GENPLAT: zautomatyzowana platforma do odkrywania enzymów rozkładających biomasę i optymalizacji koktajli enzymatycznych

Podsumowanie

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) to zautomatyzowana platforma służąca do odkrywania i optymalizacji koktajli enzymatycznych do degradacji biomasy. Może ona zostać przystosowana do wielu rodzajów surowców oraz mieszanin enzymów zawierających wiele składników.

Streszczenie

Wysoki koszt enzymów służących do dekonstrukcji biomasy stanowi główną przeszkodę w ekonomicznej konwersji surowców lignocelulozowych na płynne paliwa transportowe, takie jak etanol. Opracowaliśmy zintegrowaną platformę wysokoprzepustową, nazwaną GENPLAT, służącą do odkrywania i opracowywania nowych enzymów oraz koktajli enzymatycznych do uwalniania cukrów z różnorodnych kombinacji obróbki wstępnej i biomasy. GENPLAT składa się z czterech elementów: pojedynczych czystych enzymów, statystycznego planowania doświadczeń, robotycznego pipetowania zawiesin biomasy i enzymów oraz zautomatyzowanego kolorymetrycznego oznaczania uwalnianych Glc i Xyl. Pojedyncze enzymy są otrzymywane poprzez ekspresję w Pichia pastoris lub Trichoderma reesei, albo poprzez oczyszczanie chromatograficzne z komercyjnych koktajli lub ekstraktów z nowych mikroorganizmów. Modele mieszanin w układzie sympleksowym (ułamkowy plan czynnikowy) są opracowywane przy użyciu komercyjnego oprogramowania statystycznego do planowania doświadczeń. Mieszaniny enzymatyczne o wysokim stopniu złożoności są przygotowywane za pomocą robotycznego pipetowania w formacie 96-dołkowym. Pomiar uwalnianych Glc i Xyl jest zautomatyzowany przy użyciu enzymatycznych testów kolorymetrycznych. Zoptymalizowane mieszaniny enzymatyczne zawierające nawet 16 składników zostały przetestowane na różnych kombinacjach surowców i metod obróbki wstępnej.

GENPLAT jest dostosowany do mieszanin czystych enzymów, mieszanin produktów komercyjnych (np. Accellerase 1000 i Novozyme 188), ekstraktów z nowych mikroorganizmów lub ich kombinacji. Aby przygotować i przetestować mieszaniny ˜10 czystych enzymów wymaga mniej niż 100 μg każdego białka i mniej niż 100 reakcji łącznie, przy końcowym całkowitym obciążeniu wynoszącym 15 mg białka/g glukanu. Wykorzystujemy enzymy z kilku źródeł. Enzymy można oczyszczać ze źródeł naturalnych, takich jak hodowle grzybów (np. Aspergillus niger, *Cochliobolus carbonum*, i Galerina marginata), lub mogą być wytwarzane poprzez ekspresję genów kodujących (pozyskanych z rosnącej liczby sekwencji genomów mikrobialnych) w gospodarzach takich jak E. coli, Pichia pastorislub grzyb nitkowaty, taki jak T. reeseiBiałka można również oczyszczać z komercyjnych koktajli enzymatycznych (np. Multifect Xylanase, Novozyme 188). Coraz więcej czystych enzymów, w tym glikozylohydrolazy, esterazy aktywne wobec ścian komórkowych, proteazy i liaz, jest dostępnych z komercyjnych źródeł, np. Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) oraz PROZOMIX (www.prozomix.com).

Oprogramowanie Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) służy do tworzenia projektów sieci splotowych (simplex-lattice designs) oraz analizy odpowiedzi (w tym przypadku uwalniania Glc i Xyl). Mieszaniny zawierają od 4 do 20 składników, których proporcje mogą wynosić od 0 do 100%. Punkty pomiarowe obejmują zazwyczaj wierzchołki skrajne oraz wystarczającą liczbę punktów pośrednich, aby wygenerować poprawny model. W terminologii planowania eksperymentów większość naszych badań to eksperymenty „mieszaninowe”, co oznacza, że suma wszystkich składników odpowiada całkowitemu, stałemu obciążeniu białkiem (wyrażonemu jako mg/g glukanu). Liczba mieszanin w sieci splotowej zależy zarówno od liczby składników w mieszaninie, jak i stopnia wielomianu (kwadratowego lub sześciennego). Na przykład eksperyment z 6 składnikami będzie wymagał 63 oddzielnych reakcji przy zastosowaniu rozszerzonego modelu sześciennego, który pozwala wykryć interakcje trójstopniowe, podczas gdy przy rozszerzonym modelu kwadratowym koniecznych jest tylko 23 pojedynczych reakcji. W przypadku mieszanin zawierających więcej niż osiem składników bardziej praktyczny jest kwadratowy projekt eksperymentalny, a w naszym doświadczeniu takie modele są zazwyczaj istotne statystycznie.

