Budowa niskobudżetowego systemu do aksotomii laserowej do badania regeneracji aksonów u C. elegans

Podsumowanie

Aksotomia laserowa, po której następuje obrazowanie poklatkowe, jest czułym sposobem na zbadanie wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, ale niedrogi system ablacji laserowej można łatwo dodać do większości mikroskopów. Obrazowanie poklatkowe powyżej 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia robaka.

Streszczenie

Aksotomia laserowa, po której następuje mikroskopia poklatkowa, jest czułym testem na fenotypy regeneracji aksonów u C. elegans¹. Główną trudnością tego testu jest postrzegany koszt (25-100 tys. USD) i wiedza techniczna wymagana do wdrożenia systemu ablacji laserowej^2,3. Jednak lasery impulsowe na ciele stałym o niewielkich kosztach (10 tys. < USD) mogą zapewnić solidną wydajność ablacji laserowej w przezroczystych preparatach, w których aksony docelowe znajdują się "blisko" powierzchni tkanki. Budowę i wyrównanie systemu można wykonać w ciągu jednego dnia. Ścieżka optyczna zapewniana przez światło od skupionego kondensatora do lasera ablacyjnego zapewnia wygodną prowadnicę wyrównania. Moduł pośredni z usuniętą całą optyką może być dedykowany do lasera ablacyjnego i zapewnia, że podczas sesji ablacji laserowej nie ma potrzeby przesuwania elementów optycznych. Dichroik w module pośrednim umożliwia jednoczesne obrazowanie i ablację laserową. Wyśrodkowanie wiązki laserowej do wiązki wychodzącej z soczewki kondensatora mikroskopu skupionego kieruje początkowym ustawieniem systemu. Do kondycjonowania i rozszerzania wiązki laserowej w celu wypełnienia tylnej apertury wybranej soczewki obiektywu stosuje się różne soczewki. Końcowe wyrównanie i testowanie przeprowadza się za pomocą lustrzanej szklanej tarczy ślizgowej z przodu powierzchni. Moc lasera jest dostosowana tak, aby uzyskać minimalny rozmiar plamki ablacyjnej (<1um). Punkt ablacji jest wyśrodkowany za pomocą precyzyjnych regulacji ostatniego kinematycznie zamontowanego lustra do krzyża nitkowego zamocowanego w oknie obrazowania. Moc lasera do aksotomii będzie około 10 razy wyższa niż potrzebna do uzyskania minimalnego miejsca ablacji na szkiełku docelowym (może się to różnić w zależności od używanego celu). Robaki mogą być unieruchomione do aksotomii laserowej i obrazowania poklatkowego poprzez montaż na podkładkach agarozowych (lub w komorach mikroprzepływowych⁴). Płatki agarozowe można łatwo przygotować z 10% agarozy w zbilansowanej soli fizjologicznej stopionej w kuchence mikrofalowej. Kroplę stopionej agarozy umieszcza się na szkiełku podstawowym i spłaszcza za pomocą innego szkiełka w podkładkę o grubości około 200 um (jako przekładkę stosuje się pojedynczą warstwę taśmy czasowej na sąsiednich szkiełkach). Nasadka "Sharpie" służy do wycinania okrągłej podkładki o jednolitej średnicy 13 mm. Środek znieczulający (1ul Muscimol 20mM) i mikrosfery (komunikacja osobista Chris Fang-Yen) (1ul 2,65% polistyrenu 0,1 um w wodzie) są dodawane do środka podkładki, a następnie 3-5 robaków zorientowanych tak, aby leżały na lewym boku. Nakłada się szklane szkiełko nakrywkowe, a następnie stosuje się wazelinę, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i zapobiec parowaniu próbki.

Protokół

1. Budowa systemu do ablacji laserowej

Noś okulary ochronne do lasera i stosuj dobre praktyki bezpieczeństwa laserowego podczas początkowego ustawiania. Nigdy nie patrz przez okulary, gdy laser jest włączony.

1. Ułóż elementy na płytce stykowej, jak pokazano na rys. 1 (patrz również example²). Przykręć laser (w razie potrzeby z płytą pionową), słupek peryskopowy i podniesione wsporniki szyn.
2. Ustaw mikroskop tak, aby wyrównał się z osią szyny. Wyrównaj z wiązką światła przechodzącego z soczewki kondensora mikroskopu. Wyrównaj wysokość szyny (użyj poziomicy) i ustaw ją za pomocą regulowanej przysłony lub obiektywu przymocowanego do szyny. Przysłona lub soczewka muszą być wyrównane na obu końcach szyny z wiązką skraplacza. Podnośniki laboratoryjne mogą pomóc w regulacji wysokości szyny.
3. Dopasuj polaryzator Glan-Thompson i płytkę półfalową do wiązki laserowej. Nie potrzebujesz włączonego lasera, aby wykonać to wyrównanie. Belka musi tylko przejść przez oba, nie uderzając w ich krawędzie. Obróć polaryzator, aby zapewnić wygodną orientację i pozycję zrzutu wiązki (rys.1). Obrócisz płytkę półfalową, aby dostosować moc lasera. Przymocuj komponenty do płytki stykowej.
4. Włącz laser, ustaw częstotliwość impulsów na 100, tryb ciągły i zmniejsz moc do minimum za pomocą płytki półfalowej. Użyj karteczki samoprzylepnej lub papieru do soczewek, aby zobrazować wiązkę laserową.
5. Wyreguluj i zamocuj kinematycznie zamontowane lustra w kolejności od lasera, aby skierować wiązkę do lustra zamontowanego na końcu podwyższonej szyny. Wiązka lasera powinna być ustawiona mniej więcej do środka luster. Lustra powinny być ustawione pod kątem około 45 stopni do osi wiązki laserowej (rys.1).
6. Z grubsza wyreguluj kinematycznie zamontowane lustro na górze peryskopu i na końcu szyny, aby wyrównać wiązkę laserową do środka przesyłanej wiązki światła z mikroskopu. Zarówno wiązka laserowa, jak i wiązka światła przepuszczanego z mikroskopu mogą być jednocześnie wizualizowane poprzez włożenie papieru w ścieżkę wiązki. Upewnij się, że wszystkie filtry ND i otwory w module pośrednim są wyjęte lub całkowicie otwarte.
7. Dokładnie wyrównaj wiązkę laserową do środka przechodzącej wiązki światła za pomocą precyzyjnych regulacji na górnym peryskopie i lustrach szynowych. Przytrzymaj papier blisko lustra szynowego i wyrównaj wiązkę lasera ze środkiem wiązki światła przechodzącego z górnym lustrem peryskopowym. Przytrzymaj papier w pobliżu portu mikroskopu i wyrównaj wiązkę lasera do środka wiązki światła przechodzącego za pomocą regulacji lustra szynowego (rys.2).
8. Umieść karteczkę samoprzylepną na ścieżce wiązki między wyrównaną soczewką kondensora a otwartą wieżyczką obiektywu. Powinieneś zobaczyć przesyłaną wiązkę światła z mniejszą wiązką laserową w pobliżu środka. Użyj precyzyjnych regulacji na lustrze szyny, aby wyśrodkować wiązkę laserową. Zamocuj mikroskop na miejscu za pomocą clamps.

