca. Wizualizacja aktywacji, prędkości przewodzenia, czasu trwania potencjału czynnościowego oraz innych parametrów w wielu miejscach nie jest możliwa do osiągnięcia w badaniach na poziomie komórkowym, natomiast zostaje skutecznie rozwiązana dzięki mapowaniu optycznemu1,5,6. W niniejszej pracy przedstawiamy konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne dla jednoczesnego mapowania optycznego Vm i CaT w sercach myszy z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną, z wykorzystaniem najnowocześniejszej technologii obrazowania CMOS. Spójne zapisy optyczne uzyskane tą metodą wykazują, że jednoczesne mapowanie optyczne serc myszy perfundowanych w aparacie Langendorffa jest zarówno wykonalne, jak i wiarygodne.

Protokół

1. Zaawansowane przygotowanie roztworów stokowych

  1. Przygotować wcześniej dwa roztwory zapasowe roztworu Tyrode'a (16x) w wodzie dejonizowanej i przechowywać je w temperaturze 4°C:
    1. Roztwór zapasowy I (119,872 g/L NaCl, 3,056 g/L CaCl2 (2H2O), 5,6 g/L KCl, 2,6274 g/L NaH2PO4, 3,408 g/L MgCl2 (6H2O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));
    2. Roztwór zapasowy II (26,88 g/L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
  2. Przygotować roztwory zapasowe barwników fluorescencyjnych. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, oba barwniki przechowujemy w alikwotach po 30 μl w temperaturze -20°C, co jest ilością wystarczającą na jeden eksperyment:
    1. Roztwór zapasowy barwnika wrażliwego na napięcie RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), roztwór o stężeniu 1,25 mg/mL w dimetylosulfotlenku (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);
    2. Roztwór zapasowy wskaźnika wapnia Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA), roztwór o stężeniu 1 mg/mL w DMSO.
  3. Przygotować wcześniej roztwór zapasowy blebbistatyny, rozprzęgacza sprzężenia pobudzenie-skurcz (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, roztwór 2 mg/mL w DMSO) i przechowywać rozpuszczoną blebbistatynę w temperaturze 4°C.

2. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych i zestawu eksperymentalnego7

  1. Przygotować świeżą porcję 2L roztworu Tyrode'a (128,2mM NaCl, 1,3mM CaCl2 (2H2O), 4,7mM KCl, 1,05mM MgCl2 (6H2O), 1,19mM NaH2PO4, 20mM NaHCO3, 11,1mM D-glukozy w wodzie dejonizowanej, pH=7,35±0,05). W przypadku użycia roztworu zapasowego do przygotowania 2L roztworu Tyrode'a (ilość wystarczająca na jeden eksperyment), należy wziąć 1750 mL wody dejonizowanej i zmieszać z 125 mL Stock I, 125 mL Stock II oraz 4g glukozy.
  2. Włączyć dwie pompy systemów perfuzyjnych. Ustawić pompę perystaltyczną (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) wykorzystywaną do perfuzji wstecznej na 40 mL/min. Ustawić drugą pompę perystaltyczną (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pump L/S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) wykorzystywaną do superfuzji i powrotu perfuzatu do zbiornika magazynowego na 80 mL/min.
  3. Przepłukać system perfuzyjny 70% etanolem przez 30 min, a następnie 2L wody dejonizowanej.
  4. Po usunięciu całej wody dejonizowanej z komory, wprowadzić w obieg roztwór Tyrode'a, przepuszczając go przez filtr 5-μm (Millipore, Billerica, MA, USA). Podgrzać perfuzat do +37°C za pomocą płaszcza wodnego i cyrkulatora (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) oraz natlenić perfuzat poprzez przepuszczanie gazu O2/CO2 (95% / 5%) do roztworu. Monitorować pH roztworu za pomocą pH-metru (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) i regulować tempo bąbelkowania O2/CO2, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 ± 0,05. Kontynuować monitorowanie pH i temperatury podczas eksperymentu.
  5. Podwójny aparat do mapowania optycznego składa się z dwóch kamer CMOS MiCAM Ultima-L (SciMedia, Costa Mesa, CA) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100x100 pikseli, 230±20 μm na piksel) i czasowej (1 000-3 000 klatek/s). Przed kamerą przeznaczoną do obrazowania wapnia należy zamocować filtr pasmowy (590±15 nm, Thorlabs, Newton, NJ), natomiast przed kamerą przeznaczoną do obrazowania napięcia należy umieścić filtr długoprzepustowy (>700 nm, Thorlabs, Newton, NJ). Kamery są rozmieszczone prostopadle do siebie za pomocą uchwytu, który zawiera lustro dichroniczne (odcięcie 635 nm, Omega Optical, Brattleboro, VT). Bezpośrednio pod uchwytem kamer znajduje się soczewka (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235052), która skupia światło emisyjne pochodzące z serca na lustrze dichronicznym. Odległość robocza wynosi około 3cm.
    Światło wzbudzenia jest generowane przez lampę halogenową (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) i przechodzi przez filtr cieplny, migawkę oraz filtr pasmowy (520±45 nm). Elastyczny światłowód kieruje przefiltrowane światło na preparat, a migawka zapewnia, że preparat jest naświetlany tylko podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć fotobleachingu barwników.
  6. Przygotować wcześniej elektrody Ag/AgCl2 do stymulacji i detekcji i zainstalować je w komorze przed umieszczeniem serca. Upewnić się, że wzmacniacze i filtry są ustawione na odpowiednie poziomy.

