Zadania wymuszonej alternacji w labiryncie T oraz dyskryminacji lewo-prawo w celu oceny pamięci operacyjnej i referencyjnej u myszy

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia protokół testów w labiryncie T z wykorzystaniem zmodyfikowanego zautomatyzowanego aparatu do oceny funkcji uczenia się i pamięci u myszy.

Streszczenie

Zadania wymuszonej alternacji oraz dyskryminacji lewo-prawo z wykorzystaniem labiryntu w kształcie litery T są powszechnie stosowane do oceny odpowiednio pamięci operacyjnej i referencyjnej u gryzoni. W naszym laboratorium oceniliśmy te dwa rodzaje pamięci u ponad 30 szczepów genetycznie zmodyfikowanych myszy, korzystając z zautomatyzowanej wersji tego urządzenia. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowany aparat T-maze sterowany komputerowo z systemem śledzenia wideo oraz nasze protokoły w formie filmu. Aparatura T-maze składa się z korytarzy oddzielonych przesuwnymi drzwiami, które mogą automatycznie otwierać się w dół; każdy z nich posiada boks startowy, alejkę w kształcie litery T, dwa boksy z automatycznymi dozownikami peletu po jednej stronie oraz dwie alejki w kształcie litery L. Każda alejka w kształcie litery L jest połączona z boksem startowym w taki sposób, aby myszy mogły do niego powrócić, co eliminuje wpływ manipulacji eksperymentatora na zachowanie zwierząt. Urządzenie to ma również tę zaletę, że podczas wykonywania zadania w labiryncie T-maze można przeprowadzać techniki mikrodializy in vivo, elektrofizjologii in vivo oraz optogenetyki, ponieważ drzwi są zaprojektowane tak, aby chować się w podłodze. W niniejszym artykule filmowym opisujemy zadania w labiryncie T-maze z wykorzystaniem zautomatyzowanej aparatury oraz wyniki tych zadań u myszy α-CaMKII+/-, o których donoszono, że wykazują deficyty pamięci operacyjnej w teście labiryntu radialnego ośmioramiennego. Nasze dane wskazują, że myszy α-CaMKII+/- wykazywały deficyt pamięci operacyjnej, ale nie wykazywały zaburzeń pamięci referencyjnej, co jest zgodne z wcześniejszymi odkryciami uzyskanymi w teście labiryntu radialnego ośmioramiennego i potwierdza poprawność naszego protokołu. Ponadto nasze dane wskazują, że mutanty miały tendencję do wykazywania deficytów w uczeniu odwróceniu, co sugeruje, że niedobór α-CaMKII powoduje zmniejszoną elastyczność behawioralną. Zatem test T-maze z wykorzystaniem zmodyfikowanej aparatury automatycznej jest użyteczny do oceny pamięci operacyjnej, referencyjnej oraz elastyczności behawioralnej u myszy.

Protokół

1. Konfiguracja aparatury

1. Automatyczny zmodyfikowany aparat do labiryntu w kształcie litery T (O’HARA & Co., Tokio, Japonia) składa się z białych plastikowych korytarzy z ściankami o wysokości 25 cm¹. Labirynt jest podzielony na 6 obszarów (A1, A2, S1, S2, P1, P2) za pomocą przesuwnych drzwi (s1, s2, s3, a1, a2, p1, p2) (Rycina 1), które mogą być automatycznie otwierane w dół. Trzon litery T tworzy obszar S2 (13 x 24 cm), a ramiona litery T stanowią obszary A1 i A2 (11,5 x 20,5 cm). Obszary P1 i P2 stanowią przejścia łączące ramię (obszar A1 lub A2) z komorą startową (obszar S1).
2. Koniec każdego ramienia jest wyposażony w dozownik peletek, który automatycznie podaje peletkę sacharozy (20 mg, Formula 5 TUT, TestDiet, Richmond, IN, USA) w ramach nagrody. Pobranie peletki przez mysz jest wykrywane przez czujnik podczerwieni i automatycznie rejestrowane przez komputer.
3. Kamera CCD (Charge Coupled Device) jest zamontowana nad aparatem w celu monitorowania zachowania myszy, a obrazy aparatu i myszy są rejestrowane przez komputer.
4. Aparat do labiryntu T należy w miarę możliwości umieścić w wygłuszonej pomieszczeniu (170 x 210 x 200 cm, O’HARA & Co., Tokio, Japonia). W naszym laboratorium aparat jest oświetlony lampami fluorescencyjnymi o natężeniu 100 lux. Natężenie światła może być niższe niż ten poziom, ale powinno być utrzymywane na stałym poziomie podczas wszystkich eksperymentów.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Umieść od dwóch do czterech myszy w klatce w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą (23±2°C) i 12-godzinnym cyklem światło/ciemność (światło włączone o 7:00), zgodnie z wytycznymi i protokołami ustanowionymi przez lokalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt.
2. Przenieś wszystkie klatki z myszami z pomieszczenia mieszkalnego do pomieszczenia dźwiękoszczelnego co najmniej 30 min przed rozpoczęciem pierwszej próby.
3. Wszystkie eksperymenty powinny być zawsze przeprowadzane w tym samym przedziale czasowym (np. od 9:00 do 18:00). W okresie testowania osobniki z każdego genotypu lub warunku eksperymentalnego powinny być badane w kolejności zbalansowanej, ponieważ pora dnia może mieć potencjalny wpływ na wyniki wykonywanego zadania.

