Optyczne mapowanie potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia w sercu myszy

Summary

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę preparacji, ustawienie instrumentalne i warunki eksperymentalne podczas optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowego przejściowego wapnia (CaT) w nienaruszonych izolowanych perfundowanych sercach myszy Langendorffa.

Abstract

Serce myszy jest popularnym modelem do badań sercowo-naczyniowych ze względu na istnienie taniej technologii inżynierii genetycznej u tego gatunku. Fizjologiczne fenotypowanie serca myszy można łatwo przeprowadzić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu różnych sond do pomiaru potencjału transbłonowego (V_m), stanów przejściowych wapnia (CaT) i innych parametrów. Sprzężenie wzbudzenie-skurcz charakteryzuje się potencjałem czynnościowym i wewnątrzkomórkową dynamiką wapnia; dlatego niezwykle ważne jest, aby mapować zarówno_Vm, jak i CaT jednocześnie z tego samego miejsca na sercu^1-4. Jednoczesne mapowanie optyczne z perfundowanych serc myszy Langendorffa może potencjalnie wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw niewydolności serca, arytmii, chorób metabolicznych i innych chorób serca. Wizualizacja aktywacji, prędkości przewodzenia, czasu trwania potencjału czynnościowego i innych parametrów w niezliczonych miejscach nie może być osiągnięta na poziomie komórkowym, ale jest dobrze rozwiązana przez mapowanie optyczne^1,5,6. W artykule przedstawiono konfigurację oprzyrządowania i warunki eksperymentalne jednoczesnego mapowania optycznego V_m i CaT w sercach myszy z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przy użyciu najnowocześniejszej technologii obrazowania CMOS. Spójne zapisy optyczne uzyskane tą metodą pokazują, że jednoczesne mapowanie optyczne perfundowanych serc myszy Langendorffa jest zarówno wykonalne, jak i niezawodne.

Protocol

1. Zaawansowane przygotowanie roztworów podstawowych

1. Przygotować wcześniej dwa roztwory podstawowe roztworu Tyrode'a (16x) w wodzie dejonizowanej i przechowywać je w temperaturze 4°C:
   1. Stado I (119,872 g/L NaCl, 3,056 g/L CaCl₂ (2H₂O), 5,6 g/L KCl, 2,6274 g/L NaH₂PO₄, 3,408 g/L MgCl₂ (6H₂O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));
   2. Stado II (26,88 g/l NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
2. Przygotować roztwory podstawowe barwników fluorescencyjnych. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, przechowujemy 30 μl porcji obu barwników w temperaturze -20°C, co wystarcza na jeden eksperyment:
   1. Barwnik wrażliwy na napięcie RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) roztwór podstawowy, 1,25 mg/ml roztwór w dimetylosulfotlenku (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);
   2. Wskaźnik wapnia Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) roztwór podstawowy, 1 mg/ml roztwór w DMSO.
3. Przygotować wcześniej roztwór podstawowy blebbisstatyny do rozprzęgania wzbudzenia i skurczu (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, roztwór 2 mg/ml w DMSO) i przechowywać rozpuszczoną blebbisatynę w temperaturze 4°C.

2. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych i konfiguracja eksperymentalna⁷