Wszystkie dawki enzymów są wyrażone jako procent całkowitej dawki końcowej (która w naszych eksperymentach wynosi zazwyczaj 15 mg białka/g glukanu). Dla enzymów „kluczowych” dolna granica procentowa została ustalona na 5%. Granica ta wynika z naszego doświadczenia, zgodnie z którym wydajności Glc i/lub Xyl były bardzo niskie, jeśli jakikolwiek enzym kluczowy występował w stężeniu 0%. Słabe modele wynikają z zbyt wielu próbek wykazujących bardzo niskie wydajności Glc lub Xyl. Ustalenie dolnej granicy z kolei determinuje granicę górną. Oznacza to, że w przypadku eksperymentu sześcioelementowego, jeśli dolna granica dla każdego pojedynczego składnika wynosi 5%, górna granica każdego pojedynczego składnika wyniesie 75%. Dolne granice wszystkich pozostałych enzymów uznanych za „akcesoryjne” zostały ustawione na 0%. Oznaczenia „kluczowe” i „akcesoryjne” są w pewnym stopniu arbitralne i będą się różnić w zależności od substratu, ale w naszych badaniach enzymy kluczowe dla uwalniania Glc z kolb kukurydzy obejmują następujące enzymy z T. reesei: CBH1 (znany również jako Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glukozydaza), EX3 (endo-β1,4-ksylanaza, GH10) oraz BX (β-ksylozydaza).

Protokół

1. Produkcja enzymu

1. Wytworzyć białka w Pichia pastoris poprzez klonowanie odpowiednich genów do wektorów pPICZ lub pPICZα i transformację do P. pastoris. Hodować komórki w partiach 300-ml w kolbach z przegrodami o pojemności 500-ml z indukcją metanolem co 24 hr (Banerjee et al., 2010a).
2. Skoncentrować i odsolić filtraty hodowli za pomocą filtracji przepływowej stycznej.
3. Przechowywać enzymy w małych aliquotach w 20% glicerolu w temperaturze -80°C. Zakres stężeń wynosi 1-10 mg/ml.

2. Projekt eksperymentu

1. Wprowadź do oprogramowania Design-Expert liczbę enzymów do przetestowania, ich górne i dolne proporcje (np. dolna proporcja 5% dla enzymów podstawowych) oraz typ projektu eksperymentalnego (np. kwadratowy lub sześcienny).
2. Oblicz ilość każdego enzymu w μg, którą należy dodać, aby uzyskać całkowite obciążenie wynoszące 15 mg/g glukanu, a następnie oblicz objętość każdego enzymu w μl do dodania do każdej reakcji.
3. Wygeneruj arkusze Excel określające naczynia źródłowe, studzienki źródłowe, naczynia docelowe, studzienki docelowe oraz objętości przenoszenia dla dozowania wody i enzymów zgodnie z projektem eksperymentalnym, a następnie zaimportuj je do oprogramowania Biomek FXP za pomocą funkcji transfer-from-file.

3. Hydroliza enzymatyczna

1. Zawiesinę biomasy zawiesić w 50 mM cytrynianie sodu o pH 4.8, zawierającym 5 μg/ml tetracykliny i 5 μg/ml cykloheksymidu, w zbiorniku z mieszadłem łopatkowym.
2. Za pomocą robota pipetować 200 μl zawiesiny do każdego dołka 96-dołkowej głębokiej płytki reakcyjnej, używając końcówek do pipet Span-8 1000-μl z odciętymi ostatnimi 0,5 cm. Zawiesinę wymieszać raz z prędkością 100 μl/sec, a następnie odessać taką samą objętość ze zbiornika z mieszadłem i rozdzielić do płytek.
3. Rozdzielić enzymy do tej samej płytki, korzystając z programu wprowadzonego do urządzenia Beckman FX.
4. Uszczelnić płytki przepieracalnymi matami z nakładkami.
5. Odwrócić i kilkakrotnie opukać płytki, aby przełamać napięcie powierzchniowe. Umieścić płytki w temperaturze 50°C na 48 hr w inkubatorze do hybrydyzacji, obracającym się z prędkością 10 rpm.