3. Ograniczenie pokarmu

1. Do rozpoczęcia eksperymentu zapewnić myszom swobodny dostęp do standardowej karmy w postaci peletu oraz wody.
2. Na tydzień przed rozpoczęciem sesji wstępnych należy codziennie ważyć myszy i karmić je standardowym peletem tak, aby przez cały czas trwania eksperymentu utrzymywały od 80% do 85% masy ciała uzyskiwanej przy swobodnym dostępie do pokarmu.
3. Do czasu rozpoczęcia sesji wstępnych, oprócz standardowej karmy w klatkach domowych, należy codziennie podawać każdej myszy osiem granulek sacharozy w celu przyzwyczajenia zwierząt do tego pokarmu.

4. Habituacja do aparatury i wstępny trening

1. Umieść sześć sacharozowych peletek dla każdej myszy w centrum każdego z sześciu przedziałów aparatury oraz umieść jedną peletkę w każdej taczce dozownika pokarmu.
2. Przenieś wszystkie myszy z klatki do aparatury i pozwól im na swobodną eksplorację urządzenia przy wszystkich otwartych drzwiach przez 30 min.
3. Od 1 dnia po habituacji myszy są poddawane codziennemu wstępnemu treningowi. Przy wszystkich zamkniętych drzwiach i peletce umieszczonej w tacy z pokarmem, umieść mysz w obszarze A1. Jeśli mysz zje peletkę lub upłynie 5 min, przenieś mysz do obszaru A2 i ponownie rozpocznij wstępny trening. Takie szkolenie powtarza się pięć razy dziennie i kontynuuje do momentu, aż myszy zjedzą ponad 80% peletek.
4. Po zakończeniu sesji wstępnego treningu myszy są poddawane albo zadaniu wymuszonej alternacji, albo zadaniu dyskryminacji lewo-prawo.