4. Świeżo przygotuj 2L roztworu Tyrode (128,2 mM NaCl, 1,3 mM CaCl₂ (2H₂O), 4,7 mM KCl, 1,05 mM MgCl₂ (6H₂O), 1,19 mM NaH₂PO₄, 20 mM NaHCO₃, 11,1 mM D-Glucose w wodzie dejonizowanej, pH = 7,35±0,05). Jeśli do przygotowania 2 litrów roztworu Tyrode'a używa się roztworu podstawowego (wystarczającego na jeden eksperyment), weź 1750 ml wody dejonizowanej i wymieszaj ze 125 ml roztworu I, 125 ml roztworu Stock II i 4 g glukozy.
5. Włącz dwie pompy systemów perfuzyjnych. Ustaw pompę perystaltyczną (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA), która jest używana do perfuzji wstecznej, na 40 ml/min. Ustawić drugą pompę perystaltyczną (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pump L/S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois), która jest używana do superfuzji i zwrócić perfuzat z powrotem do zbiornika retencyjnego na 80 ml/min.
6. Myć system perfuzyjny 70% etanolem przez 30 minut, a następnie 2 litrami wody dejonizowanej.
7. Gdy cała woda dejonizowana zostanie usunięta z komory, należy wprowadzić cyrkulację roztworu Tyrode'a i przepuścić go przez filtr 5 μm (Millipore, Billerica, MA, USA). Podgrzej perfuzat do +37°C za pomocą płaszcza wodnego i cyrkulatora (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) i natlenić perfuzat, wprowadzając gaz O₂/CO₂ (95% / 5%) do roztworu. Monitorować pH roztworu za pomocą pH-metru (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) i dostosować szybkość bulgotania_O2/CO₂, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 ± 0,05. Kontynuuj monitorowanie pH i temperatury podczas eksperymentu.
8. Podwójny aparat do mapowania optycznego składa się z dwóch kamer MiCAM Ultima-L CMOS (SciMedia, Costa Mesa, CA), które charakteryzują się wysoką rozdzielczością przestrzenną (100x100 pikseli, 230±20 μm na piksel) i czasową (1000-3000 klatek/s). Zamocuj filtr pasmowo-przepustowy (590±15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) przed wyznaczoną kamerą do obrazowania wapnia; podczas gdy filtr długoprzepustowy (>700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) musi być umieszczony przed wyznaczoną kamerą obrazowania napięcia. Kamery są ustawione prostopadle do siebie za pomocą uchwytu, w którym znajduje się zwierciadło dichroiczne (odcięcie 635 nm, Omega Optical, Brattleboro, VT). Bezpośrednio pod podwójnym uchwytem aparatu znajduje się obiektyw (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235052), który skupia światło emisyjne pochodzące z serca na zwierciadło dichroiczne. Odległość robocza wynosi około 3 cm.
   Światło wzbudzenia jest generowane przez lampę halogenową (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) i przechodzi przez filtr cieplny, przesłonę i filtr pasmowo-przepustowy (520±45 nm). Elastyczny światłowód kieruje przefiltrowane światło pasmowo-przepustowe na preparat, a migawka jest używana w celu zapewnienia, że preparat jest wystawiony na działanie światła tylko podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć fotowybielania barwników.
9. Przygotuj wcześniej elektrody Ag/AgCl₂ do stymulacji i wykrywania i zainstaluj je w komorze przed umieszczeniem serca. Upewnij się, że amplifiers i filtry są ustawione na odpowiednie poziomy.

3. Zbierz serce myszy, kaniuluj i ustaw perfuzję Langendorffa

10. Znieczulić mysz ketaminą/ksylazyną (ketaminą, 80 mg/kg masy ciała; ksylazyną, 10 mg/kg masy ciała) i heparyną (100 jednostek) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Zapewnij odpowiedni poziom znieczulenia poprzez brak odruchu bólowego.
11. Po nacięciu w połowie mostka należy szybko wyjąć serce i umyć je w natlenionym (95%_O2, 5%_CO2) roztworze Tyrodego o stałej temperaturze (37±1°C).
12. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego szybko zidentyfikuj aortę i wykonaj czyste cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej. Krótki odcinek aorty jest następnie mocowany do wykonanej na zamówienie kaniuli o rozmiarze 21 z rozszerzaną końcówką. Jedwabny szew 4-0 z czarnym plecionym szwem (Surgical Specialties Corporation, Reading, PA) służy do mocowania serca na kaniuli. Po kanelacji serce jest wstecznie perfundowane i superfuzjowane roztworem Tyrode'a. Szybkość perfuzji wstecznej jest regulowana w zakresie 2-5 ml / min, aby utrzymać ciśnienie w aorcie między 60 a 80 mmHg (Przetwornik ciśnienia, World precision instruments Inc (WPI), Sarasota, USA; Wzmacniacz mostkowy TBM4M, WPI, Sarasota, USA).
13. Po kaniulacji serca płuca, grasica i tkanka tłuszczowa są następnie preparowane i usuwane.
14. Izolowane serce jest przypięte (Fine Science Tools) na wierzchołku do dna komory perfuzyjnej (pokryte Sylgardem), aby zapobiec ruchowi wywołanemu strumieniem. Prawy i lewy przyrostek przedsionkowy są również rozciągnięte i przypięte (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) do dna komory, co zapewnia maksymalną powierzchnię do pomiarów optycznych przedsionków.
    Bardzo ważne! Mała silikonowa rurka jest wprowadzana do lewej komory przez żyły płucne i mocowana jedwabnym szwem do pobliskiej tkanki łącznej. Zapobiega to przekrwieniu roztworu i zakwaszeniu perfuzatu uwięzionego w lewej komorze, co jest szczególnie ważne po zahamowaniu skurczów komorowych za pomocą rozprzęgacza wzbudzenie-skurcz (patrz część 4, krok 19).
15. Na powierzchni serca umieszczana jest specjalnie wykonana elektroda do prowadzenia stymulacji stymulacyjnej, która jest generowana przez Master-8 (A.M.P Instruments Ltd, Jerozolima, Izrael) lub PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australia).
16. Małe szkło nakrywkowe jest mocowane na powierzchni roztworu nad sercem, aby zmniejszyć artefakt ruchu z wibrującego roztworu.
17. Skoncentruj światło wzbudzenia na sercu. Ponadto dostosuj odległość między aparatem z podwójnym aparatem a sercem, aby uzyskać maksymalną rozdzielczość.
18. Wyłącz wszystkie światła w pomieszczeniu i rozpocznij nagrywanie elektryczne za pomocą PowerLab 26T.

