Prosty protokół Chelex do ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Podsumowanie

Opisany jest szybki i niedrogi sposób na ekstrakcję wysokiej jakości DNA pasożyta malarii i wektora z próbek komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelev, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazie środkowego jelita komara, a także identyfikację molekularną gatunków rodzeństwa Anopheles za pomocą PCR.

Streszczenie

Kraje endemiczne coraz częściej stosują narzędzia molekularne do efektywnego pisania, identyfikacji i nadzoru nad pasożytami malarii i komarami-wektorami, jako integralną część swoich programów kontroli^1,2,3,4,5. Dla trwałego ustanowienia tych dokładnych podejść w badaniach operacyjnych w celu wzmocnienia wysiłków na rzecz kontroli i eliminacji malarii, niezbędne są proste i niedrogie metody, z oszczędnymi wymaganiami dotyczącymi odczynników i sprzętu^6,7,8. Poniżej przedstawiamy prostą technikę ekstrakcji DNA pasożyta malarii i wektora z próbek komarów pobranych w terenie.

Zidentyfikowaliśmy morfologicznie 72 Anopheles gambiae sl. ze 156 komarów schwytanych przez spray ze złocienia łapie się w pokojach sypialnych gospodarstw domowych w promieniu 2 000^km2 w pobliżu Instytutu Malarii w Macha. Po rozbiorze w celu oddzielenia głowy i klatki piersiowej od brzucha dla wszystkich 72 komarów Anopheles gambiae sl., obie sekcje umieszczono indywidualnie w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zanurzono w 20 μl wody dejonizowanej. Za pomocą sterylnej końcówki pipety każda sekcja komara została oddzielnie zhomogenizowana do jednolitej zawiesiny w wodzie dejonizowanej. Z powstałego homogenatu z każdego odcinka komara 10 μl zostało zachowane, podczas gdy pozostałe 10 μl przeniesiono do oddzielnej autoklawowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Poszczególne podwielokrotności poddano ekstrakcji DNA za pomocą uproszczonego Chelexu lub standardowego protokołu ekstrakcji z wysoleniem^9,10. Protokół wypalania jest tak zwany i szeroko stosowany, ponieważ wykorzystuje wysokie stężenia soli zamiast niebezpiecznych rozpuszczalników organicznych (takich jak fenol i chloroform) na etapie wytrącania białek podczas ekstrakcji DNA⁹.

Ekstrakty zostały użyte jako matryce do amplifikacji PCR przy użyciu starterów celujących w mitochondrialną dehydrogenazę minukleotydową nikotynamidu adeninowego (NADH) podjednostki 4 (ND4) stawonogów w celu sprawdzenia jakości DNA¹¹, PCR do identyfikacji gatunków rodzeństwa Anopheles gambiae ¹⁰ i zagnieżdżonego PCR do typowania infekcji Plasmodium falciparum ¹². Porównanie przy użyciu PCR o jakości DNA (ND4) wykazało 93% czułość i 82% swoistość dla podejścia Chelex w stosunku do ustalonego protokołu wysalania. Odpowiednie wartości czułości i swoistości wynosiły odpowiednio 100% i 78%, przy użyciu identyfikacji gatunków rodzeństwa PCR oraz odpowiednio 92% i 80% dla PCR wykrywającej P. falciparum. Nie stwierdzono istotnych różnic w proporcji próbek dających sygnał amplikonowy z Chelex lub regularnym protokołem wysalania we wszystkich trzech zastosowaniach PCR. Podejście Chelex wymagało trzech prostych odczynników i 37 minut na wykonanie, podczas gdy protokół wypalania obejmował 10 różnych odczynników i czas przetwarzania wynoszący 2 godziny i 47 minut, w tym etap nocny. Nasze wyniki pokazują, że metoda Chelex jest porównywalna z istniejącą ekstrakcją wysolenia i może być zastąpiona jako proste i zrównoważone podejście w warunkach ograniczonych zasobów, gdzie często trudno jest utrzymać stały łańcuch dostaw odczynników.

Protokół

1. Wstępna sekcja próbek komarów

1. Umieść komara na małym wycinku parafilmu i zamontuj na mikroskopie preparacyjnym
.
2. Przykryj kroplą wody dejonizowanej, aby zmiękczyć tkankę.
3. Naciąć tuszę komara dokładnie w stawie między klatką piersiową a brzuchem, odcinając w ten sposób głowę i klatkę piersiową od części brzusznej.
4. Przenieść każdą wypreparowaną część komara do czystej, autoklawowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, wstępnie oznaczonej szczegółami numeru identyfikacyjnego komara i odpowiednio oznaczonej w celu oznaczenia sekcji ciała (np. "m" dla części środkowego jelita; "HT" dla przekroju głowy i klatki piersiowej).
5. Wyrzuć parafilm i ostrożnie przetrzyj stolik mikroskopowy 70% nasączonym alkoholem Kimwipe przed przetworzeniem następnego komara.