Kroki 1.9-1.12 są opcjonalne, ale łatwo i pożytecznie jest ocenić wyrównanie i ablację laserową przed dodaniem soczewek rozszerzających wiązkę.

9. Wyłącz laser i włącz mechaniczną migawkę bezpieczeństwa. Obróć 50% dichroiczność ze ścieżki wiązki. Mimo że żadne bezpośrednie światło laserowe nie przechodzi do okularów, odbite światło może być dość intensywne. Zamontuj suwak docelowy w celu precyzyjnego wyrównania i obrazu za pomocą obiektywu olejowego 60X. Skoncentruj się na zadrapaniach na slajdzie. Włóż filtr ND4 i ND8 w module pośrednim.
10. Zobrazuj slajd docelowy za pomocą systemu CLSM, Spinning disk lub CCD. Obróć 50% dichroiczność do ścieżki lasera. Od tego momentu nigdy nie należy patrzeć przez okulary, gdy laser ablacyjny jest włączony. Włącz laser ablacyjny i ustaw tryb na wyzwalany, częstotliwość na 100 i liczbę impulsu na 10. Upewnij się, że moc jest nadal ustawiona na minimum za pomocą płytki półfalowej, a następnie otwórz mechaniczną żaluzję bezpieczeństwa. Możesz jednocześnie obrazować i używać lasera ablacyjnego.
11. Podczas obrazowania szkiełka docelowego uruchom laser ablacyjny. Sprawdź, czy na szkiełku docelowym nie ma plamki ablacyjnej o średnicy 1-10 μm. Sekwencyjnie wyjmuj filtry ND, aż pojawi się punkt ablacji. Dostosuj plamkę ablacji do środka obrazu za pomocą lustra szynowego. Będziesz chciał dodać z powrotem filtr ND, aby mieć miejsce na drobne zwiększenie mocy lasera za pomocą płytki półfalowej, aby uzyskać punkt ablacji <1 μm. Obraz z szybkością 0,2 μm/piksel lub mniejszą i precyzyjnie dostosuj plamkę ablacyjną do środka obrazu (pozycja 256 256 z obrazem 512X512).
12. Sprawdź głębokość ostrości i oś wiązki laserowej. Ustaw ostrość w górę iw dół 1-2 μm i sprawdź pozycję ablacji oraz rozmiar plamki ablacji. Jeśli wiązka lasera jest ustawiona osiowo, plamka ablacyjna nie będzie się poruszać. Nieuwarunkowana wiązka laserowa rozprowadza moc na kilka μm (około 3-5 μm od góry do dołu ogniskowania).

2. Dodaj soczewki, aby rozszerzyć wiązkę laserową, aby wypełnić tylną aperturę obiektywu i dostosować zbieżność, aby kontrolować ostrość.

1. System ten wykorzystuje podwójne ekspandery wiązki Galileusza do rozszerzania wiązki laserowej w celu wypełnienia tylnego otworu obiektywu (10 mm). Zamontuj 4 soczewki na uchwytach i przymocuj je do szyny (L1f1+L2f2 i L3f1'+L4f2'). Wyreguluj pozycje tak, aby wszystkie soczewki znajdowały się w tej samej osi optycznej i dokładnie prostopadłe do wiązki laserowej (rys. 2).
2. Włącz laser i ustaw go na minimalną moc i tryb ciągły. Z grubsza dostosuj wyrównanie wiązki przez każdą soczewkę za pomocą papieru, aby zobaczyć wiązkę laserową i wiązkę światła przechodzącego z kondensatora mikroskopu. Wyłącz i wyłącz laser.
3. Usuń zaciski z jednej strony mikroskopu i wysuń mikroskop ze ścieżki wiązki laserowej. Włącz laser i zdejmij migawkę bezpieczeństwa.
4. Dokładne wyrównanie soczewek i wiązki laserowej można wykonać, oglądając rozszerzoną wiązkę laserową na pobliskiej ścianie. Wiązka powinna rozszerzać się i kurczyć symetrycznie, gdy soczewki są poruszane. Wyreguluj dwa ostatnie lustra zamontowane kinematycznie, aby wyrównać belkę (rys.3).
5. Wyrównany i rozszerzony profil belki powinien być okrągły i mieć jednolitą jasność (rys.3). Rozmiar i jednorodność wiązki można wyświetlić za pomocą karteczki samoprzylepnej w szacowanym położeniu tylnego otworu obiektywu.
6. Wiązka powinna być ustawiona na zerową zbieżność dla układów optycznych nieskończoności. Zbieżność można oszacować, zwracając uwagę na to, jak zmienia się rozmiar wiązki, gdy oddalasz karteczkę samoprzylepną od soczewek. Wyłącz laser i włącz migawkę mechaniczną.
7. Wsuń mikroskop z powrotem na ścieżkę wiązki laserowej za pomocą stałych zacisków, aby określić prawidłowe ustawienie. Wymień clamps po wolnej stronie mikroskopu, ale nie dokręcaj.
8. Włącz laser i zdejmij migawkę bezpieczeństwa. Obróć wieżyczkę obiektywu do pozycji otwartej. Umieść karteczkę samoprzylepną na scenie. Powinieneś zobaczyć rozszerzoną i jednolitą wiązkę laserową wyśrodkowaną na wiązce światła przesyłanego z kondensatora (rys.4). Może być konieczne wyśrodkowanie go poprzez poluzowanie zacisków mikroskopu i ostrożne popychanie mikroskopu.
9. Włącz migawkę bezpieczeństwa i ustaw laser w trybie wyzwalania. Obróć obiektyw 60X w miejscu i zobrazuj zadrapania powierzchni na szkiełku docelowym.
10. Zdejmij przesłonę bezpieczeństwa, uruchom laser ablacyjny i dostosuj moc lasera do minimalnego miejsca ablacji. Plamka ablacyjna powinna być okrągła i znajdować się w odległości 5-10 um od środka obrazu.
11. Wyśrodkuj miejsce ablacji za pomocą precyzyjnych regulacji kinematycznie zamontowanego lustra szynowego. Będziesz musiał iteracyjnie dostosować zamontowane na szynie i górne lustro peryskopowe, aby zarówno wyśrodkować punkt ablacji, jak i utrzymać jednolity profil wiązki.
12. Oceń ognisko Z lasera, systematycznie przesuwając ognisko w górę iw dół w krokach co 1 um i uruchamiając laser ablacyjny. Rozszerzona, wyrównana i dopasowana do zbieżności wiązka powinna ulegać ablacji maksymalnie przy ostrości obrazu i słabo lub wcale 1 um powyżej lub poniżej ogniskowej (rys. 5).
13. Wyreguluj ognisko Z rozszerzonej wiązki, przesuwając soczewkę L3 teleskopu Galileusza (rys.2).

