Izolacja RNA z Pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

Podsumowanie

Opisano niezawodną metodę izolacji RNA z Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z kątnic myszy. Odzyskane RNA charakteryzuje się ilością i jakością wystarczającą do późniejszych eksperymentów qPCR, profilowania transkrypcyjnego oraz sekwencjonowania RNA (RNA Seq). Technikę tę można dostosować do izolacji RNA z innych drobnoustrojów jelitowych.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa (PA) powodują znaczną zachorowalność i śmiertelność u gospodarzy z upośledzonym układem odpornościowym, takich jak pacjenci z białaczką, rozległymi oparzeniami lub po przeszczepach organów¹. U pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia zakażeń krwi PA, głównym rezerwuarem kolonizacji jest przewód pokarmowy (GI)², jednak mechanizmy, dzięki którym PA przechodzi z postaci bezobjawowego mikroba kolonizującego w inwazyjny i często śmiertelny patogen, pozostają niejasne. Wcześniej przeprowadziliśmy eksperymenty z profilowaniem transkrypcji in vivo, izolując mRNA PA z komórek bakteryjnych znajdujących się w kątnicach skolonizowanych myszy ³, aby zidentyfikować zmiany w ekspresji genów bakteryjnych podczas zmian stanu odporności gospodarza.

Podobnie jak w każdym eksperymencie z profilowaniem transkrypcji, etapem ograniczającym tempo jest izolacja wystarczającej ilości wysokiej jakości mRNA. Biorąc pod uwagę obfitość enzymów, detrytusów, resztek pokarmowych i cząsteczek stałych w przewodzie pokarmowym, izolacja RNA stanowi ogromne wyzwanie. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę niezawodnej i powtarzalnej izolacji bakteryjnego RNA pozyskanego z przewodów pokarmowych myszy. Metoda ta wykorzystuje dobrze ugruntowany model mysi kolonizacji przewodu pokarmowego przez PA oraz dysseminacji indukowanej neutropenią⁴. Po potwierdzeniu kolonizacji przewodu pokarmowego przez PA, myszy są uśmiercane, a zawartość kąkrzewnika jest pobierana i błyskawicznie mrożona. Następnie RNA jest ekstrahowane z wykorzystaniem kombinacji rozbicia mechanicznego, gotowania, ekstrakcji fenol/chloroform, traktowania DNazą oraz chromatografii powinowactwa. Ilość i czystość są potwierdzane za pomocą spektrofotometrii (Nanodrop Technologies) i bioanalizatora (Agilent Technologies) (Rys 1). Tę metodę izolacji mikrobiologicznego RNA z przewodu pokarmowego można łatwo zaadaptować również do innych bakterii i grzybów.

Protokół

1. Mysi model P. aeruginosa Kolonizacja i rozprzestrzenianie się w przewodzie pokarmowym

1. Myszy C3H/HeN (samice, 6-8 tygodni, Harlan) poddaje się leczeniu antybiotykami doustnymi w celu usunięcia flory komensalnej, a następnie mono-kolonizuje się je szczepem PA zgodnie z wcześniej opisaną procedurą⁴.

2. Pobieranie zawartości światła kątnicy myszy

1. Zanurzyć oczyszczony moździerz ze stali nierdzewnej w kąpieli z ciekłego azotu.
2. Uśmiercić myszy poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.
3. Ustabilizować truchło myszy na styropianowej płytce i spryskać 95% etanolem. Wykonać podłużne cięcie pośrodku skóry od mostka do krocza. Odsunąć skórę i otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną.
4. Wyciąć całe kątnicę. Przytrzymać kątnicę pęsetą nad stalowym moździerzem. Odciąć oba końce kątnicy nożyczkami chirurgicznymi.
5. Wprowadzić końcówkę pipety P1000 wypełnioną 1 ml buforu do płukania kątnicy (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA i 200 mM NaCl)⁵ do proksymalnego końca kątnicy. Wpłukać bufor oraz zawartość światła kątnicy do stalowego moździerza. 1 ml buforu do płukania kątnicy będzie wystarczający do usunięcia całej zawartości kątnicy. Wypłukana zawartość kątnicy zamarznie natychmiast po zetknięciu się z moździerzem.
6. Rozetrzeć zamrożoną zawartość kątnicy sterylnym tłuczkiem.
7. Przenieść rozdrobnioną, zamrożoną zawartość światła kątnicy do polipropilenowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, zanurzonej w kąpieli z suchego lodu i etanolu.
8. Powtórzyć kroki od 2.2 do 2.7 dla każdej kolejnej myszy.
9. Przechowywać w temperaturze -80°C.

