Budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans

Podsumowanie

Aksonotomia laserowa z następującym po niej obrazowaniem time-lapse jest czułą metodą badania wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, a jednocześnie niedrogi system ablacji laserowej można z łatwością dołączyć do większości mikroskopów. Obrazowanie time-lapse trwające 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia nicienia.

Streszczenie

Aksonotomia laserowa z następującą za nią mikroskopią poklatkową jest czułym testem fenotypów regeneracji aksonów u C. elegans¹. Główną trudnością w tym badaniu jest postrzegany koszt (25-100 tys. USD) oraz wiedza techniczna wymagana do wdrożenia systemu ablacji laserowej^2,3. Jednakże impulsowe lasery półprzewodnikowe o umiarkowanych kosztach (<10 tys. USD) mogą zapewnić niezawodne działanie podczas ablacji laserowej w preparatach przezroczystych, w których docelowe aksony znajdują się „blisko” powierzchni tkanki. Konstrukcja i wyrównanie systemu mogą zostać zrealizowane w ciągu jednego dnia. Tor optyczny od światła skupionego kondensatora do lasera ablacyjnego stanowi wygodny przewodnik do wyrównania. Moduł pośredni z usuniętą całą optyką może zostać przeznaczony dla lasera ablacyjnego, co gwarantuje, że żadne elementy optyczne nie muszą być przesuwane podczas sesji ablacji laserowej. Lustro dichroiczne w module pośrednim umożliwia jednoczesne obrazowanie i ablację laserową. Centrowanie wiązki lasera względem wiązki wychodzącej z ogniskujejącej soczewki kondensatora mikroskopu prowadzi początkowe wyrównanie systemu. Różnorodne soczewki są wykorzystywane do kondycjonowania i rozszerzania wiązki laserowej w celu wypełnienia tylnej apertury wybranej soczewki obiektywu. Końcowe wyrównanie i testowanie przeprowadza się z użyciem szkiełka przedmiotowego z lustrem na przedniej powierzchni jako celu. Moc lasera jest dostosowywana tak, aby uzyskać minimalną wielkość punktu ablacyjnego (<1um). Punkt ablacyjny jest centrowany za pomocą precyzyjnych regulacji ostatniego lustra zamontowanego kinematycznie, tak aby przeciął się z nitkami utrwalonymi w oknie obrazowania. Moc lasera do aksonotomii będzie około 10X wyższa niż ta potrzebna do uzyskania minimalnego punktu ablacyjnego na szkiełku docelowym (wartość ta może się różnić w zależności od użytego celu). Nicienie mogą być unieruchomione do aksonotomii laserowej i obrazowania poklatkowego poprzez montaż na podkładkach agarozy (lub w komorach mikroprzepływowych⁴). Podkładki agarozy łatwo przygotować z 10% agarozy w soli zrównoważonej, roztopionej w mikrofalówce. Kroplę stopionej agarozy umieszcza się na szkiełku przedmiotowym i spłaszcza drugim szkiełkiem przedmiotowym do postaci podkładki o grubości około 200 um (jako przekładki stosuje się pojedynczą warstwę taśmy czasowej na sąsiednich szkiełkach). Nakrętka markera typu „Sharpie” służy do wycięcia okrągłej podkładki o jednolitej średnicy 13mm. Do środka podkładki dodaje się środek znieczulający (1ul muscimolu 20mM) i mikrosfery (komunikacja osobista z Chrisem Fang-Yenem) (1ul 2,65% polistyrenu 0,1 um w wodzie), a następnie 3-5 nicieni zorientowanych tak, aby leżały na lewym boku. Nakłada się szkiełko cover-slip, a następnie używa wazeliny do uszczelnienia szkiełka i zapobiegania odparowaniu próbki.

Protokół

1. Konstrukcja systemu ablacji laserowej

Podczas wstępnego ustawiania należy nosić okulary ochronne do laserów i stosować zasady bezpieczeństwa pracy z laserem. Nigdy nie należy patrzeć przez okulary podczas włączonego lasera.