5. Zadanie wymuszanej naprzemienności

1. W zadaniu wymuszonej alternacji każda próba składa się z serii wymuszonego wyboru, po której następuje seria wolnego wyboru.
2. Uruchom program aplikacji (Image TM) w celu rozpoczęcia zadania i umieść mysz w komorze startowej (obszar S1).
3. Kliknij przycisk start, aby rozpocząć serię wymuszonego wyboru. W tej serii otwierane są drzwi komory startowej (drzwi s2) oraz drzwi albo obszaru A1 (drzwi a1), albo obszaru A2 (drzwi a2), a do tacki z pokarmem w obszarze z otwartymi drzwiami automatycznie dostarczana jest sacharoza w formie peletu. Mysz może wejść do obszaru i zjeść pelet. Po zjedzeniu peletu otwierane są drzwi przy tackce z pokarmem w ramieniu, w którym aktualnie znajduje się mysz (drzwi p1 lub p2). Następnie, gdy mysz zbliży się do drzwi (s1 lub s3) sąsiadujących z komorą startową, drzwi p1 lub p2 zostają zamknięte, a drzwi s1 (lub s3) otwarte, aby mysz mogła powrócić do komory startowej. Jeśli mysz nie zje peletu w ciągu 30 sec, odpowiedź zostaje zarejestrowana jako „błąd pominięcia” (Omission Error). Następnie pelet jest automatycznie usuwany z tacki z pokarmem, a drzwi ramienia, w którym znajduje się mysz (p1 lub p2), zostają otwarte, co umożliwia myszy powrót do komory startowej.
4. Po serii wymuszonego wyboru automatycznie rozpoczyna się seria wolnego wyboru. Otwierane są drzwi s2 oraz oba drzwi a1 i a2. Mysz może wybrać jedno z dwóch ramion. Jeśli mysz wejdzie do ramienia przeciwnego do tego, do którego została zmuszona w serii wymuszonego wyboru, jej odpowiedź jest uznawana za „poprawną” (Correct), a mysz otrzymuje pelet sacharozy. Jeśli mysz nie zje peletu w ciągu 30 sec, odpowiedź jest rejestrowana jako „błąd pominięcia” (Omission Error), a pelet jest automatycznie usuwany z tacki z pokarmem. Jeśli mysz wejdzie do tego samego ramienia, które odwiedziła w zadaniu wymuszonego wyboru, zostaje uwięziona w tym obszarze na 10 sec w ramach kary (odpowiedź „błąd” – Error). Następnie otwierane są drzwi p1 (lub s1) i p2 (lub s3), a mysz może powrócić do komory startowej.
5. Mysz poddawana jest 10 następującym po sobie próbom w jednej sesji dziennie (czas maksymalny, 50 min). Myszy kontrolne są trenowane codziennie do osiągnięcia średniej grupowej 80% poprawnych odpowiedzi w sesji. Średnia grupowa poprawnych odpowiedzi jest obliczana poprzez wyciągnięcie średniej z procentu poprawnych odpowiedzi każdej myszy w sesji w każdej grupie.
6. Po wytrenowaniu myszy kontrolnych i/lub eksperymentalnych do poziomu kryterium, można przeprowadzić dalsze testy w zadaniu alternacji opóźnionej, wprowadzając 3-, 10-, 30- lub 60-s opóźnienia między serią wymuszonego wyboru a serią wolnego wyboru.
7. Po każdej sesji należy zwrócić myszy do ich klatki domowej i wyczyścić aparat wodą z kwasem podchlorawym (pH 6-7), aby zapobiec błędom wynikającym z sygnałów zapachowych.

6. Zadanie dyskryminacji lewo-prawo

1. W zadaniu dyskryminacji lewo-prawo każda mysz wykonuje serię 10 lub 20 prób z wolnym wyborem. Pelet z sacharozą jest zawsze dostarczany do tacki z pokarmem w jednym z ramion, mianowicie w ramieniu docelowym. Myszy muszą nauczyć się wchodzić do ramienia docelowego. Lokalizacja ramienia docelowego jest niezmienna w kolejnych próbach i sesjach oraz jest zbalansowana pomiędzy myszami kontrolnymi a eksperymentalnymi.
2. Uruchom program aplikacji (Image TM) przed rozpoczęciem zadania i umieść mysz w skrzynce startowej (obszar S1).
3. Kliknij przycisk start, aby rozpocząć serię z wolnym wyborem. W tej serii drzwi s2 oraz obie drzwi a1 i a2 zostają otwarte, a dozownik peletu automatycznie dostarcza pelet do tacki z pokarmem w ramieniu docelowym. Myszy mogą swobodnie wybierać między ramieniem lewym a prawym. Wejście myszy do ramienia docelowego uznaje się za poprawną odpowiedź. Jeśli mysz zje pelet lub upłynie 30 sec, otwiera się drzwi p1 (lub p2). Gdy mysz zbliży się do skrzynki startowej, przechodząc przez obszar P1 (lub P2), otwiera się drzwi s1 (lub s3), aby mysz mogła powrócić do skrzynki startowej.
4. Mysz jest zazwyczaj poddawana od 10 do 20 następujących po sobie prób w jednej sesji dziennie (czas graniczny, 50 min). Myszy kontrolne są trenowane codziennie, aż osiągną średnią grupową 80% poprawnych odpowiedzi w sesji. Średnia grupowa poprawnych odpowiedzi jest obliczana poprzez uśrednienie % poprawnych odpowiedzi każdej myszy w sesji w każdej grupie.
5. Po osiągnięciu przez myszy kryterium można przeprowadzić dodatkowe sesje w celu oceny pamięci retencyjnej i ponownego uczenia się poprzez wprowadzenie przerwy kilku tygodni między sesjami lub w celu oceny elastyczności behawioralnej poprzez umieszczenie nagrody w przeciwległym, wcześniej nieprzynętowanym ramieniu (tzn. uczenie odwrócenie), zgodnie z potrzebami.
6. Po każdej sesji zwróć myszy do ich klatki domowej i wyczyść aparat wodą z podchlorynem (pH 6-7), aby zapobiec wystąpieniu preferencji opartych na wskazówkach węchowych.