2. Ekstrakcja DNA z próbek komarów

1. Odpipetować 20 μl wody dejonizowanej do probówki z próbką i za pomocą końcówki pipety zmielić zanurzoną sekcję komara na jednolitą zawiesinę.
2. Dodać 100 μl autoklalawowanego 1X PBS/1% roztworu saponin do homogenatu próbki i wymieszać przez delikatne chwilowe wirowanie.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
4. Wirować przy 20 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
5. Zawiesić osad w 100 μl 1X PBS.
6. Odwirować ponownie przy 20 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
7. Poprzez delikatne wirowanie (5 sekund) ponownie zawiesić granulat w 75 μl sterylnej wody dejonizowanej i 25 μl 20% w/v zawiesiny żywicy Chelex-100 w wodzie dejonizowanej.
8. Przebić otwór w wieczku probówki z próbką za pomocą sterylnej igły podskórnej 23G podpalonej w palniku Bunsena.
9. Zawiesinę próbki gotować w łaźni wodnej na pływającym stojaku (lub w bloku grzewczym) przez 10 minut.
10. Wirować przy 20 000 x g przez 1 minutę i przenieść powstały w ten sposób roztwór DNA do wstępnie oznakowanej fiolki do przechowywania w celu wykorzystania jako matryca w aplikacjach PCR.

3. Genotypowanie Plasmodium falciparum i Anopheles spp. Identyfikacja molekularna

1. Dodać 2,5 μl ekstraktu DNA Chelex w 25 μl reakcji PCR w celu sprawdzenia jakości DNA¹¹, identyfikacji gatunków Anopheles ¹⁰ i genotypu P. falciparum¹²zakażeń środkowego jelita grubego i gruczołów ślinowych.
2. Aby zmaksymalizować wydajność amplikonów, szczególnie w przypadku wykrywania P. falciparum, należy uwzględnić 1,5-krotną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w teście PCR. Zalecany jest następujący skład reakcji: (2,5 μl matrycy, 0,25 μM starterów, 1,5 μM chlorku magnezu, 200 μM dNTP, 1X bufor PCR, 1,5X BSA i 1,0U polimerazy DNA Taq, w objętościach 25 μl).
3. Aby sprawdzić jakość DNA w ekstrakcie, amplifikuj region genu mitochondrialnej dehydrogenazy dinukleotydowej nikotynamidu nikotynamidoadeninowego (NADH) podjednostki 4 (ND4) stawonogów (startery ND4FW [5'-GTD, YAT TTA, TGA, TTR, CCT, AA-3'] i ND4RV [5'-CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3']; spodziewaj się produktu 400bp)^11,13.
4. Aby odróżnić Anopheles gambiae sl. gatunki rodzeństwa (tylko An. gambiae ss i An. arabiensis), amplifikują region flankujący SNP w regionie międzygenowej dystansowej (IGS), (startery UN [5'-GTGTGCCCCCCTTCCTCGATGT-3'], GA [5'-CTGGTTTGGGGCACACGTTT-3'], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; spodziewaj się produktu 390bp An gambiae ss, 315bp An arabiensis)^10,11.
5. W celu typowania polimorfizmów oporności na leki przeciw folianom P. falciparum należy wykonać zagnieżdżony PCR w celu amplifikacji kodonów aminokwasowych 108, 51, 59, 16 i 164 w genie reduktazy dihydrofolianu pasożyta (DHFR):
   Podstawowe okrągłe spłonki: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3'] i M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   Drugorzędne okrągłe podkłady: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3'] z F/ [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   Lub
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] z M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3']).
   Amplifikuj również region zawierający kodony aminokwasowe 436, 437, 540, 581 i 613 w genie syntetazy dihydropteroinianu P. falciparum (DHPS):
   Podstawowe okrągłe podkłady R2 [5'- AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3'] z R/ [5'- AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   Grunty wtórne okrągłe
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] z K/ [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATGCAAGAA-3']
   Lub
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3'] z K/,
   Lub
   L [5'- ATAGGATACTATTTGATGATGATGATGATGGACCAGGATGATTCG-3'] z L/ [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3']¹².
6. Poddaj amplikon 4 μl trawieniu enzymu restrykcyjnego specyficznego dla alleli w 30 μl reakcjach zgodnie z instrukcjami producenta, w celu wykrycia polimorfizmów związanych z opornością na leki^{antyfolianowe 12}.
7. Poddaj się 5 μl amplikonu PCR (lub 15 μl trawienia restrykcyjnego) na pas 2% gli agarozowego barwionego bromkiem etydyny do elektroforezy (100 - 120 V) i uwidocznij pasma pod wpływem promieniowania UV.