4. Napięcie obciążenia i barwniki wrażliwe na wapń oraz rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu

19. Rozgrzej 0,6 ml blabistatyny. Zmieszać 0,5 ml bróbstatyny z perfuzatem w zbiorniku retencyjnym. Rozcieńczyć pozostałe 0,1 ml bróbstatyny w 1 ml roztworu Tyrode'a i powoli wstrzykiwać (przez 20 minut) przez port leku znajdujący się w pobliżu kaniuli. Obserwuj, jak blabistatyna stopniowo zmniejsza artefakt ruchu.
20. Rozcieńczyć 30 μl wrażliwego na napięcie roztworu podstawowego barwnika RH237 w 1 ml roztworu Tyrode'a i powoli wstrzykiwać przez 5-7 minut do tego samego portu iniekcyjnego, w którym znajduje się blibistatyna.
21. 30 μl wskaźnika wapnia Rhod-2 AM miesza się w stosunku 1:1 z Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% roztwór w DMSO), a następnie rozcieńcza w 1 ml roztworu Tyrode'a i powoli nakłada przez 5-10 minut przez ten sam port iniekcyjny.
22. Poczekaj 5-10 minut, aż blebbistatyna i barwniki dotrą do błony komórkowej i cytozolu. Kontynuuj działanie protokołu, gdy ruch zostanie całkowicie stłumiony.
23. Stale monitoruj zapisy EKG przez cały czas trwania zabiegu, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie elektryczne serca.
24. Rozpocznij nagrywanie sygnału fluorescencyjnego za pomocą niestandardowego oprogramowania SciMedia (SciMedia, Costa Mesa, CA).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Eksperymentalna konfiguracja do perfuzji, zapisów elektrycznych i mapowania optycznego.
EM = emisja; Lp=długi przepust

Rysunek 2. Przygotowanie eksperymentalne i przykłady sygnałów zarejestrowanych podczas stymulacji komorowej. Po lewej: Sygnały EKG są zbierane z elektrod dyskowych Ag/AgCl₂ (u góry) i pokazano przykład protokołu stymulacji S1S1 (u dołu). W środku: preparat serca myszy Langendorff. Po prawej: Pokazane są reprezentatywne optyczne potencjały czynnościowe i przejściowe sygnały wapnia z przedsionków (na górze) i komór (na dole). Żółta strzałka (u góry) wskazuje na rozpraszanie sygnału fluorescencyjnego pochodzące z komór, które jest widoczne w nagraniach przedsionkowych.
LV = lewa komora; RV = prawa komora; LA=lewe przedsionek; RA=prawy przedsionek

Rysunek 3. Reprezentatywne zapisy optyczne_{Vm, m} i CaT z komór serca myszy typu dzikiego. A. Eksperymentalny preparat z układem równomiernie rozmieszczonych miejsc oznaczonych czarnymi kropkami których zapisy optyczne widoczne są w (C). B. Przykładowe śledzenie V_{, m} i CaT z centralnego miejsca w tablicy (patrz ramka w (C)). C. V_{, m} (niebieski) i CaT (czerwony) z tablicy równomiernie rozmieszczonych lokalizacji. Sygnały były binowane 3x3.

Rysunek 4. Mapa aktywacji i przewodzenie. A. Przykładowa mapa aktywacji z serca myszy typu wild z kierunkami poprzecznymi (T) i podłużnymi (L) oznaczonymi białymi strzałkami. B. Sygnały V_m (góra) i dV/dt (dół) odpowiadające trzem punktom widzianym w A (T1, T2, T3; L1, L2, L3).