7. Analiza obrazu

1. Zachowania w aparaturze T-maze są rejestrowane za pomocą kamery wideo podłączonej do komputera, a obraz jest zapisywany w formacie TIFF. Aplikacja wykorzystywana do pozyskiwania i analizy danych behawioralnych (Image TM) opiera się na programie Image J z domeny publicznej (opracowanym przez Wayne'a Rasbanda w National Institute of Mental Health i dostępnym pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), który został zmodyfikowany przez Tsuyoshiego Miyakawę (dostępny za pośrednictwem O'HARA & Co., Tokio, Japonia).
2. Program Image TM automatycznie generuje pliki tekstowe zawierające procent poprawnych odpowiedzi, latencję (sec) do zakończenia sesji, dystans pokonany podczas sesji oraz liczbę błędów z pominięcia w sesji. Generowane i zapisywane są również obrazy ścieżek ruchu myszy, surowe dane o pozycji oraz surowe dane o odpowiedziach (poprawna, pominięcie lub błąd) dla każdego przejścia.

8. Analiza statystyczna

Każdy zestaw danych behawioralnych należy poddać dwuczynnikowej analizie wariancji z powtarzanymi pomiarami (WARUNEK EKSPERYMENTALNY (np. GENOTYP) x SESJA lub WARUNEK EKSPERYMENTALNY x OPÓŹNIENIE).

9. Reprezentatywne wyniki

Przykład wyników w labiryncie T dla samców myszy α-CaMKII+/- oraz ich kontrolnych rodzeństwa typu dzikiego (tło C57BL/6J) (wiek 11-18 tygodni, n=10 na grupę dla zadania wymuszonej alternacji lub dyskryminacji lewo-prawo) przedstawiono na Ryc. 2-4. Ze względu na to, że myszy α-CaMKII+/- wykazują wysoki poziom agresji wobec współlokatorów z klatki^2,3, zarówno mutanty, jak i myszy kontrolne były po odsadzeniu utrzymywane pojedynczo w plastikowych klatkach (22.7 x 32.3 x 12.7 cm). Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zdrowia Fujita.

W zadaniu wymuszonej naprzemienności myszy kontrolne będą stopniowo uczyć się dokonywania prawidłowych wyborów i zazwyczaj osiągają kryterium średnio 80% poprawnych odpowiedzi w ciągu około 1 do 2 tygodni (Rysunek 2A). W porównaniu z myszami kontrolnymi, myszy α-CaMKII+/- wykazały znacznie niższy procent poprawnych odpowiedzi (GENOTYPE: F(1,18)=29,04, p<0,0001), krótszy czas latencji (GENOTYPE: F(1,18)=8,88, p=0,008; GENOTYPE x SESSION: F(9,162)=2,24, p=0,0218) oraz pokonały krótszy dystans (GENOTYPE: F(1,18)=8,67, p=0,0086; GENOTYPE x SESSION: F(9,162)=3,19, p=0,0014) niż myszy kontrolne (Rysunek 2A, B i C). Nie stwierdzono istotnego wpływu genotypu na liczbę błędów pominięcia (Rysunek 2D). Ponadto, w zadaniu opóźnionej naprzemienności, procent poprawnych wyborów u myszy α-CaMKII+/- był znacznie niższy niż u myszy typu dzikiego przy każdym czasie opóźnienia (GENOTYPE: F(1,18)=38,781, p<0,0001; DELAY: F(3,54)=8,074, p=0,0002; GENOTYPE x DELAY: F(3,54)=0,223, p=0,88; Rysunek 3). Wyniki te wskazują, że mutanty wykazały upośledzoną sprawność w porównaniu z myszami kontrolnymi, mimo że myszy mutanty mogły wykonywać zadanie szybciej niż grupa kontrolna, co sugeruje, że niedobór α-CaMKII indukuje deficyt pamięci operacyjnej.