4. Oznaczanie Glc i Xyl

1. Wiruj płyty reakcyjne przez 3 min przy 1250 x g w wirówce z koszyczkami wahadłowymi.
2. Przenieś 100 μl supernatantu do standardowych płytek 96-dołkowych, używając modułu AP96 systemu Biomek FX.
3. Inkubuj płytki w temperaturze 90-95°C przez 10 min w celu inaktywacji enzymów, a następnie wiruj przy 1250 x g przez 30 sec.
4. Do pomiarów Glc przenieś 12 μl supernatantu do standardowych płytek 96-dołkowych. Dodaj 192 μl odczynnika oksydazy/peroksydazy glukozowej (GOPOD). Inkubuj płytki w temperaturze 50°C przez 20 min i zmierz absorbancję przy 510 nm w czytniku mikro płytek. Próbą kontrolną (blank) jest mieszanina reakcyjna bez enzymu.
5. Do pomiarów Xyl przenieś 4 μl do płytek 384-dołkowych. Dodaj odczynniki do analizy i odczytaj wyniki z płytek przy 340 nm. Próbą kontrolną (blank) jest mieszanina reakcyjna bez enzymu.

5. Analiza danych

1. Przelicz wartości absorbancji na procentową wydajność Glc i Xyl, opierając się na znanej zawartości Glc i Xyl w oryginalnej biomasie. Zaimportuj te wartości procentowe jako odpowiedzi do oprogramowania Design-Expert. Sprawdź parametry statystyczne, aby upewnić się, że spełnione zostały kryteria modelu robustnego.
2. Potwierdź eksperymentalnie predykcję najlepszego modelu.

6. Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą GENPLAT:

(1) Tworzenie zoptymalizowanych mieszanin poszczególnych czystych białek. Wyniki wskazują, które enzymy są istotne i w jakich proporcjach, a także które enzymy nie są istotne. Niektóre białka występujące w dużych ilościach w sekretomie T. reesei (Nagendran et al., 2009), takie jak Cip1 i Cip2, zdają się nie odgrywać żadnej roli w uwalnianiu Glc z słomy kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce metodą AFEX (ammonia fiber expansion) lub AHP (alkaline hydrogen peroxide) (Banerjee et al., 2010b). Z drugiej strony, niektóre białka są nieoczekiwanie istotne. Na przykład endoksylanazy z rodzin glikozylohydrolaz 10 i 11 są obie ważne dla uwalniania Glc; jedna ksylanaza nie może zastąpić drugiej (Banerjee et al., 2010b,c). Cel61A, białko występujące w niewielkiej ilości w sekretomie T. reesei, jest bardzo ważne dla uwalniania Glc, ale nie Xyl. Niektóre enzymy są istotne dla uwalniania zarówno Glc, jak i Xyl, podczas gdy inne są niezbędne tylko dla jednego lub drugiego (Banerjee et al., 2010c).

Syntetyczna mieszanina zawierająca 16 składników, z których każdy występował w stężeniu 0,94 mg/ml (tj. mieszanina nieoptymalizowana), uwolniła 38% dostępnego Glc z DDG poddanego obróbce AFEX. W identycznych warunkach hydrolizy mieszanina zoptymalizowana, w której stężenia 16 składników wahały się od 0% do 32%, uwolniła 52% Glc (Rys. 2). Eksperyment ten ilustruje użyteczność tworzenia zdefiniowanych mieszanin.