3. Aksotomia laserowa i mikroskopia poklatkowa regeneracji aksonów

1. Mikrofalowa 10% agaroza (RPI Molecular Biology Grade EEO 0,1 A20090) w zrównoważonym roztworze soli fizjologicznej do całkowitego stopienia. Umieść na płycie grzejnej, aby stopiła się podczas użytkowania do montażu.
2. Kroplę stopionej agarozy umieszcza się na szkiełku podstawowym i spłaszcza za pomocą innego szkiełka w podkładkę o grubości około 200 um (jako przekładkę stosuje się pojedynczą warstwę taśmy czasowej na sąsiednich szkiełkach).
3. Nasadka markera "Sharpie" służy do wycinania okrągłej podkładki o jednolitej średnicy 13 mm.
4. Środek znieczulający (1ul Muscimol 20mM) i mikrosfery (Chris Fang-Yen, komunikacja osobista) (1ul 2,65% polistyrenu 0,1 um w wodzie) dodaje się do środka podkładki, a następnie 3-5 robaków zorientowanych tak, aby leżały na lewym boku. Nakłada się szklane szkiełko nakrywkowe, a następnie stosuje się wazelinę, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i zapobiec parowaniu próbki (rys.6).
5. Laser ablacyjny jest ustawiany na krzyżu nitkowym, jak opisano powyżej, na początku każdej sesji. Włącz laserową migawkę bezpieczeństwa.
6. Usuń cel wyrównania lasera i zobrazuj zamontowanego dorosłego robaka za pomocą odpowiedniego markera fluorescencyjnego w docelowych neuronach. Aksony obrazu o podobnym powiększeniu (0,2 μm/piksel lub większe) i umieszczeniu pod krzyżem nitkowym (rys. 7).
7. Otwórz laserową przesłonę bezpieczeństwa i uruchom laser ablacyjny podczas obrazowania. Oceń akson po wyzwoleniu lasera i powoli zwiększaj moc lasera, aż akson zostanie przecięty. Do przecięcia aksonów potrzebna będzie około 10 razy większa moc lasera niż do utworzenia miejsca ablacji na szkiełku celu wyrównującego (około impulsu 1uJ/ns). Zazwyczaj tniemy za pomocą 100 impulsów o częstotliwości 2,5 kHz i mocy ustawionej na około 0,27 mW (średnia moc mierzona na próbce za pomocą miernika mocy Coherent FieldMaxII i lasera ustawionego na ciągły na 2500 Hz). Ustawienie mocy lasera ablacyjnego będzie spójne dla cięcia aksonów w przyszłych eksperymentach (rys.7).
8. Pomyślnie przecięty akson będzie wykazywał przerwę około 0,5-1 um bez utraty jasności na dwóch odciętych końcach (ryc. 7). Duża utrata jasności lub duża przerwa (2-10 μm) często oznacza rozległe uszkodzenie poza aksonem przez pęcherzyk kawitacyjny. Aksony proksymalne i dystalne rozdzielą się i utworzą bańki retrakcyjne w ciągu najbliższych 30 minut (ryc. 8 i film).
9. Zrównoważ zamontowane robaki ze stolikiem mikroskopowym przez 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania poklatkowego. Zminimalizuje to dryft spowodowany różnicami temperatur i skurczem agarozy.
10. ) Parametry obrazowania poklatkowego są konfigurowane za pomocą oprogramowania do obrazowania powiązanego z systemem. Zazwyczaj obrazujemy 10-20 kroków Z (1um/krok) przy 0,1-0,2 um/piksel przy użyciu ustawień wzmocnienia, otworka, szybkości skanowania i mocy lasera obrazowania, które minimalizują ekspozycję, zapewniając jednocześnie pożądaną rozdzielczość przestrzenną. Interwały próbkowania wynoszą zwykle 1-5 minut przez 15 godzin, w zależności od pożądanej rozdzielczości czasowej (rys. 8 i film).
11. Dane obrazów poklatkowych są konwertowane na filmy za pomocą NIS Elements lub ImageJ.