W zadaniu dyskryminacji lewo-prawo procentowe udziały poprawnych wyborów u mutantów α-CaMKII+/- stopniowo wzrastały w kolejnych sesjach, podobnie jak u myszy kontrolnych (Rysunek 4A). Ponadto, po wprowadzeniu miesięcznej przerwy między sesjami, nie stwierdzono istotnych różnic w procencie poprawnych odpowiedzi między myszami mutantami a kontrolnymi. Podobnie jak w zadaniu wymuszonej alternacji, mutanty α-CaMKII+/- wykazały istotnie krótszy czas latencji do zakończenia sesji (GENOTYPE: F(1,18)=12,12, p=0,0027) oraz krótszy dystans przebyty w aparaturze podczas sesji (GENOTYPE: F(1,18)=25,08, p<0,0001; GENOTYPE x SESSION: F(15,270)=2,83, p=0,0004) niż myszy kontrolne w trakcie sesji treningowych (Rysunek 4B i C). Dane te wskazują, że niedobór α-CaMKII nie wpływa na pamięć referencyjną ocenianą w tym zadaniu. Jednakże w sesjach uczenia odwróconego mutanty α-CaMKII+/- wykazały istotnie niższy procent poprawnych odpowiedzi (GENOTYPE: F(1,18)=10,92, p=0,0039; GENOTYPE x SESSION: F(5,90)=5,54, p=0,0002; Rysunek 4A) i częściej popełniały błędy pominięcia (GENOTYPE: F(1,18)=17,12, p=0,0006; Rysunek 4D) niż myszy kontrolne. Wyniki te sugerują, że myszy mutanty α-CaMKII+/- charakteryzują się obniżoną elastycznością behawioralną.

Rycina 1. (A) Aparatura typu T-maze do zadań wymuszonej alternacji oraz dyskryminacji lewo-prawo. Rycina cytowana z Takao et al. (2008). (B) Obraz został zarejestrowany przez kamerę CCD zamontowaną nad aparaturą. Labirynt T-maze jest podzielony na 6 obszarów (A1, A2, S1, S2, P1, P2) za pomocą przesuwnych drzwi (s1, s2, s3, a1, a2, p1, p2). (C) Konfiguracja i orientacja aparatury oraz wskazówek poza labiryntem w dźwiękoszczelnym pomieszczeniu. Dwie aparatury są ustawione w tym samym kierunku w stronę ściany w dźwiękoszczelnym pomieszczeniu, a w pomieszczeniu znajdują się obiekty, takie jak drzwi, lampy fluorescencyjne na suficie, ściany, kamery CCD aparatury oraz regały na klatki dla myszy.

Rysunek 2. Zadanie wymuszonej alternacji w labiryncie T. Myszy przechodziły 10 prób dziennie w każdej sesji. Dane dotyczące (A) procentu poprawnych odpowiedzi, (B) czasu reakcji (sec), (C) przebytej odległości (cm) oraz (D) liczby błędów pominięcia przedstawiono jako średnie z błędami standardowymi dla każdego bloku dwóch sesji; analizy wykonano za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami. Myszy α-CaMKII+/- wykazały niższy procent poprawnych odpowiedzi (p<0.0001), krótszy czas reakcji (p=0.008) oraz przebyły krótszą odległość (p=0.0086) w kolejnych sesjach w porównaniu do myszy kontrolnych.

Rysunek 3. Zadanie wymuszonej alternacji w labiryncie T z opóźnieniami wynoszącymi 3, 10, 30 i 60 s. Około 24 h po ostatniej sesji treningowej myszy poddano pięciu sesjom z opóźnieniem. Procent poprawnych odpowiedzi dla każdego opóźnienia przedstawiono jako średnie z błędami standardowymi, a analizy wykonano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami. Myszy α-CaMKII+/- wykazały niższy procent poprawnych odpowiedzi niż myszy kontrolne przy każdym czasie opóźnienia (p<0.0001).