3. Pobranie serca myszy, kaniulacja i przygotowanie perfuzji w układzie Langendorffa

  1. Zanurz mysz w narkozie za pomocą ketaminy/ksylazyny (ketamina, 80mg/kg masy ciała; ksylazyna, 10 mg/kg masy ciała) oraz heparyny (100 jednostek) podanej w zastrzyku doszpikowym. Odpowiedni poziom znieczulenia należy potwierdzić brakiem odruchu bólowego.
  2. Po wykonaniu nacięcia wzdłuż mostka szybko wyciąć serce i wypłukać je w natlenionym (95% O2, 5% CO2) roztworze Tyrode'a o stałej temperaturze (37±1°C).
  3. Używając mikroskopu sekcyjnego, szybko zlokalizować aortę i wykonać czyste cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej. Krótki odcinek aorty zostaje następnie przymocowany do specjalnie wykonanej kaniuli 21-gauge z rozszerzoną końcówką. Do utrwalenia serca na kaniuli używa się czarnej plecionej nici jedwabnej 4-0 (Surgical Specialties Corporation, Reading, PA). Po kaniulacji serce jest poddawane perfuzji wstecznej oraz superfuzji roztworem Tyrode'a. Szybkość perfuzji wstecznej reguluje się w zakresie 2-5 mL/min, aby utrzymać ciśnienie w aorcie między 60 a 80 mmHg (przetwornik ciśnienia, World precision instruments Inc (WPI), Sarasota, USA; wzmacniacz mostkowy TBM4M, WPI, Sarasota, USA).
  4. Po kaniulacji serca należy wyciąć i usunąć płuca, grasicę oraz tkankę tłuszczową.
  5. Izolowane serce zostaje przyszpilone (Fine Science Tools) w okolicy wierzchołka do dna komory perfuzyjnej (powleczonej Sylgardem), aby zapobiec ruchom wywoływanym przez strumień płynu. Prawe i lewe uszka przedsionków są również rozciągane i przyszpilane (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) do dna komory, co zapewnia maksymalną powierzchnię do pomiarów optycznych przedsionków.
    Bardzo ważne! Do lewej komory, przez żyły płucne, wprowadza się małą rurkę silikonową i mocuje ją nicią jedwabną do pobliskiej tkanki łącznej. Zapobiega to zastojowi roztworu i zakwaszeniu perfuzatu uwięzionego w lewej komorze, co jest szczególnie istotne po zahamowaniu skurczów komór za pomocą odsprzęgacza wzbudzenia i skurczu (patrz Część 4 krok 19).
  6. Na powierzchni serca umieszcza się specjalnie wykonaną elektrodę do prowadzenia stymulacji rozrusznikowej, generowanej przez Master-8 (A.M.P Instruments Ltd, Jerozolima, Izrael) lub PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australia).
  7. Na powierzchni roztworu nad sercem mocuje się małe szkiełko zakrywkowe, aby zredukować artefakty ruchowe wynikające z wibracji roztworu.
  8. Skupić światło wzbudzenia na sercu. Dodatkowo dostosować odległość między aparaturą z podwójną kamerą a sercem, aby uzyskać maksymalną rozdzielczość.
  9. Wyłączyć wszystkie światła w pomieszczeniu i rozpocząć rejestrację elektryczną przy użyciu PowerLab 26T.