4. Reprezentatywne wyniki:

Aksotomia laserowa przy użyciu tego systemu jest niezawodna i rutynowa. Wyniki pokazane na rysunku 7 są typowe. Obrazowanie poklatkowe regeneracji aksonów jest bardzo niezawodne przy użyciu tego protokołu. Rutynowo wycinamy i obrazujemy do 5 aksonów w 5 różnych robakach na jednym slajdzie za pomocą zmotoryzowanego stolika. Jedynym ograniczeniem jest czas potrzebny na zebranie obrazów każdego aksonu, np. jeśli zebranie stosu dla aksonu zajmuje 20 sekund, to co najwyżej możesz pobrać próbkowanie 9 aksonów (9 stosów), jeśli próbkujesz co 180 sekund. Przykład pokazany na rysunkach 8 i 9 jest dobrym reprezentatywnym wynikiem. Około 10% eksperymentów daje wyniki tej jakości. Pozostałe eksperymenty dostarczają dobrych danych na temat fenotypu regeneracji, ale są estetycznie nieatrakcyjne z powodu małych ruchów drgań robaka, które zwykle rozpoczynają się po 5-8 godzinach unieruchomienia.

Wykres 1 System ablacji laserowej. Laser Nd:Yag o długości fali 532 nm jest zamontowany na płycie nośnej, aby ustawić go na wysokość innych komponentów i przykręcić do płytki stykowej. (Izolator optyczny jest opcjonalny i prawdopodobnie nie jest potrzebny). Polaryzator Glan-Thompson i płytka półfalowa służą do precyzyjnej kontroli mocy lasera. Znajdują się one w precyzyjnie skalibrowanych mocowaniach obrotowych. Uważaj na ustawienie zrzutu belki. Lustro narożne kieruje wiązkę lasera na dolne zwierciadło peryskopowe. Górne zwierciadło peryskopowe kieruje wiązkę światła na zwierciadło szynowe. Szyna jest zamontowana na dwóch platformach podpartych prętami. Podwójne soczewki Galileusza są przymocowane do przesuwnych mocowań szynowych. Zwróć uwagę na dodany moduł pośredni dedykowany do lasera ablacyjnego. System można uczynić bardziej kompaktowym, usuwając izolator optyczny i lustro narożne oraz zmieniając położenie lasera, polaryzatora Glan-Thompson i płytki półfalowej na tylną krawędź płytki stykowej.

Wykres 2 Podwójne soczewki kondycjonujące Galileusza służą do rozszerzania wiązki laserowej TEMoo o energii 300 um do jednolitego rozmiaru 10 mm o zerowej zbieżności. Podnośnik laboratoryjny jest umieszczony pod jedną z platform przytrzymujących szynę. Pomaga to w regulacji wysokości szyny podczas etapów wyrównywania. Z grubsza wyreguluj wysokość szyny, montując soczewkę L1 do szyny i używając belki skraplacza jako prowadnicy wyrównania. Wyreguluj szynę tak, aby wiązka kondensatora była wyrównana ze środkiem soczewki na obu końcach szyny. Zapewni to, że szyna jest wyrównana równolegle do osi optycznej mikroskopu. Może być konieczne uprzednie wyregulowanie mikroskopu, aby pasował do osi optycznej szyny. Użyj clamps, aby ustalić pozycję mikroskopu (patrz rys. 1). Zdejmij soczewkę zamontowaną na szynie. Teraz wyrównaj wiązkę laserową do środka wiązki skraplacza na obu końcach szyny. Papier na ścieżce wiązki to wygodny sposób na jednoczesne oglądanie obu wiązek. Użyj górnego lustra peryskopowego, aby wyrównać wiązkę laserową z wiązką kondensatora w pobliżu lustra zamontowanego na szynie. Użyj lustra zamontowanego na szynie, aby wyrównać wiązkę laserową z wiązką kondensatora na drugim końcu szyny (najbliżej mikroskopu). Teraz zamontuj wszystkie cztery soczewki na szynie, jak pokazano na rysunku. Długość szyny, ogniskowa soczewek i rozmieszczenie soczewek będą się różnić w zależności od mikroskopu i konfiguracji fizycznej. Krytycznymi parametrami są średnica wiązki laserowej oraz wielkość tylnego otworu wybranego obiektywu. Układy optyczne Infinity skupiają idealnie równoległą wiązkę laserową (zerowa zbieżność). Odległość między L1 i L2 powinna być sumą ogniskowych obiektywów, f1+f2, a odległość między L3 i L4 powinna wynosić odpowiednio f1'+f2'. Odległość między podwójnymi parami galileuszowymi nie jest krytyczna. Położenie L3 można precyzyjnie regulować, aby kontrolować zbieżność wiązki; Regulacja <1 mm będzie potrzebna do dostosowania ostrości lasera do ostrości obrazu. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie obiektywy, filtry, przysłony itp. z modułu pośredniego, który może znajdować się na ścieżce wiązki (lub bądź świadomy, co one robią i odpowiednio dostosuj system).

Wykres 3 Wyrównanie wiązki laserowej przez podwójne soczewki Galileusza. Usuń zaciski mikroskopu z jednej strony mikroskopu, aby mikroskop można było przesunąć poza ścieżkę wiązki, ale pozostałe zaciski umożliwią precyzyjną zmianę położenia mikroskopu. Pomyśl o bezpieczeństwie lasera. Upewnij się, że moc lasera jest ustawiona na minimum za pomocą polaryzatora Glan-Thompson. Włącz laser i view wzór wiązki laserowej na ścianie. Może się okazać, że papier przyklejony do ściany pomaga zobaczyć plamkę lasera. Systematycznie dostosowuj pozycje soczewek, aby wyczuć, co robią z rozmiarem i wyglądem wiązki. Powinieneś zobaczyć coś, co wygląda jak panel A, w którym intensywny punkt jest mimośrodowo umieszczony w ściemnianym profilu. Użyj lustra zamontowanego na szynie, aby wyregulować intensywność miejsca do środka, jak pokazano na panelu B. Teraz użyj górnego lustra zamontowanego na peryskopie, aby uzyskać jednolity profil peryferyjny. Jeśli wszystko jest prawidłowo wyrównane, powinno się teraz stwierdzić, że przesuwanie soczewek powoduje symetryczne rozszerzanie i kurczenie się wiązki. Przesuń soczewki z powrotem do pozycji początkowych, jak pokazano na rysunku 2. Teraz przechwyć wiązkę w odległości tylnego otworu obiektywu. Powinien być okrągły, co najmniej wystarczająco duży, aby wypełnić tylny otwór, i mieć jednolitą jasność. Nie ma nic złego w tym, że jest większy, o ile masz wystarczającą moc lasera do swoich ablacji. Oceń zbieżność, porównując średnicę wiązki w odległości tylnego otworu obiektywu od ściany. Średnica belki powinna być identyczna dla belki o zerowej zbieżności. Podziałka wynosi 10 mm.