Rysunek 4. Zadanie dyskryminacji lewo-prawo w labiryncie T. Myszy przechodziły codziennie od 10 do 20 prób w jednej sesji. Dane dotyczące (A) procentu poprawnych odpowiedzi, (B) latencji (sec), (C) przebytego dystansu (cm) oraz (D) liczby błędów pominięcia przedstawiono jako średnie z błędami standardowymi dla każdego bloku 20 prób, które przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami. Podczas początkowych sesji treningowych oraz sesji ponownego uczenia się przeprowadzonych miesiąc po ostatniej sesji treningowej, procent poprawnych odpowiedzi nie różnił się istotnie między myszami mutantami α-CaMKII+/- a myszami kontrolnymi. Myszy mutanty wykazały jednak istotnie niższy procent poprawnych odpowiedzi niż myszy kontrolne podczas sesji uczenia odwróconego (p=0.0039).

Dyskusja

Zadania wymuszonej alternacji oraz dyskryminacji lewo-prawo z wykorzystaniem labiryntu w kształcie litery T są powszechnie stosowane do oceny odpowiednio pamięci operacyjnej i referencyjnej u gryzoni^4,5. W zadaniach w labiryncie T wiadomo, że gryzonie mogą stosować różne strategie w celu wykonania zadań, opierając się na wskazówkach przestrzennych i nieprzestrzennych, takich jak wskazówki poza labiryntem, konfiguracja wskazówek w pomieszczeniu, orientacja labiryntu i tak dalej^6,7,8. Orientacja labiryntu w pomieszczeniu i jego stabilność, obecność lub brak polaryzujących wskazówek w pomieszczeniu oraz zdolność gryzoni do dostrzegania wskazówek w otoczeniu mogą wpływać na stosowane strategie. W związku z tym badacze podczas prowadzenia eksperymentu i interpretacji danych behawioralnych muszą wziąć pod uwagę konfigurację i orientację aparatury oraz wskazówek w pomieszczeniu. W naszym laboratorium ustawiamy dwa aparaty skierowane w tym samym kierunku w stronę ściany w wygłuszonej pomieszczeniu i rozmieszczamy obiekty, takie jak drzwi do pomieszczenia, lampy fluorescencyjne na suficie, ściany pomieszczenia, kamery CCD aparatów oraz regały na klatki dla myszy, które mogą służyć jako przestrzenne wskazówki poza labiryntem dla myszy (patrz Rysunek 1C).

W wielu przypadkach testy w labiryncie w kształcie litery T były przeprowadzane ręcznie przez eksperymentatora w następujący sposób: w każdej próbie eksperymentator umieszcza pellet sacharozy na tacy z pokarmem i otwiera gilotynowe drzwi aparatury, aby rozpocząć test. Następnie, gdy mysz wejdzie do jednego z ramion, eksperymentator zamyka drzwi, rejestruje zachowanie myszy i ręcznie przenosi ją z ramienia do skrzynki startowej. Możliwe zmienne zakłócające, takie jak interakcja między manipulowaniem zwierzęciem a genotypem myszy lub warunkami eksperymentalnymi, mogą wpływać na wyniki w labiryncie T. W ciągu ostatniej dekady stosowano zmodyfikowany test w labiryncie T dla zadania ciągłej alternacji, który nie wymaga ręcznego przenoszenia obiektu z ramienia docelowego z powrotem do skrzynki startowej.^9-11 Nawet gdy aparatura, protokoły testowe i wiele zmiennych środowiskowych są rygorystycznie ujednolicone, zestandaryzowane testy behawioralne nie zawsze dają podobne wyniki w różnych laboratoriach^12,13. Konkretni eksperymentatorzy przeprowadzający testy mogą być specyficzni dla każdego laboratorium i mogą również wpływać na zachowanie myszy. Ponadto ludzki eksperymentator jest zazwyczaj podatny na błędy, takie jak niewłaściwe umieszczenie pelletu sacharozy, otwarcie lub zamknięcie innych drzwi, a także pomyłki w śledzeniu numeru próby i mierzeniu czasu. Aby zmniejszyć wpływ zmiennych zakłócających i występowanie błędów ludzkich, opracowaliśmy i zastosowaliśmy zautomatyzowaną aparaturę labiryntu T sterowaną systemem śledzenia wideo z programem Image TM. Udoskonalona aparatura labiryntu T posiada również zalety, które pozwalają nam na stosowanie technik mikrodializy, elektrofizjologii i optogenetyki podczas wykonywania zadania w labiryncie T, ponieważ drzwi są zaprojektowane tak, aby chować się w podłodze. Tym samym zautomatyzowana aparatura jest użytecznym narzędziem ułatwiającym badania nad neurobiologią pamięci operacyjnej i referencyjnej u gryzoni.