(2) Tworzenie zoptymalizowanych koktajli dla różnych kombinacji obróbki wstępnej i substratu. Obecne komercyjne preparaty celulaz są uniwersalne („one-size-fits-all”). W rzeczywistości najlepszy koktajl zależy zarówno od substratu, jak i od zastosowanej obróbki wstępnej. Pojedynczy produkt, taki jak Accellerase 1000, daje różne wydajności z różnych substratów poddanych tej samej obróbce wstępnej oraz z tego samego substratu poddanego różnym obróbkom wstępnym (Rys. 1). Wykorzystaliśmy program GENPLAT do optymalizacji mieszanin czystych enzymów dla wielu rodzajów obróbek wstępnych i wielu surowców (Banerjee et al., 2010c). Rysunek 2 pokazuje, jak optymalne proporcje 16 czystych enzymów różnią się dla słomy kukurydzianej poddanej obróbce AFEX, słomy kukurydzianej poddanej obróbce AHP oraz DDG poddanego obróbce AFEX. Na Rys. 2 przedstawiono tylko 11 enzymów, ponieważ ustalono, że optymalne proporcje pozostałych pięciu (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 i Cel12A) wynoszą 0% (Banerjee et al., 2010c).

(3) Odkrywanie nowych enzymów. Tworzenie zoptymalizowanych mieszanin czystych białek jest procesem ciągłym. W miarę udostępniania nowych białek w formie czystej (z źródeł komercyjnych, poprzez ekspresję heterologiczną lub oczyszczanie), mogą być one systematycznie testowane poprzez dodawanie do obecnego, zoptymalizowanego zestawu. Nowe białka, które przyczyniają się do uwalniania Glc lub Xyl, stają się częścią nowego, zoptymalizowanego zestawu. W ten sposób GENPLAT staje się platformą do identyfikacji nowych enzymów służących do dekonstrukcji biomasy. Wykonaliśmy ekstrakty z grzybów innych niż T. reesei i A. niger, hodowanych na różnych podłożach. Jeden konkretny ekstrakt zwiększył wydajność Glc po dodaniu do naszego podstawowego zestawu. Odpowiedzialne za to białko zostało oczyszczone i zidentyfikowane jako nowa glikozylohydrolaza, która nie występuje w żadnym komercyjnym preparacie enzymatycznym (Banerjee i Walton, wyniki niepublikowane).

(4) Odkrywanie lepszych enzymów. Po wykazaniu za pomocą GENPLAT, które enzymy są najważniejsze dla degradacji konkretnej biomasy, mamy lepsze zrozumienie tego, na których enzymach należy skupić się w celu ich ulepszenia. Lepsze przykłady krytycznych enzymów można znaleźć w naturze lub stworzyć za pomocą inżynierii białek. (Enzym może być „lepszy” od swojego homologu z T. reesei na kilka sposobów, w zależności od pożądanej właściwości, np. poprzez wyższą aktywność właściwą, większą synergię, zmniejszoną wrażliwość proteolityczną lub zwiększoną stabilność termiczną). GENPLAT stanowi wartościową platformę do badania potencjalnie lepszych enzymów, ponieważ wykorzystuje realistycznie złożony koktajl (co jest istotne, gdyż żaden enzym biomasy nie działa w izolacji) oraz realistyczny substrat (co jest ważne, ponieważ wyniki uzyskane na czystej celulozie lub innych sztucznych substratach mogą nie mieć zastosowania w przypadku naturalnych materiałów lignocelulozowych).

(5) Optymalizacja enzymów komercyjnych. W rzeczywistości nie dysponujemy jeszcze wystarczająco dużymi ilościami czystych enzymów. Dopóki tak będzie, producenci etanolu muszą polegać na produktach komercyjnych, takich jak Accellerase 1000 i MultifectXylanase. Jednak mieszaniny enzymów komercyjnych zazwyczaj wykazują lepszą aktywność niż jakikolwiek pojedynczy enzym, a GENPLAT może zostać wykorzystany do zaprojektowania zoptymalizowanych koktajli składających się z wielu enzymów komercyjnych. Rysunek 3 przedstawia zastosowanie GENPLAT do optymalizacji mieszaniny czterech komercyjnych preparatów enzymatycznych. Ustalono, że optymalne proporcje dla uwalniania Glc z DDG poddanego obróbce AFEX wynoszą 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188 oraz 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010c). Rysunek 3B pokazuje różnice w wydajności Glc z AFEX-DDG przy zastosowaniu czterech preparatów enzymatycznych; zoptymalizowana mieszanina komercyjna daje wyższą wydajność Glc niż sam Accellerase1000, sam SpezymeCP lub 16-komponentowa mieszanina syntetyczna. Eksperyment ten wskazuje również, że w 16-komponentowej mieszaninie syntetycznej brakuje jednego lub więcej enzymów niezbędnych do optymalnego uwalniania Glc, które są obecne w jednym lub większej liczbie enzymów komercyjnych. GENPLAT może być wykorzystany do identyfikacji takich komponentów.