3. Izolacja bakteryjnego RNA

1. Podgrzać 1 objętość (w odniesieniu do końcowej objętości zawartości światła dwóch kątnic, ok. 3 ml) kwasowego fenolu/chloroformu (5:1, v/v), umieszczonego w 50 ml probówce wirówkowej Oak Ridge z zakrętką zabezpieczoną parafilmem, w łaźni wodnej o temperaturze 65°C.
2. Gotować 0,5 objętości buforu do lizy (2% SDS, 16 mM EDTA i 200 mM NaCl)⁶, umieszczonego w 50 ml stożkowej probówce polipropylenowej, przez 5 minut.
3. Dodać gotujący się bufor do lizy do zawartości światła kątnicy. Homogenizować. Gotować przez 5 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex.
4. Przenieść próbkę zawartości kątnicy/buforu do lizy o temperaturze 100°C do kwasowego fenolu/chloroformu o temperaturze 65°C w probówce wirówkowej Oak Ridge. Zakrętkę zabezpieczyć parafilmem.
5. Inkubować w temperaturze 65°C przez 10 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex (co 2 minuty).
6. Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut.
7. Ostrożnie przenieść fazę wodną (unikając białego interfejsu) do nowej 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Objętość fazy wodnej będzie wynosić ok. 50% całkowitej objętości zawartości kątnicy, buforu do lizy i kwasowego fenolu/chloroformu. Dodać równą objętość kwasowego fenolu/chloroformu.
8. Zakrętkę zabezpieczyć parafilmem i dokładnie wymieszać za pomocą wirówki typu vortex z wysoką prędkością.
9. Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut.
10. Powtarzać kroki od 3.7 do 3.9, aż do czasu, gdy między fazą wodną a organiczną nie będzie widoczny biały interfejs.
11. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylkowego (24:1, v/v).
12. Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex.
13. Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut. Przenieść fazę wodną (objętość będzie wynosić ok. 50% całkowitej objętości reakcji) do 15 ml stożkowej probówki polipropylenowej i dodać równą objętość izopropanolu.
14. Inkubować w temperaturze -20° przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
15. Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 45 minut. Na dnie probówki utworzy się żelowaty osad. Usunąć nadosad.
16. Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu. Wymieszać na wirówce typu vortex. Wirować próbkę z prędkością 10,000 g w temperaturze 4° przez 5 minut.
17. Usunąć nadosad i odwrócić probówkę, aby osad wysychał w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
18. Resuspendować osad RNA w 200 μl wody wolnej od RNaz.