W celu umożliwienia automatycznego i następującego po sobie wykonania serii prób w jednej sesji, nasze protokoły mogą wiązać się z pewnymi potencjalnymi wadami. Na przykład w zadaniu wymuszonej alternacji czas powrotu myszy z A1 lub A2 do S1 mógłby potencjalnie wpłynąć na ich wyniki. Może to jednak nie być poważnym problemem, ponieważ samo przebywanie w obszarze P1 lub P2 może stanowić wskazówkę przestrzenną, a długi lub krótki pobyt w którymkolwiek z tych obszarów podczas próby z wymuszonym wyborem może nie zmieniać obciążenia pamięci. Innym potencjalnym problemem jest możliwość wykorzystania przez myszy śladów zapachowych zamiast przestrzennej pamięci operacyjnej. Jednak po kilku próbach ślady zapachowe mogłyby zostać wielokrotnie nadpisane, co utrudniłoby ich wykorzystanie jako wskazówek. Ponadto w zadaniu dyskryminacji światła po lewej stronie ślady zapachowe mogą służyć myszom jako wskazówki węchowe do odnalezienia lokalizacji nagrody w kolejnych próbach. Wskazówki te mogłyby wpływać na proces uczenia się i zapamiętywania w trakcie prób w obrębie sesji, co potencjalnie może stanowić problem. Jednak myszy nie mogą stosować strategii śladu zapachowego w pierwszej próbie sesji, zatem wyniki pierwszych prób służyłyby jako wskaźnik wolny od potencjalnego wykorzystania strategii śladu zapachowego.

Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, procent poprawnych odpowiedzi u myszy kontrolnych C57BL/6J stopniowo wzrastał w kolejnych sesjach w obu zadaniach. Wyniki te potwierdzają, że myszy C57BL/6J potrafią nauczyć się dokonywania poprawnych wyborów w zmodyfikowanym automatycznym labiryncie w kształcie litery T. W niniejszym badaniu myszy utrzymywały poziom około 80% poprawnych wyborów i nie przekroczyły go nawet po intensywnym treningu (patrz Rysunek 2A). Biorąc pod uwagę, że w trakcie treningów stale występowały pewne błędy pominięcia, motywacja myszy mogła być niewystarczająco wysoka, aby osiągnęły wyższy poziom wydajności. W zadaniu wymuszonej alternacji myszy α-CaMKII+/- wykazały niższy odsetek poprawnych odpowiedzi niż myszy kontrolne. Zatem myszy mutanty wykazywały upośledzoną wydajność w tym zadaniu w porównaniu z myszami kontrolnymi. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi ustaleniami uzyskanymi w teście radialnego labiryntu ośmioramiennego^2,14, dostarczając dalszych dowodów na to, że niedobór α-CaMKII wywołuje deficyty pamięci roboczej oraz że zadanie wymuszonej alternacji w zautomatyzowanym aparacie labiryntu T precyzyjnie wykrywa deficyty pamięci roboczej u myszy mutantów. W zadaniu dyskryminacji lewo-prawo wyniki wskazują, że niedobór α-CaMKII nie wpływa na pamięć referencyjną. Jednakże, jak pokazano w wynikach sesji uczenia odwróconego, niedobór α-CaMKII może ograniczać elastyczność behawioralną. Myszy mutanty wykazały również więcej błędów pominięcia niż myszy kontrolne podczas sesji uczenia odwróconego. Wzrost liczby błędów pominięcia mógł ograniczyć możliwość nauki tego, które ramię jest powiązane z nagrodą. Zatem opóźnione nabywanie umiejętności uczenia się mogło wynikać ze zwiększenia liczby błędów pominięcia podczas początkowych sesji, a nie z upośledzenia uczenia odwróconego. Inną możliwością jest to, że mutanty mogły być zdezorientowane zmianą reguł, co mogło wywołać błędy pominięcia i zakłócić funkcje wykonawcze. W związku z tym, aby wyciągnąć uzasadniony wniosek, należy badać błędy pominięcia tak samo, jak procent poprawnych wyborów.