1. Rozmieść komponenty na stole optycznym zgodnie z rys. 1 (patrz również przykład²). Przykręć laser (używając podstawki, jeśli jest ona wymagana), wspornik peryskopu oraz podwyższone podpory szyny.
2. Ustaw mikroskop tak, aby był wyrównany z osią szyny. Wyrównaj go z wiązką światła przechodzącego z soczewki kondensora mikroskopu. Dostosuj wysokość szyny (używając poziomicy) oraz jej położenie za pomocą regulowanej przysłony lub soczewki zamocowanej do szyny. Przysłona lub soczewka musi być wyrównana z wiązką kondensora na obu końcach szyny. Do regulacji wysokości szyny można wykorzystać podnośniki laboratoryjne.
3. Wyrównaj polaryzator Glana-Thompsona i płytkę półfalową względem wiązki lasera. Do wykonania tego wyrównania laser nie musi być włączony. Wiązka musi po prostu przejść przez oba elementy, nie uderzając w ich krawędzie. Obróć polaryzator, aby zapewnić wygodną orientację i pozycję dla pochłaniacza wiązki (rys. 1). Płytkę półfalową będziesz obracać w celu regulacji mocy lasera. Przymocuj komponenty do stołu optycznego.
4. Włącz laser, ustaw częstotliwość impulsów na 100, wybierz tryb ciągły i zredukuj moc do minimum za pomocą płytki półfalowej. Użyj karteczki samoprzylepnej lub papieru do soczewek, aby zwizualizować wiązkę lasera.
5. Wyreguluj i zablokuj lustra w oprawach kinematycznych sekwencyjnie od lasera, aby doprowadzić wiązkę do lustra zamontowanego na końcu podwyższonej szyny. Wiązka lasera powinna być wyrównana w przybliżeniu do centrum luster. Lustra powinny być ustawione pod kątem około 45 stopni względem osi wiązki lasera (rys. 1).
6. Wstępnie wyreguluj lustro w oprawie kinematycznej na górze peryskopu oraz na końcu szyny, aby wyrównać wiązkę lasera z centrum wiązki światła przechodzącego z mikroskopu. Zarówno wiązkę lasera, jak i wiązkę światła przechodzącego z mikroskopu można wizualizować jednocześnie, wkładając papier na drogę wiązki. Upewnij się, że wszystkie filtry ND i przysłony w module pośrednim są wyjęte lub całkowicie otwarte.
7. Precyzyjnie wyrównaj wiązkę lasera z centrum wiązki światła przechodzącego, korzystając z regulacji precyzyjnej górnego lustra peryskopu i luster na szynie. Przystaw papier blisko lustra na szynie i wyrównaj wiązkę lasera z centrum wiązki światła przechodzącego za pomocą lustra górnego peryskopu. Przystaw papier w pobliżu portu mikroskopu i wyrównaj wiązkę lasera z centrum wiązki światła przechodzącego za pomocą regulacji lustra na szynie (rys. 2).
8. Umieść karteczkę samoprzylepną na drodze wiązki pomiędzy wyrównaną soczewką kondensora a otwartą obrotnicą obiektywów. Powinieneś zobaczyć wiązkę światła przechodzącego z mniejszą wiązką lasera w pobliżu centrum. Użyj regulacji precyzyjnej lustra na szynie, aby wycentrować wiązkę lasera. Przymocuj mikroskop w miejscu za pomocą zacisków.

Kroki 1.9-1.12 są opcjonalne, jednak ocena wyrównania i ablacji laserowej przed dodaniem soczewek rozszerzających wiązkę jest łatwa i przydatna.

9. Wyłącz laser i zamknij mechaniczną migawkę bezpieczeństwa. Odsuń dichroik 50% z drogi wiązki. Mimo że bezpośrednie światło lasera nie dotrze do okularów, światło odbite może być bardzo intensywne. Zamocuj preparat celny do precyzyjnego wyrównania i obrazuj go za pomocą obiektywu olejowego 60X. Ustaw ostrość na rysy na szkiełku. Włóż filtry ND4 i ND8 do modułu pośredniego.
10. Obrazuj preparat celny za pomocą systemu CLSM, dysku wirującego lub kamery CCD. Wsuń dichroik 50% na drogę lasera. Od tego momentu nigdy nie należy patrzeć przez okulary podczas włączonego lasera ablacyjnego. Włącz laser ablacyjny i ustaw tryb na wyzwalany (triggered), częstotliwość na 100 oraz liczbę impulsów na 10. Upewnij się, że moc jest nadal ustawiona na minimum za pomocą płytki półfalowej, a następnie otwórz mechaniczną migawkę bezpieczeństwa. Można jednocześnie obrazować i używać lasera ablacyjnego.
11. Podczas obrazowania preparatu celnego wyzwól laser ablacyjny. Sprawdź, czy na preparacie pojawiła się plamka ablacyjna o średnicy 1-10 µm. Koleno usuwaj filtry ND, aż plamka ablacyjna stanie się widoczna. Za pomocą lustra na szynie ustaw plamkę ablacyjną na środek obrazu. Warto ponownie dodać filtr ND, aby mieć możliwość precyzyjnego zwiększenia mocy lasera za pomocą płytki półfalowej w celu uzyskania plamki ablacyjnej o rozmiarze <1 µm. Obrazuj przy rozdzielczości 0,2 µm/piksel lub mniejszej i precyzyjnie ustaw plamkę ablacyjną na środek obrazu (pozycja 256,256 przy obrazie 512X512).
12. Sprawdź głębię ostrości i oś wiązki lasera. Przesuwaj ostrość w górę i w dół o 1-2 µm i sprawdzaj pozycję oraz rozmiar plamki ablacyjnej. Jeśli wiązka lasera jest wyrównana osiowo, plamka ablacyjna nie będzie się przemieszczać. Nieukształtowana wiązka lasera rozdzieli moc na obszarze kilku µm (około 3-5 µm od góry do dołu ogniska).