4. Traktowanie DNazą (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)

1. Dodać 20 μl 10X buforu Turbo DNase oraz 2 μl Turbo DNase i delikatnie wymieszać.
2. Inkubować w temperaturze 37° przez 20 minut.
3. Dodać 20 μl resuspenderowanego odczynnika do inaktywacji DNazy i dobrze wymieszać.
4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, mieszając sporadycznie.
5. Wirować przy 10 000 g w temperaturze pokojowej przez 1,5 minuty, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrowirowania.
6. Dodać jedną objętość zimnego (4°) kwasowego fenolu/chloroformu i dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę.
7. Wirować przy 12 500 g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
8. Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać 1 objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (49:1 v/v), następnie wymieszać w wirówce typu vortex.
9. Wirować przy 12 500 g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
10. Przenieść fazę wodną (około 50% całkowitej objętości reakcji) do nowej probówki.
11. Dodać 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,5) oraz 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu. Wymieszać w wirówce typu vortex.
12. Inkubować w temperaturze -20° przez co najmniej 2 godziny lub w -80° przez 30 minut.
13. Wirować przy 12 000 g przez 30 minut w temperaturze 4°.
14. Usunąć nadsącz.
15. Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu, wirując przez 5 minut przy 10 000 g w temperaturze 4°.
16. Usunąć nadsącz i suszyć na powietrzu przez 10 minut.
17. Resuspenderować osad w 100 μl wody wolnej od RNaz. Może być konieczne umieszczenie probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 65°, aby resuspenderować i rozpuścić osad.
18. Aby sprawdzić skuteczność traktowania DNazą, można przeprowadzić standardową reakcję RT-PCR w celu amplifikacji białka rybosomalnego (lub innego genu referencyjnego) dla próbek traktowanych i nietraktowanych, stosując kontrole bez RT.

5. Etap oczyszczania RNA (Qiagen, zestaw RNeasy)

1. Należy zapoznać się z stronami 56-57 podręcznika Qiagen RNeasy Mini Handbook (4^th Edition, kwiecień 2006). Postępować zgodnie z instrukcjami.

6. Reprezentatywne wyniki

Ilość całkowitego bakteryjnego RNA odzyskanego przy użyciu tego protokołu wynosi około 2-3 μg z dwóch kątnic. Odzyskane RNA posiada wystarczającą ilość i jakość do późniejszych eksperymentów qPCR, profilowania transkrypcyjnego oraz RNA Seq. Czystość RNA jest rutynowo oceniana poprzez pomiar stosunku 260nm/280nm⁷ próbki, jednak metoda ta nie dostarcza informacji o integralności RNA. Agilent Bioanalyzer to platforma oparta na mikrofluidyce służąca do określania wielkości, kwantyfikacji i kontroli jakości DNA, RNA, białek i komórek; wykorzystuje ona wskaźnik integralności RNA znany jako RNA Integrity Number (RIN)⁸. RNA ekstrahowane zgodnie z tym protokołem daje stosunki 260/280 w zakresie od 1.7 do 2.0 oraz wartości RIN ≥ 7.0. Przykład analizy bakteryjnego RNA odzyskanego tym protokołem za pomocą Agilent Bioanalyzer przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1. Elektroferogram z Agilent Bioanalyzer oraz obraz przypominający żel dla próbki całkowitego RNA Pseudomonas aeruginosa wyizolowanego i odzyskanego z treści kątnicy myszy. RIN 8.0.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda ekstrakcji RNA pozwala na odzyskanie wystarczającej ilości wysokiej jakości całkowitego RNA Pseudomonas aeruginosa pobranego z przewodu pokarmowego myszy. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do P. aeruginosa i potencjalnie może być zastosowana do innych bakterii. Odzyskiwanie wystarczającej liczby mikroorganizmów z jelit będzie się znacznie różnić w zależności od gatunku. W naszym modelu mysim P. aeruginosa zazwyczaj kolonizuje przewód pokarmowy myszy na poziomach od 5 x 10⁷ do 5 x 10⁸ cfu/g kału⁴. Ponieważ odzyskana treść kątnicy waży około 0,5 grama, szacowana liczba P. aeruginosa odzyskana z dwóch kątnic wynosi od 5 x 10⁷ do 5 x 10⁸ cfu. W przypadku użycia innych mikroorganizmów zasadne byłoby zweryfikowanie poziomów kolonizacji przewodu pokarmowego, a następnie obliczenie liczby kątnic niezbędnych do odzyskania docelowej liczby cfu. Należy również zauważyć, że przy zastosowaniu tego konkretnego modelu mysiego, u myszy leczonych antybiotykami i niezakażonych PA nie izoluje się mierzalnych ilości RNA z treści kątnicy.