4. Obciążenie barwnikami wrażliwymi na napięcie i wapń oraz odsprzęgaczem pobudzenia i skurczu

  1. Podgrzać 0,6 mL blebbistatyny. Wymieszać 0,5 mL blebbistatyny z perfuzatem w zbiorniku magazynującym. Pozostałe 0,1 mL blebbistatyny rozcieńczyć w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli wstrzyknąć (w ciągu 20 minut) przez port do podawania leków znajdujący się w pobliżu kaniuli. Obserwować, jak blebbistatyna stopniowo redukuje artefakty ruchowe.
  2. Rozcieńczyć 30 μL roztworu zapasu barwnika napięciowo-czułego RH237 w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli wstrzyknąć w ciągu 5-7 minut przez ten sam port wstrzyknięcia, co w przypadku blebbistatyny.
  3. 30 μL wskaźnika wapnia Rhod-2 AM wymieszać w stosunku 1:1 z Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, roztwór 20% w DMSO), a następnie rozcieńczyć w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli podać w ciągu 5-10 min przez ten sam port wstrzyknięcia.
  4. Odczekać 5-10 minut, aż blebbistatyna i barwniki dotrą do błony komórkowej i cytozolu. Kontynuować protokół, gdy ruch zostanie całkowicie zahamowany.
  5. Bieżąco monitorować zapisy EKG przez cały czas trwania procedury, aby zapewnić prawidłową funkcję elektryczną serca.
  6. Rozpocząć rejestrację sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania SciMedia (SciMedia, Costa Mesa, CA).

5. Reprezentatywne wyniki:

Układ mikroskopu optycznego do obrazowania fluorescencyjnego z filtrami; analiza poziomu Ca²⁺ w komórkach.
Rysunek 1. Układ eksperymentalny do perfuzji, rejestracji elektrycznej i mapowania optycznego.
EM=emisja; Lp=filtr długoprzepustowy

Badanie EKG, układ stymulacji serca; obejmuje sygnały z przedsionków i komór, elektrodę, schemat EKG.
Rysunek 2. Przygotowanie eksperymentalne i przykłady sygnałów zarejestrowanych podczas stymulacji komór. Po lewej: sygnały EKG są zbierane za pomocą dyskowych elektrod Ag/AgCl2 (góra) oraz przedstawiono przykład protokołu stymulacji S1S1 (dół). Środek: preparat serca myszy w układzie Langendorffa. Po prawej: przedstawiono reprezentatywne optyczne potencjały czynnościowe oraz sygnały przejściowe wapnia z przedsionków (góra) i komór (dół). Żółta strzałka (góra) wskazuje rozproszenie sygnału fluorescencyjnego pochodzące z komór, widoczne w rejestracjach z przedsionków.
LV=lewa komora; RV=prawa komora; LA=lewy przedsionek; RA=prawy przedsionek

Rejestracja sygnałów serca za pomocą elektrod; analiza wykresów Vm i CaT; konfiguracja elektrod, wykres wyników.
Rycina 3. Reprezentatywne zapisy optyczne Vm oraz CaT z komór serca myszy typu dzikiego. A. Preparat eksperymentalny z układem równomiernie rozmieszczonych punktów zaznaczonych czarnymi kropkami, których zapisy optyczne przedstawiono w (C). B. Przykładowy przebieg Vm i CaT z centralnego punktu układu (patrz ramka w (C)). C. Vm (niebieski) i CaT (czerwony) z układu równomiernie rozmieszczonych punktów. Sygnały zostały pogrupowane w obszary 3x3.

Schemat czasu aktywacji serca i dynamiki napięcia; obejmuje wykresy stymulacji, Vm, dV/dt.
Rysunek 4. Mapa aktywacji i przewodnictwo. A. Przykład mapy aktywacji z serca myszy typu dzikiego z zaznaczonymi białymi strzałkami kierunkami poprzecznym (T) i podłużnym (L). B. Sygnały Vm (góra) i dV/dt (dół) odpowiadające trzem punktom widocznym na mapie A (T1, T2, T3; L1, L2, L3).

Porównanie map serca APD80 i CaD80 w warunkach kontrolnych i po podaniu ISO; potencjał czynnościowy, przejściowy wzrost poziomu wapnia.
Rysunek 5. Analiza czasu trwania potencjału czynnościowego i przejściowego wzrostu poziomu wapnia. A. Przedstawiono mapy czasu trwania potencjału czynnościowego przy 80% repolaryzacji (APD80) oraz czasu trwania przejściowego wzrostu poziomu wapnia przy 80% relaksacji (CaD80) dla serca w warunkach kontrolnych (lewo) oraz po zastosowaniu 30 nM izoproterenolu (prawo). Żółto-zielony kolor w komorach (prawo) wskazuje na skrócenie APD80 i CaD80 pod wpływem izoproterenolu. B. Przykładowe zapisy APD80 i CaD80 z komór (góra) i przedsionków (dół) myszy typu dzikiego.