Wykres 4 Wyrównanie ekspandowanej wiązki laserowej do wiązki skraplacza. Wyłącz laser i przesuń mikroskop z powrotem na ścieżkę wiązki laserowej za pomocą zacisków, gdy wyrównanie się zatrzyma. Włącz, wyrównaj i ustaw ostrość wiązki kondensora za pomocą soczewki obiektywu. Przyklej papier do okularów, aby nikt nie mógł zobaczyć intensywnego odbitego światła laserowego. Obróć wieżyczkę obiektywu do pozycji otwartej. Połóż kartkę papieru na scenie, aby zasłonić wiązkę skraplacza. Włącz laser w trybie ciągłym i zdejmij mechaniczną przesłonę bezpieczeństwa. Powinieneś zobaczyć trochę światła laserowego przechodzącego przez mikroskop. Poluzuj zaciski mikroskopu i delikatnie popchnij mikroskop, aby wyrównać wiązkę laserową z wiązką kondensatora. Wiązka laserowa powinna być okrągła i mieć jednolitą jasność. Czasami przydatna jest regulacja soczewek montowanych na szynie. Powinieneś być w stanie równomiernie rozszerzać i kurczyć wiązkę laserową, jeśli wyrównanie jest prawidłowe. Za pomocą lustra montowanego na szynie można wyśrodkować zawężoną wiązkę laserową do minimalnie wyśrodkowanej wiązki kondensatora, a następnie rozszerzyć ją do żądanego rozmiaru. Po dostosowaniu położenia zawężonej wiązki za pomocą lustra szynowego konieczne będzie ponowne wyregulowanie zamontowanego od góry lustra peryskopowego, aby utrzymać jednolitą jasność rozszerzonej wiązki. Jeśli nie możesz uzyskać okrągłej wyśrodkowanej wiązki laserowej, będziesz musiał wrócić do wcześniejszych kroków wyrównywania.

Wykres 5 Wyśrodkuj punkt ablacji i dostosuj zbieżność wiązki laserowej, aby uzyskać optymalną ostrość. Wyłącz i wyłącz laser. Wyjmij papier i zamontuj lustrzane szkiełko docelowe (możesz również użyć tuszu markera permanentnego na szkiełku nakrywkowym jako tarczy²). Zarysowania obrazu na lustrzanej powierzchni za pomocą obiektywu olejnego 60X 1.4na) Teraz zobrazuj powierzchnię za pomocą konfokalnego lub CCD. Nie patrz przez okulary, gdy laser jest włączony. Włącz i odkręć migawkę lasera. Ustaw laser w trybie wyzwalania, najniższą moc i 100 Hz. Wyzwal około 10 impulsów. Powinieneś zobaczyć plamkę ablacyjną o średnicy 1-5 μm w odległości 10 μm od środka widzenia. Jeśli nie widzisz miejsca ablacji, możesz zwiększać moc lasera w krokach co 5-10%. Po zidentyfikowaniu miejsca ablacji wyśrodkuj je w polu widzenia. Umieść krzyż nitkowy na współrzędnych 256, 256, jeśli oglądasz obraz 512X512. Jeśli dostosujesz plamkę lasera do środka, nie zmieni ona pozycji wraz z powiększaniem. Użyj lustra zamontowanego na szynie, aby przesunąć plamkę ablacji do środkowego krzyża nitkowego. Ponownie oceń jednorodność wiązki laserowej, patrząc na wiązkę z usuniętym obiektywem, jak opisano powyżej na rysunku 4. Dostosuj jednorodność wiązki za pomocą górnego lustra zamontowanego w peryskopie. Powtórz ocenę położenia punktu ablacji. Jest to proces iteracyjny, który należy powtarzać, aż punkt ablacji zostanie wyśrodkowany, a rozszerzona wiązka będzie jednolita. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, punkt ablacji będzie okrągły, jak widać w miejscu ablacji w Focus na rysunku. Następnie oceń ognisko wiązki laserowej w osi Z. Uruchom laser, aby wytworzyć plamkę ablacyjną o wielkości około 1 um w środku. Teraz przesuń suwak o około 5 um w bok i skup się 1 um poniżej powierzchni szkiełka docelowego. Uruchom laser przy użyciu tych samych ustawień lasera, które zostały użyte w przypadku pierwszego punktu ablacji. Powtórz po ustawieniu ostrości 1 um nad powierzchnią szkiełka docelowego. Jeśli wiązka laserowa jest skupiona na ostrości obrazu, powinieneś zobaczyć wzór podobny do pokazanego na tym rysunku. Największa plamka ablacyjna powinna odpowiadać ostrości obrazu, a plamki ablacji powyżej i poniżej ostrości powinny symetrycznie się zmniejszać. Dostosuj obiektyw L3, aby wyrównać płaszczyzny ogniskowych. Odsunięcie soczewki L3 od mikroskopu sprawi, że wiązka będzie bardziej zbieżna, a punkt ablacji zbliży się do obiektywu. Małe korekty <1 mm będą potrzebne w pobliżu ostrości. Jesteś teraz gotowy do cięcia aksonów. Pasek skali wynosi 1 um.

Wykres 6 Ślimaki montażowe do laserowej aksotomii i obrazowania poklatkowego. Agaroza 10% w soli fizjologicznej jest podgrzewana do całkowitego stopienia. Małą kroplę umieszcza się na szklanym szkiełku mikroskopowym, a następnie spłaszcza z innym szkiełkiem, tworząc płaską podkładkę. Grubość podkładki ustala się za pomocą taśmy na dwóch sąsiednich szkiełkach. Podkładkę pozostawia się na około 1 minutę, a następnie slajdy są rozdzielane. Wierzchołek "Sharpie" jest używany jako foremka do ciastek, aby uformować podkładkę o jednolitym rozmiarze około 13 mm. 1 ul 10 mM Muscimol i 1 ul mikrosfer są dodawane do środka podkładki (komunikacja osobista Fang-Yen). Robaki dodaje się do kropli 2 ul i orientuje przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego. Następnie wazelinę nakłada się ze strzykawki (igła 20-25 ga) na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby ją uszczelnić.