Rycina 1. Żaden pojedynczy komercyjny preparat enzymatyczny nie jest optymalny dla wszystkich substratów i wszystkich rodzajów obróbki wstępnej. Porównano pięć substratów i trzy rodzaje obróbki wstępnej w podobnych warunkach mielenia (rozmiar cząstek 0,5 mm), dawki enzymu (15 mg/g glukanu) oraz warunkach hydrolizy (48 hr, 50°C). A. Trawienie różnych substratów poddanych obróbce AFEX przy użyciu Accellerase 1000. B. Trawienie słomy kukurydzianej poddanej trzem różnym metodom obróbki wstępnej przy użyciu Accellerase 1000 (patrz Banerjee et al., 2010c).

Rysunek 2. Optymalne proporcje 11 enzymów dla uwalniania Glc z słomy kukurydzianej poddanej obróbce AFEX (AFEX-CS), słomy kukurydzianej poddanej obróbce alkalicznym nadtlenkiem wodoru (AHP-CS) lub wysuszonych ziarni z destylacji poddanych obróbce AFEX (AFEX-DDG). Dane pochodzą z pracy Banerjee i wsp. (2010c). Liczby nad słupkami przedstawiają wydajność Glc jako procent całkowitej zawartości Glc w próbce biomasy.

Rycina 3. A. Wykorzystanie GENPLAT do opracowania zoptymalizowanej mieszaniny czterech komercyjnych preparatów enzymatycznych w celu uwalniania Glc z DDG poddanego obróbce AFEX. Multifect Xylanase miał najmniejszy udział (4%) i zostałTherefore pominięty na tym wykresie trójskładnikowym. B. Wydajności Glc z AFEX-DDG przy różnych zabiegach enzymatycznych w identycznych warunkach hydrolizy (15 mg/g glukanu enzymu, 48 h, 50°C). „Komercyjna czteroskładnikowa” posiada proporcje określone na podstawie eksperymentu przedstawionego na Ryc. 3A.

Dyskusja

Powszechnie uznaje się, że obniżenie kosztów enzymów jest istotne dla rozwoju ekonomicznie opłacalnego przemysłu etanolu lignocelulozowego. Obecnie dostępne komercyjne koktajle enzymatyczne są złożonymi i słabo zdefiniowanymi mieszaninami wielu białek (Nagendran et al., 2009), dostosowanymi głównie do zastosowania w przypadku słomy kukurydzianej poddanej obróbce kwasowej. Aby przyspieszyć opracowanie lepszych koktajli enzymatycznych, kilka laboratoriów stworzyło wysokoprzepustowe platformy do odkrywania i charakteryzacji enzymów. Działania w tym obszarze obejmowały jedną lub więcej z następujących właściwości, które znajdują się również w GENPLAT: robotyczne dozowanie enzymów i zawiesin biomasy, statystyczne planowanie eksperymentów i/lub zautomatyzowane oznaczanie Glc i Xyl (Berlin et al., 2007; Decker et al., 2009; Kim et al., 1998; King et al., 2009). GENPLAT rozwija te wcześniejsze osiągnięcia, przede wszystkim w zakresie złożoności analizowanych mieszanin enzymatycznych – od maksymalnie 6 składników w poprzednich badaniach do ponad 16 w naszej najnowszej pracy (Banerjee et al., 2010c). Dodatkowymi kluczowymi cechami GENPLAT są: zastosowanie komory mieszania z koralikami (zbiornik z mieszadłem), która pozwala utrzymać zawiesiny słomy w stanie zawieszenia podczas dozowania; delikatne mieszanie podczas trawienia poprzez rotację typu end-over-end oraz zautomatyzowane kolorymetryczne oznaczanie Glu i Xyl.