Nasz mysi model kolonizacji i rozprzestrzeniania się Pseudomonas aeruginosa w przewodzie pokarmowym ma na celu odwzorowanie patogenezy bakteriemii wywołanej przez P. aeruginosa u pacjentów z nowotworami oraz osób po przeszczepieniu komórek macierzystych. W tej populacji pacjentów flora komensalna jest często zubożona w wyniku leczenia antybiotykami lub chemioterapią (np. antybiotykowe wyniszczenie komensalnej flory przewodu pokarmowego), co prowadzi do nadmiernego rozrostu drobnoustrojów patogennych (np. monoasocjacji z P. aeruginosa), a następnie do ich rozprzestrzeniania się po immunosupresji. Zalety i ograniczenia tego mysiego modelu zostały omówione we wcześniejszych publikacjach⁴. Celem niniejszego badania jest przedstawienie metodologii izolacji całkowitego RNA mikrobiologicznego z przewodu pokarmowego. Niniejszy protokół można łatwo zaadaptować do innych modeli mysich służących do badania innych aspektów patogenezy mikrobiologicznej w przewodzie pokarmowym (np. interakcji flory komensalnej, wpływu bakterii na nieswoiste zapalne choroby jelit itp.).

Zaletą tej metody jest zastosowanie wielu etapów lizy, w tym cykli zamrażania i rozmrażania, rozrywania mechanicznego (rozcierania w moździerzu, homogenizacji), gotowania oraz lizy chemicznej (np. SDS). Pomimo licznych etapów lizy, niektóre mikroorganizmy (zwłaszcza bakterie Gram-dodatnie oraz grzyby/drożdże) mogą wymagać dodatkowego rozrywania mechanicznego. Po inkubacji w warunkach gorącej lizy z fenolem i chloroformem w środowisku kwasowym (Krok 3.5), dodanie kulek (0,1 mm dla bakterii i/lub 0,5-0,7 mm dla drożdży) oraz następujący po tym etap homogenizacji kulkowej powinny być wystarczające do lizy tych organizmów^{9, 10}.

Ze względu na złożony charakter materiałów pozyskiwanych z kąkolicznicy mysiej, wielokrotne zimne ekstrakcje kwasem fenolowym/chloroformem (Krok 3.7 do 3.9) są absolutnie niezbędne do uzyskania akceptowalnej jakości i integralności RNA do dalszych reakcji. Może być wymagane przeprowadzenie od 3 do 5 zimnych ekstrakcji kwasem fenolowym/chloroformem, zanim biała warstwa przejściowa między fazą wodną a organiczną zostanie całkowicie usunięta. Ostatecznie, połączenie traktowania DNazą (Krok 4) oraz protokołu oczyszczania RNeasy (Krok 5) jest niezbędne do usunięcia zanieczyszczeń w postaci DNA oraz małych cząsteczek niebędących mRNA (5s i tRNA). Jak wspomniano wcześniej, RNA odzyskane przy użyciu niniejszego protokołu charakteryzuje się ilością i jakością wystarczającą do późniejszych eksperymentów z profilowaniem transkrypcyjnym ³, qPCR (nieopublikowano) oraz RNA Seq (nieopublikowano).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Moździerz i tłuczek	Fisher Scientific	12-947-1
Homogenizator	Omni	TM-125
Probówki wirówkowe Oak Ridge (50 ml)	Nalge Nunc international	3119-0050
Kwasowy fenol/chloroform	Ambion	AM9720
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Alkohol izoamylkowy	Sigma-Aldrich	W205702
Izopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Węglan diethylopirokarbonianu (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
DNaza	Ambion	AM2238
Zestaw RNeasy	Qiagen	74104
3M octan sodu	Ambion	AM9740
100% etanol	Sigma-Aldrich	E7023