Wykres 7 Typowe wyniki aksotomii laserowej u C. elegans. W A można zobaczyć nienaruszony akson na krótko przed i po aksotomii laserowej. Szczelina wynosi zwykle około 0,5-1um. B pokazuje aksotomię laserową jednego aksonu bez uszkadzania pobliskiego aksonu oddalonego o około 1 um. Laser został ustawiony na około 10% mocy (0,3 mW średnio przy 2500 Hz) i 100 impulsów. Pasek skali wynosi 5 um.

Rysunek 8. Typowa regeneracja typu dzikiego L4. Jest to szereg czasowy przedstawiający ablację i zapis poklatkowy regeneracji aksonów. Krótko po aksotomii laserowej po 0 minutach można zobaczyć bańkę retrakcyjną. Po 138 minutach żarówka retrakcyjna cofnęła się do najdalszego zakresu i teraz zaczęła się przebudowywać. Sporadyczne wypukłości błony (mircospikes lub filopodia) można zobaczyć wzdłuż trzonu aksonu (strzałki 138 i 324). Prawy pień rozciąga dobrze uformowany, zwarty stożek wzrostu po 360 minutach. W 414 minucie oba pnie mają wydłużone stożki wzrostu. Początkowe embrionalne stożki wzrostu stają się dystroficzne, gdy rozciągają się w kierunku grzbietowego rdzenia nerwowego (414, 519 i 597 minut). Dystroficzne stożki wzrostu zatrzymują się przed grzbietowym rdzeniem nerwowym (960 minut). Groty strzał wskazują na bliższy kikut i stożki wzrostu. Strzałki wskazują występy błony wzdłuż bliższego trzonu aksonu. Podziałka 20um.

Film 1. Film przedstawiający regenerację aksonów typu dzikiego. Ten film jest zgodny z punktami czasowymi pokazanymi na rysunku 8. Robaki zostały zamontowane zgodnie z opisem w protokole, a aksony były obrazowane co trzy minuty przez około 10 godzin. Stosy Z (20 X 1um) zostały wykonane w każdym punkcie czasowym i połączone w pojedyncze obrazy za pomocą algorytmu maksymalnej projekcji (NIS Elements). Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Istnieje kilka dobrych omówień mikrochirurgii laserowej z różnymi systemami laserowymi^3,5-11. Femtosekundowe lasery w podczerwieni są "złotym standardem" w subkomórkowej ablacji laserowej¹² i wygodne, jeśli są związane z placówką obrazowania, ale często są zbyt kosztowne dla indywidualnych użytkowników. Jeśli potrzebujesz femtosekundowego lasera IR do obrazowania próbki ze względu na głębokość obrazowania, prawdopodobnie będziesz potrzebować go do akskotomii laserowej. Przezroczyste tkanki z docelowymi aksonami w odległości 30-50 um od powierzchni są prawdopodobnie możliwe do uzyskania za pomocą niebieskich i zielonych laserów impulsowych w zakresie 20 uJ/impuls celowanych przez soczewkę o wysokim zanurzeniu w paliwie. W przypadku laserów nano i pico second będzie więcej szkód ubocznych w porównaniu z laserem femtosekundowym, zwłaszcza wraz ze wzrostem głębokości aksonu docelowego. C. elegans jest przezroczysty, a wszystkie aksony znajdują się w odległości 20-30 um od powierzchni. Rutynowo tniemy aksony silnikowe, które znajdują się w odległości do 5 um od powierzchni. Z łatwością wycięliśmy również aksony w pierścieniu nerwowym, które znajdują się około 20 um od powierzchni naskórka. Stwierdziliśmy, że granica cięcia aksonów wynosi około 30-50 um przez średnicę dorosłego robaka. Jest prawdopodobne, że opisywany tutaj system ablacji laserowej będzie dobrze współpracował z wieloma różnymi preparatami, które spełniają kryteria przezroczystości i głębokości aksonów docelowych. Mimo to, biorąc pod uwagę teoretyczne zalety femtosekundowych laserów IR, jest to nieco zaskakujące, że lasery nano i pikosekundowe 355 nm i 532 nm sprawdzają się tak dobrze w aksotomii laserowej u C. elegans^6,13. Nie widzimy różnic w regeneracji aksonów w odpowiedzi na aksotomię laserową z laserami nanosekundowymi 440 nm, nanosekundowymi 532 nm i femtosekundowymi laserami IR.

Półprzewodnikowe lasery UV 355 nm są mniej więcej takie same jak diody 532 nm pompowane pasywnie laser na ciele stałym Q-Switched, ale wymagają albo większych mocy, albo optyki, która skutecznie przepuszcza te krótsze fale. Większość układów optycznych jest zaprojektowana tak, aby dobrze radziła sobie ze światłem widzialnym o długości fali 400-700 nm. Lasery o długości fali 355 nm mają pewne^zalety6 , takie jak obniżony próg plazmy, mniejszy rozmiar plamki i dichroiczny długi przepust, który skutecznie skierowałby 100% lasera ablacyjnego na cel i umożliwiłby jednoczesne obrazowanie GFP bez utraty sygnału próbki. Niebieskie lasery 440 nm zachowałyby zalety pracy z laserem światła widzialnego (dobra wydajność ze standardową optyką i bezpieczeństwo). Niestety, koszt lasera półprzewodnikowego DPP Q-switch 440 nm jest obecnie 3 razy wyższy niż koszt lasera 355 nm lub 532 nm o podobnej mocy. Gdybyśmy projektowali nowy system dla C. elegans , w którym głębokość docelowa jest minimalna, zdecydowalibyśmy się na przezroczystą soczewkę UV (koszt około 3,000 USD za soczewkę olejową 40X 1,3 na o przepuszczalności 50-70% przy 355 nm) i laser 355 nm wytwarzający 5-10 uJ / impuls przy 1-20 kHz.