Program Image TM generuje dodatkowe wyniki dotyczące latencji i dystansu przebytego do zakończenia sesji, a także procentu poprawnych odpowiedzi i liczby błędów pominięcia. Różnice w latencji i dystansie przebytym do zakończenia sesji można interpretować jako różnice w poziomie aktywności lokomotorycznej, impulsywnej tendencji do wyboru ramion, motywacji do wykonania zadania, poziomie habituacji do zadania, zastosowaniu różnych strategii uczenia się itd. W odniesieniu do reprezentatywnych wyników, myszy α-CaMKII+/- wykazały krótszą latencję i krótszy dystans przebyty w porównaniu z grupą kontrolną. W rzeczywistości myszy α-CaMKII+/- wykazały nadaktywność lokomotoryczną w porównaniu z myszami kontrolnymi³, a fenotyp ten mógł leżeć u podstaw różnic w obrębie tych wskaźników.

W naszym laboratorium oceniliśmy ponad 36 szczepów myszy genetycznie zmodyfikowanych oraz myszy kontrolnych typu dzikiego w teście T-labiryntu z wykorzystaniem zautomatyzowanego aparatu, aby wyjaśnić zależność między genami, mózgiem a zachowaniem^15,16. Uzyskaliśmy obszerny zestaw surowych danych od ponad 1200 myszy i przedstawiliśmy dane dotyczące wyników w T-labiryncie dla kilku szczepów myszy mutantów^3,16-22. Dane dotyczące szczepów opublikowanych już w artykułach badawczych są zawarte w publicznej bazie danych „Mouse Behavioral Phenotype Database” (URL: http://www.mouse-phenotype.org/). Niektóre badania wykazały, że myszy z mutantami genów Dtnbp1¹, Nrd1²⁰ lub Plp1²¹ wykazują deficyty pamięci roboczej. Zatem nasz ustandaryzowany protokół zadań w T-labiryncie z wykorzystaniem zautomatyzowanego aparatu nadaje się do wykrywania efektów genetycznych w funkcji pamięci pomiędzy myszami mutantami a kontrolnymi myszami typu dzikiego. Protokoły testów behawioralnych muszą być standaryzowane, replikowane, a wyniki porównywane pomiędzy laboratoriami. Udoskonalony aparat T-labiryntu pozwala na automatyzację procedur testowych, co może przyczynić się do standaryzacji protokołów stosowanych w różnych laboratoriach.

Jak pokazano w tym artykule wideo, obecna wersja aparatury i programu pozwala na testowanie myszy czarnych lub agouti, ale nie myszy albinosów. Obecnie opracowujemy zmodyfikowaną wersję systemu, aby umożliwić testowanie myszy albinosów. System ten posiada zaletę polegającą na tym, że podczas testów w labiryncie T można przeprowadzać eksperymenty z mikrodializą in vivo, elektrofizjologią in vivo oraz optogenetyką, ponieważ drzwi są zaprojektowane tak, aby chować się pod podłogą. Na przykład niektórzy badacze mogą próbować badać właściwości elektrofizjologiczne neuronów w hipokampie podczas wyboru ramienia labiryntu, choć mogą być wymagane pewne ulepszenia aparatury w celu zminimalizowania szumów elektrycznych generowanych przez drzwi i siłowniki mechanizmu usuwania peletów.

Podsumowując, zadania wymuszonej naprzemienności w labiryncie T oraz dyskryminacji lewo-prawo z wykorzystaniem zmodyfikowanego aparatu automatycznego są użyteczne w ocenie pamięci operacyjnej i referencyjnej oraz elastyczności behawioralnej u myszy.