Wyniki

Przykłady wyników testów PCR dla jakości ekstraktu DNA komara (Rysunek 1), identyfikacji molekularnej Anopheles arabiensis (Rysunek 2) i wykrywania P. falciparum (Rysunek 3) pokazują, że uproszczona metoda Chelex daje podobne wyniki do standardowego protokołu wysalania¹⁰, pomimo znacznie mniejszej liczby kroków (Tabela 1). Przy porównywalnej jakości DNA w odpowiednich ekstraktach nie jest zaskakujące, że wskaźniki dodatniości próbki w odniesieniu do gatunków rodzeństwa An. gambiae, a także wskaźniki infekcji pasożytami nie różniły się statystycznie na podstawie testu chi-kwadrat McNemara (ryc. 3).

Czułość (%) została obliczona jako TP/(TP+FN)*100, gdzie TP oznacza wyniki prawdziwie pozytywne, a FN oznacza wyniki fałszywie ujemne. Swoistość (%) określono jako TN/(TN+FP)*100, gdzie TN oznacza wyniki prawdziwie ujemne, a FP oznacza wyniki fałszywie dodatnie. PCR o jakości DNA (ND4) wykazał 93% czułość i 82% swoistość dla podejścia Chelex w porównaniu z ustalonym protokołem wysalania jako złotym standardem. Odpowiednie wartości czułości i swoistości wynosiły odpowiednio 100% i 78%, przy użyciu identyfikacji gatunków rodzeństwa PCR oraz odpowiednio 92% i 80% dla PCR wykrywającej P. falciparum.

Dodanie BSA do mieszanin reakcyjnych spowodowało ogólny wzrost pozytywnych wyników PCR (Rysunek 3) z powodu ulgi inhibitorów PCR¹⁴, zarówno dla uproszczonego protokołu Chelex, jak i regularnego wysalania. Wzrost ten nie był jednak statystycznie istotny, z wyjątkiem jakości DNA (ND4 PCR) na ekstraktach Chelex (p = 0,039). Trawienie enzymu restrykcyjnego specyficznego dla alleli na amplikonie DHFR (lub innego genu docelowego) P. falciparum umożliwia genotypowanie zakażeń malarią w środkowej części jelita grubego i gruczołach ślinowych pod kątem alleli oporności na leki (Figura 4; dane dotyczące gruczołów ślinowych nie pokazano).

Prosta procedura Chelex Standardowa procedura solenia Kroki Odczynniki Kroki Odczynniki

1. Dodać próbkę do 1,5 ml probówki do mikrofuge i homogenizować w 100 μl 1X PBS/1% roztworu saponiny (2 min).
2. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut.
3. Wirować w temperaturze 20 000 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant.
4. Dodaj 100 μl 1X PBS i delikatnie wymieszaj, chwilowo wirując (3 sekundy).
5. Wirować w temperaturze 20 000 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant.
6. Dodaj 25 μl 20% w/v Chelex do wody dejonizowanej i 75 μl sterylnej wody dejonizowanej.
7. Przekłuć otwór w wieczku probówki z próbką za pomocą gorącej, sterylnej igły podskórnej 23G i zawartości probówki do gotowania przez 10 minut.
8. Wirować probówkę do mikrofuge o sile 20 000 x g przez 1 min.
9. Przenieść supernatant do sterylnej, wstępnie znakowanej fiolki i przechowywać roztwór DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia (2,5 μl w 25 μl reakcji PCR).

PBS

Saponina
Koraliki Chelex-100

1. Dodać próbkę do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i homogenizować w 100 μl buforze Bendera* z 1% DEPC (2 min).
2. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.
3. Dodać 15 μl zimnego 8 M octanu potasu. Delikatnie wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 45 minut.
4. Wirować próbkę w probówkach do mikronasycania o wymiarach 20 000 x g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
5. Dodaj 250 μl 100% etanolu i dobrze wymieszaj, odwracając rurkę.
6. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
7. Wirować próbki w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut.
8. Odessać i wyrzucić supernatant, pozostawiając osad do całkowitego wyschnięcia w probówce (30 min).
9. Zawiesić osad w 20 μl 0,1X SSC + RNAza (10 μg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C.
10. Dodać 80 μl wody DEPC i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

Węglan dietylu (DEPC)
* Bufor giętarki:
0,1 M NaCl
0,2 mln Sacharoza
0,1 m Tris-HCL

0,05 M EDTA, pH 9,1

0,5% SDS w wodzie DEPC

8 M Octan potasu

etanol

0,1X Bufor soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC)

RNAza (10 μg/ml) CZAS CAŁKOWITY: 37 min CZAS CAŁKOWITY: 2 godz. 47 min., plus nocleg

Tabela 1. Porównanie krok po kroku odczynników i wymagań czasowych dla prostego protokołu Chelex i standardowej metody wysalania do ekstrakcji DNA z próbek komarów.