Uważa się, że ablacja aksonów jest spowodowana tworzeniem się plazmy. Krótsze impulsy wytworzą progi plazmy przy niższej mocy, a objętości plazmy będą mniejsze⁶. Celem jest wyprodukowanie najmniejszej i najkrócej żyjącej plazmy poprzez dostosowanie energii impulsu do najniższej mocy. Większe, długowieczne plazmy będą generować pęcherzyki kawitacyjne, które uszkadzają otaczające komórki. Generalnie stwierdziliśmy, że ablacja przy użyciu około 50-100 impulsów o najwyższej częstotliwości (tj. 2,5 kHz) daje najlepsze rezultaty. Sugeruje to, że uszkodzenia mogą być stopniowo integrowane w serii impulsów, aby lepiej kontrolować zakres uszkodzeń. Opisany tutaj system ablacji laserowej jest bardzo wyrozumiały, jeśli wiązka jest dokładnie wyrównana i rozszerzona. Zaczynamy ciąć aksony u dorosłych robaków przy 10% mocy lasera (średnio 0,3 mW mierzonej przy 2500 Hz i szacowanej wartości 1 uJ/impuls) i możemy ciąć z ograniczonymi miejscowymi uszkodzeniami dzięki 14% mocy. Większe obszary uszkodzeń można zaobserwować od 15-39% mocy lasera, ale dopiero powyżej 40% mocy (około 1 mW średnio mierzona przy 2500 Hz) robaki eksplodują z powodu dużych pęcherzyków kawitacyjnych i uszkodzenia naskórka robaka.

Artykuł Steinmeyera i wsp.^{2010 2} jest doskonałym źródłem do skonstruowania systemu ablacji laserowej. Leon Avery ma również ładny praktyczny opis systemu ablacji laserowej opartego na niedrogim laserze gazowym N2 o długości fali 337 nm i udziela kilku świetnych praktycznych porad (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Projektując własny system, należy najpierw porozmawiać z przedstawicielem mikroskopu, aby ustalić, w jaki sposób skierować laser ablacyjny na obiektyw mikroskopu. Mikroskop powinien być zamontowany na stole do izolacji drgań (Newport, TMI, Thor). Optymalna jest płyta stykowa, ale z pozycjonerami magnetycznymi można nadal używać solidnego blatu stalowego. Dedykowany moduł pośredni na pionowej lunecie jest fajny, ponieważ wszystkie elementy optyczne można pozostawić na miejscu. Jednak tańsze i wygodniejsze może być użycie portu kamery (odwróconego) lub "sumatora" podłączonego do portu epifluorescencyjnego. Musisz znać rozmiar tylnej apertury i przepuszczalność (na długości fali lasera ablacyjnego) soczewki obiektywu, której zamierzasz użyć. Po podjęciu decyzji o wyborze lasera (np. Crylas, TEEM, Crystal lub CRC) należy skontaktować się z firmą Thor lub Newport w celu uzyskania pomocy w doborze odpowiednich elementów optycznych, sprzętu i sprzętu zabezpieczającego. Zdecydowaliśmy się na podwójny ekspander wiązki Galileusza, aby zaoszczędzić miejsce, ale prostszy ekspander keplerowski jest opcją (f2/f1 = współczynnik rozszerzalności). Niestandardowy ekspander wiązki będzie najtańszy, ale Newport, Thor i kilku producentów laserów oferuje doskonałej jakości komercyjne ekspandery wiązki. Niektórzy producenci laserów oferują również tłumiki sterowane ręcznie i elektronicznie, które mogą być opłacalne i oszczędzać miejsce, ale nie tak wszechstronne jak polaryzator Glan-Thompson i płytka półfalowa. Będziesz także musiał zdecydować, jak sterować laserem. Możesz zaprojektować sterownik oparty na LabView, użyć komercyjnego generatora TTL lub oprogramowania dostarczonego przez firmę laserową. Przedyskutuj opcje z konkretnym producentem lasera.

Listę używanego przez nas sprzętu podaliśmy jedynie jako ogólny przewodnik. Opisany tutaj system kosztował około 15 000 USD po dodaniu do naszego istniejącego systemu obrazowania. Lokalny wydział fizyki często ma kogoś, kto chętnie udzieli praktycznego wprowadzenia do bezpiecznej pracy z laserami o swobodnej wiązce.

Niedawno opisano alternatywne metody unieruchamiania i obrazowania poklatkowego C. elegans. ¹⁴

Rozwiązywanie problemów

Najtrudniejszym i najbardziej krytycznym krokiem jest wyrównanie wyśrodkowanej wiązki rozszerzonej do osi optycznej mikroskopu. Po wyśrodkowaniu i rozszerzeniu wiązki przez soczewki Galileusza należy ciężko pracować, aby ustawić ją w odległości 5 μm od osi optycznej mikroskopu PRZED użyciem lusterek sterujących do ostatecznego wyrównania do środka. Nadmierne użycie lusterek kierowniczych w celu wyrównania wiązki z mikroskopem spowoduje przesunięcie jej poza oś przez ekspander wiązki. ZACHOWUJĄC SZCZEGÓLNĄ OSTROŻNOŚĆ Można stłumić wiązkę laserową za pomocą odpowiedniego filtra ND i bezpośrednio view profil wiązki laserowej na odblaskowym obiekcie (lustro na powierzchni przedniej). Możesz delikatnie popchnąć mikroskop, aby precyzyjnie wyśrodkować wiązkę w polu widzenia obiektywu 60X (jeśli nie można jej wyśrodkować w zakresie góra/dół, musisz wyregulować wysokość szyny). Profil wiązki może być użyty do precyzyjnego wyrównania osi optycznej mikroskopu, aby uzyskać wyśrodkowaną wiązkę, która jest okrągła i "rozbłyskuje" symetrycznie. Asymetryczny rozbłysk wskazuje, że oś mikroskopu nie jest idealnie wyrównana (lub szyna nie jest wypoziomowana). Na koniec należy wyregulować L3 i zobaczyć równomierne i symetryczne rozszerzanie i kurczenie się wiązki. Ustaw mikroskop precyzyjnie na powierzchni docelowej, a następnie wyreguluj L3, aby skupić wiązkę lasera na najmniejszym punkcie. Powinieneś teraz stwierdzić, że wiązka laserowa znajduje się w odległości 5 μm od środka podczas obrazowania za pomocą systemu LSCM lub CCD, a plamka ablacji znajduje się w odległości 1 μm od ogniska Z.