Rysunek 5. Analiza potencjału czynnościowego i czasu trwania przejściowego wapnia. A. Mapy czasu trwania potencjału czynnościowego przy 80% repolaryzacji (APD80) i przejściowego czasu trwania wapnia przy 80% relaksacji (CaD80) są pokazane z serca w warunkach kontrolnych (po lewej) i po zastosowaniu izoproterenolu 30 nM (po prawej). Żółto-zielony kolor w komorach (po prawej) wskazuje na izoproterenol skrócony APD80 i CaD80. B. Przykładowe ślady APD80 i CaD80 z komór myszy typu dzikiego (na górze) i przedsionkach (na dole).

Discussion

W tym eksperymencie zmodyfikowaliśmy metodę perfuzji Langendorffa, dodając małą rurkę silikonową, co jest szczególnie istotne po zahamowaniu skurczów komorowych za pomocą rozprzęgacza wzbudzenie-skurcz. Rurka silikonowa służy do zapobiegania przekrwieniu roztworu, zakwaszeniu roztworu perfuzyjnego i rozwojowi niedokrwienia lewej komory. Serce myszy jest bardzo wrażliwe na hipotermię; W związku z tym zmiany temperatury w sercu spowodują sztuczne różnice w czasie trwania potencjału czynnościowego. W związku z tym w komorze perfuzyjnej zastosowano system grzewczy w celu utrzymania stałej temperatury 37°C przez cały czas trwania eksperymentu⁸. Ponieważ model Langendorffa nie zachowuje unerwienia serca, należy rozważyć dodanie neuroprzekaźników do perfuzatu w celu zbadania fizjologicznego tonu współczulnego i przywspółczulnego⁹. Oprócz perfuzji wstecznej, dodanie superfuzji serca pomaga w utrzymaniu odpowiednich parametrów środowiskowych, takich jak pH i temperatura. W tej metodzie perfundowane serce Langendorffa umieszczono poziomo. Można również zastosować pionową konfigurację perfuzji Langendorffa¹⁰, ale może to skutkować nieco inną mechaniką serca¹¹. Oprócz kamer CMOS dostępne są również detektory alternatywne, które można zastosować do jednoczesnej mapy V_m i CaT¹².

Zastosowanie kamer CMOS o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej zapewnia dokładność nagrań; Jednak sygnały mapowania optycznego nie pochodzą z jednej komórki. Zamiast tego każdy sygnał fluorescencyjny pochodzi z setek lub tysięcy komórek, w zależności od powiększenia optycznego. Znacznie większa fluorescencja komorowa może zniekształcać sygnały przedsionkowe poprzez rozpraszanie optyczne; W związku z tym konieczna jest dokładna interpretacja optycznie rejestrowanych sygnałów. Kolejnym ograniczeniem przygotowania myszy jest zniekształcenie sygnału i szum wywołany krzywizną powierzchni ze względu na mały rozmiar serca¹³. Pomiary prędkości przewodzenia mogą być zmieniane nie tylko na podstawie krzywizny serca myszy, ale także na podstawie polaryzacji elektrod i elektrod wirtualnych. Aby osiągnąć dokładność map prędkości przewodzenia, anizotropii aktywacji i repolaryzacji, niezbędne jest prawidłowe ustawienie ostrości kamery na powierzchni serca.

W tej metodzie zapisy EKG w czasie rzeczywistym mogą uzupełniać optyczne badanie elektrofizjologii serca. W protokole zastosowano barwnik wrażliwy na napięcie (RH237) i wskaźnik wapniowy (Rhod-2AM) ze względu na ich szybką reakcję, podobne wzbudzenie i wyraźne widma emisyjne^3,7. Istnieją alternatywne kombinacje barwników, które można stosować do pomiaru V_{, m} i CaT, inne niż RH237 i Rhod-2AM³. Odkryto, że nowy barwnik wrażliwy na napięcie, PGHI, z dużym przesunięciem Stoke'a (>200 nm) pozwala na lepsze sygnały V_m i CaT ze względu na większą separację długości fal emisji między PGHI a Rhod-2AM¹⁴. Przyszłe ulepszenia mogą koncentrować się na badaniu nowych sond fluorescencyjnych, opracowywaniu nowych detektorów obrazowania i ulepszonym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Wyższa rozdzielczość i nowatorskie metody obrazowania optycznego do mapowania optycznego 3D są również ważnymi przyszłymi kierunkami mapowania optycznego⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-1
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Fisher Scientific	S217-500
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3
D-Glukoza	Fisher Scientific	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760
RH237	Invitrogen	S1109
Rhod-2AM	Invitrogen	R1244
Pluronic F127	Invitrogen	P3000MP
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
PowerLab 26T	Instrumenty ADInstruments