Rysunek 1. Porównanie jakości DNA ND4 mitochondrialnego PCR z uproszczonych ekstraktów Chelex "C" i standardowych ekstraktów "M" do wysalania na próbkach terenowych Anopheles arabiensis. NC, kontrola ujemna; M1 i C1, M2 i C2, M3 i C3 oraz M4 i C4 są sparowanymi ekstraktami z wysolenia i Chelex z tych samych okazów komarów An. arabiensis. L, drabinka DNA 100 pz.

Rysunek 2. Identyfikacja molekularna PCR w kierunku Anopheles arabiensis. C1 i M1, C2 i M2, C3 i M3, C4 i M4 oznaczają odpowiedni amplikon z wysolenia "M" i uproszczonych ekstraktów DNA Chelex "C" dla tych samych próbek komarów; AR, kontrola pozytywna Anopheles arabiensis; L, drabinka DNA 100 pz.

Rysunek 3. Wykrywanie dodatnich wyników na Chelex i wysolenie ekstraktów DNA dla próbek z pola komarów, z testami PCR do identyfikacji molekularnej Anopheles arabiensis (AR)¹⁰, testu jakości DNA genu dehydrogenazy NADH stawonogów 4 (ND4)¹¹ i genotypowania oporności na leki przeciwfolianowe P. falciparum DHFR¹² (F-M4). Wyniki pokazane dla testów przeprowadzonych z BSA lub bez BSA w mieszaninie reakcyjnej. Test chi-kwadrat McNemara został wykorzystany do określenia, czy różnice między procentem pozytywnych PCR z DNA wyekstrahowanego z uproszczonego Chelexu a standardowymi protokołami wysalania były statystycznie istotne.

Rysunek 4. Zastosowanie uproszczonego protokołu Chelex w genotypowaniu zakażeń P. falciparum u komarów (pokazane dane dotyczące środkowego odcinka jelita) w celu wykrycia alleli oporności na leki. Trawienie BstN I na kodonie 108 flankującym amplikon genu¹² DHFR P. falciparum wykazuje oporne na cykluguanil mutanty S108T w próbkach komarów (M1-M5; pokazano dane dotyczące środkowego jelita). U, niestrawiony amplikon 522 pz; FCR3, laboratoryjny wzorzec klonu kontroli pozytywnej P. falciparum przenoszący S108T; K1, P. falciparum laboratoryjna standardowa kontrola ujemna klonu przenosząca wrażliwy na cykloguanil S108N; L, drabinka DNA 100 pz.

Dyskusja

Przedstawiona tu uproszczona metoda Chelex umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości DNA Anopheles spp i P. falciparum z próbek komarów nadających się do różnych zastosowań PCR. Technika ta może być wykorzystana do identyfikacji molekularnej komarów wektorów malarii i nadzoru lekoopornych alleli P. falciparum u komarów w krajowych programach kontroli malarii. Do zalet uproszczonej techniki Chelex należą: prostota, mniejsza liczba odczynników, a co za tym idzie koszty, bezpieczeństwo i krótszy czas przetwarzania (37 minut) niż w przypadku standardowych protokołów, takich jak metoda wysalania¹⁰ (2 godziny 47 minut i etap nocny, tabela 1). Wyżej wymienione zalety i minimalne wymagania dotyczące odczynników (3 odczynniki) w porównaniu z obecnym standardowym protokołem (10 odczynników, tabela 1)^11,15 sprawiają, że uproszczony protokół Chelex jest szczególnie przyjazny dla laboratoriów w krajach endemicznych, w których stały łańcuch dostaw odczynników jest często trudny do utrzymania. Ograniczeniem metody jest to, że podobnie jak standardowy protokół, poddano ją również inhibitorom PCR, o których wiadomo, że występują w powłoce komara¹⁶. Jest to jednak łatwo łagodzone przez włączenie BSA do testów. BSA jest również z powodzeniem stosowany jako wzmacniacz amplifikacji przeciwko inhibitorom w innych zastosowaniach PCR^17,18.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chelex-100, 50-100 sucha siatka	BioRad	#143-2832
Saponin	SIGMA	142-7425
BSA	New England Biolabs	B9001S