Jeśli zauważysz, że "wysadzasz" robaki lub konsekwentnie generujesz duże pęcherzyki kawitacyjne do cięcia aksonów, Twoim problemem jest najprawdopodobniej dokładne ustawienie lasera ablacyjnego. Upewnij się, że minimalny (<500nm) punkt ablacji jest zlokalizowany w ognisku Z (dostosuj zbieżność za pomocą soczewki L3) i w punkcie odniesienia XY (wyreguluj za pomocą ostatniego kinematycznie zamontowanego lustra).

Celowanie w aksony bliżej powierzchni będzie wymagało mniejszej mocy lasera. Podobnie, mniejsze zwierzęta (L1 i L2) będą wymagały mniejszej mocy lasera do aksotomii w porównaniu do celowania w te same aksony u dorosłych.

Jeśli aksony typu dzikiego nie regenerują się lub aksony blakną, należy spróbować zmniejszyć moc lasera obrazującego lub zmniejszyć częstotliwość próbkowania. Jeśli twoje robaki umrą lub staną się chore, spróbuj zmniejszyć procent agarozy w krokach co 1%. Upewnij się, że nie przesuwasz szkiełka nakrywkowego po zamontowaniu robaków, ponieważ często spowoduje to ich śmierć przy użyciu wysokoprocentowej agarozy i mikrosfer.

Jeśli twoje robaki pękną lub umrą podczas sesji poklatkowej, jest to spowodowane: 1. Procent agarozy jest zbyt wysoki. 2. Uszkodzenie naskórka przez laser ablacyjny. 3. Ruch szkiełka nakrywkowego po zamontowaniu. Jeśli uszkodzenie naskórka jest winne, będzie to dotyczyło tylko zamontowanych robaków, które zostały namierzone laserem ablacyjnym.

Jeśli robak porusza się zbyt mocno podczas sesji poklatkowej, spróbuj zwiększyć procent agarozy w krokach co 0,5%. Zdrowe aksony u zdrowych robaków są zawsze "aktywne" i wykazują stały poziom fluorescencji. Jeśli zauważysz nagły spadek fluorescencji lub aktywności, robak umiera lub jest martwy. Wiele paciorkowatych lub rozdrobnionych aksonów jest pewnym znakiem umierającego lub martwego robaka.

Jeśli masz problemy z utrzymaniem ostrości aksonów podczas całej sesji poklatkowej, może to oznaczać kilka różnych problemów. Najpierw sprawdź dryft sceny, obrazując obojętną próbkę na szkiełku przez 10 godzin. Dryft o kilka mikronów może być spowodowany niestabilnością termiczną, ale większy niż 5 μm jest prawdopodobnie spowodowany problemami mechanicznymi z mikroskopem. Problemy z montażem są częstsze. Pozwól zamontowanym robakom zrównoważyć się ze stolikiem mikroskopu przez 30 minut przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. Sprawdź, czy uszczelka wazelinowa nie przecieka w trakcie sesji poklatkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa odczynnika	Numer katalogowy	firmy	Komentarze (opcjonalnie)
535 nm Laser	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal i CRC oferują również porównywalne lasery)
Wszystkie optyki i sprzęt			(Thor oferuje porównywalną optykę i sprzęt)
Uchwyt optyczny SUPREMA, średnica 1,0 cala	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
słupek o średnicy 1 ", wysokość 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec słupkowy o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Achromatyczna płyta falowa zerowego rzędu, ½ Opóźnienie fali, 400-700nm	Newport Corp.	10RP52-1
1 Stolik obrotowy, 1" Aperature	Newport Corp.	RSP-1T	1
słupek o średnicy 1 ", wysokość 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec słupkowy o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Laserowy polaryzator kalcytowy z żołąłą, 430-700nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
Mocowanie obrotowe polaryzatora	Newport Corp.	Zobacz materiał RM25A	1
¼ " podkładka dystansowa do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-0,25	1
½ " wysokość, słupek o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-0.5	1
Widelec, słupek o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Wysypisko belek	Newport Corp.	PL15	1
Mocowanie obiektywu mikroskopu	Newport Corp.	LH-OBJ1
Słupek o średnicy 1 ", wysokość 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec słupkowy o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
wysokoenergetyczne lustro laserowe Nd:YAG, średnica 25,4 mm, 45°, 532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
SUPREMA, średnica 1,0 cala, otwór montażowy bez odstępu	Newport Corp.	SN100C-F	2
Śruba regulacyjna pokrętła o wysokiej precyzji, skok 12,7 mm, 100TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K
Adapter z 4 gwintami, ¼-20 męski, 8-32 żeński	Newport Corp.	SS-1-B	Zacisk prętowy
2 do pręta o średnicy 1,5 cala	Newport Corp.	340-RC	2
pręty, 14 cali (35,5 cm) wysokości	Newport Corp.	40	1
Nośnik szynowy do X26, kwadratowy o długości 40 mm	Newport Corp.	CN26-40
4 Szyna stalowa, długość 384 mm (15 ")	Newport Corp.	X26-384	Platforma
1 pręta do pręta o średnicy 1,5 cala	Newport Corp.	300-P	2
pręty, 14 cali (35,5 cm) wysokości	Newport Corp.	40	2
Soczewka płasko-wklęsła, średnica 12,7 mm, -25 mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
soczewki płasko-wypukłe, średnica 25,4 mm, 50,2 mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
soczewka płasko-wypukła, średnica 25,4 mm, 62,9 mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
Stałe mocowanie obiektywu, średnica 0,5", wysokość osi 1,0"	Newport Corp.	LH-0.5
2 Stałe mocowanie obiektywu, średnica 1,0", wysokość osi 1,0"	Newport Corp.	LH-1	2
Mikrosfery 0,1um	Polysciences, Inc.	00876
Agarose	Research Products International Corp.	A20090	EEO ma znaczenie
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523