Dyskusja

W niniejszym eksperymencie zmodyfikowaliśmy metodę perfuzji Langendorffa poprzez dodanie małej rurki silikonowej, co jest szczególnie istotne po zahamowaniu skurczów komór za pomocą odsprzęgacza pobudzenia i skurczu. Rurka silikonowa służy do zapobiegania zastojowi roztworu, zakwaszeniu płynu perfuzyjnego oraz rozwojowi niedokrwienia w lewej komorze. Serce myszy jest bardzo wrażliwe na hipotermię; w związku z tym wahania temperatury w obrębie serca spowodowałyby sztuczne różnice w czasie trwania potencjału czynnościowego. W konsekwencji w komorze perfuzyjnej zastosowano system grzewczy, aby utrzymać stałą temperaturę 37°C przez cały czas trwania eksperymentu8. Ponieważ model Langendorffa nie zachowuje unerwienia serca, w celu zbadania fizjologicznego napięcia współczulnego i przywspółczulnego należy rozważyć dodanie neuroprzekaźników do perfuzatu9. Oprócz perfuzji wstecznej, zastosowanie superfuzji serca pomaga utrzymać odpowiednie parametry środowiskowe, takie jak pH i temperatura. W tej metodzie serce poddawane perfuzji Langendorffa umieszczono poziomo. Można również zastosować pionowy układ perfuzji Langendorffa10, co jednak może prowadzić do nieco innych wyników w zakresie mechaniki serca11. Oprócz kamer CMOS dostępne są również alternatywne detektory, które mogą być wykorzystane do jednoczesnego mapowania Vm oraz CaT12.

Zastosowanie kamer CMOS o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej zapewnia dokładność rejestracji; jednak sygnały mapowania optycznego nie pochodzą z pojedynczej komórki. Zamiast tego każdy sygnał fluorescencyjny pochodzi z setek lub tysięcy komórek, w zależności od powiększenia optycznego. Znacznie silniejsza fluorescencja komór czasowych może zniekształcać sygnały przedsionków wskutek rozpraszania optycznego; dlatego wymagana jest ostrożna interpretacja sygnałów rejestrowanych optycznie. Innym ograniczeniem preparatu mysiego jest zniekształcenie sygnału i szum wywołane krzywizną powierzchni wynikającą z niewielkich rozmiarów serca13. Pomiary prędkości przewodzenia mogą być zmienione nie tylko przez krzywiznę serca myszy, ale także przez polaryzację elektrod i elektrody wirtualne. Aby uzyskać dokładność map prędkości przewodzenia, anizotropii aktywacji i repolaryzacji, niezbędne jest prawidłowe ustawienie ostrości kamery na powierzchni serca.

W tej metodzie zapisy EKG w czasie rzeczywistym mogą uzupełniać optyczne badanie elektrofizjologii serca. W protokole zastosowano barwnik wrażliwy na napięcie (RH237) oraz wskaźnik wapnia (Rhod-2AM) ze względu na ich szybką odpowiedź, podobne wzbudzenie i odmienne widma emisji3,7. Poza RH237 i Rhod-2AM istnieją alternatywne kombinacje barwników, które można wykorzystać do pomiaru Vm i CaT3. Wykazano, że nowy barwnik wrażliwy na napięcie, PGHI, o dużym przesunięciu Stokesa (>200nm), pozwala na uzyskanie lepszych sygnałów Vm i CaT dzięki większemu rozdzieleniu długości fal emisji między PGHI a Rhod-2AM14. Przyszłe ulepszenia mogą skupić się na badaniu nowych sond fluorescencyjnych, opracowywaniu nowych detektorów obrazowania oraz udoskonalaniu oprogramowania do przetwarzania obrazów. Ważnymi kierunkami rozwoju mapowania optycznego są również wyższa rozdzielczość oraz nowe modalności obrazowania optycznego dla mapowania optycznego 3D5.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Granty NIH R01 HL085369.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClFisher ScientificS271-1
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClFisher ScientificS217-500
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500
NaHCO3Fisher ScientificS233-3
D-glukozaFisher ScientificD16-1
BlebbistatynaTocris Bioscience1760
RH237InvitrogenS1109
Rhod-2AMInvitrogenR1244
Pluronic F127InvitrogenP3000MP
Dimethylosulfoksyd (DMSO)Sigma-AldrichD2650
PowerLab 26T figure-materials-1 ADInstruments

Bibliografia

  1. Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts. Circulation. 90, 1-1 (1994).
  2. Efimov, I. R. Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts. Circulation. 90, 1469-1480 (1994).
  3. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
  4. Pruvot, E. J. Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans. Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).
  5. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, 21-33 (2004).
  6. Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).
  7. Glukhov, A. V. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. , (2009).
  8. Baker, L. C. Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia. Circ Res. 86, 396-407 (2000).
  9. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).
  10. Efimov, I. R. Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).
  11. Hammouda, M., Kinosita, R. The coronary circulation in the isolated heart. J Physiol. 61, 615-628 (1926).
  12. Salama, G., Hwang, S. M. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).
  13. Lou, Q. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
  14. Salama, G. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Perfuzja Langendorffaobrazowanie fluorescencyjnekamery CMOSbarwnik wra liwy na napi ciewska nik wapniaredukcja artefakt w ruchowych

Powiązane artykuły