2. Dodaj soczewki w celu rozszerzenia wiązki lasera tak, aby wypełniła tylną aperturę obiektywu, oraz dostosuj zbieżność w celu kontroli ogniskowania

1. System ten wykorzystuje podwójne rozszerzacze wiązki galileuszowskie do rozszerzenia wiązki laserowej w celu wypełnienia tylnej apertury obiektywu (10 mm). Zamocuj 4 soczewki w uchwytach i przymocuj je do szyny (L1f1+L2f2 oraz L3f1'+L4f2'). Dostosuj ich pozycje tak, aby wszystkie soczewki znajdowały się na tej samej osi optycznej i były dokładnie prostopadłe do wiązki laserowej (rys. 2).
2. Włącz laser i ustaw go na minimalną moc oraz tryb ciągły. Wykonaj wstępne ustawienie wyrównania wiązki przez każdą soczewkę, używając papieru, aby zobaczyć wiązkę laserową oraz wiązkę światła przechodzącego z kondensora mikroskopu. Wyłącz laser i zamknij przesłonę.
3. Zdejmij zaciski z jednej strony mikroskopu i wysuń mikroskop z drogi wiązki laserowej. Włącz laser i otwórz przesłonę bezpieczeństwa.
4. Precyzyjne wyrównanie soczewek i wiązki laserowej można przeprowadzić, obserwując rozszerzoną wiązkę laserową na pobliskiej ścianie. Wiązka powinna symetrycznie rozszerzać się i zwężać podczas przesuwania soczewek. Dostosuj dwa ostatnie lustra w mocowaniach kinematycznych, aby wyrównać wiązkę (rys. 3).
5. Profil wyrównanej i rozszerzonej wiązki powinien być okrągły i o jednolitej jasności (rys. 3). Rozmiar i jednorodność wiązki można sprawdzić za pomocą karteczki Post-it umieszczonej w szacowanej pozycji tylnej apertury obiektywu.
6. Wiązkę należy ustawić na zerową konwergencję dla układów optycznych nieskończonych. Konwergencję można oszacować, obserwując, jak zmienia się rozmiar wiązki podczas oddalania karteczki Post-it od soczewek. Wyłącz laser i zamknij mechaniczną przesłonę.
7. Wsuń mikroskop z powrotem na drogę wiązki laserowej, używając stałych zacisków do zdefiniowania prawidłowego wyrównania. Zamontuj zaciski po wolnej stronie mikroskopu, ale nie dokręcaj ich mocno.
8. Włącz laser i otwórz przesłonę bezpieczeństwa. Obróć rewolwer obiektywów do pozycji otwartej. Połóż karteczkę Post-it na stoliku. Powinieneś zobaczyć rozszerzoną i jednorodną wiązkę laserową wycentrowaną względem wiązki światła przechodzącego z kondensora (rys. 4). Może być konieczne wycentrowanie jej poprzez poluzowanie zacisków mikroskopu i ostrożne przesunięcie urządzenia.
9. Zamknij przesłonę bezpieczeństwa i ustaw laser w trybie wyzwalania. Obróć obiektyw 60X na miejsce i zobrazuj rysy powierzchni na lamorce docelowej.
10. Otwórz przesłonę bezpieczeństwa, wyzwól laser ablacyjny i dostosuj moc lasera dla uzyskania minimalnego punktu ablacji. Punkt ablacji powinien być okrągły i znajdować się w odległości 5-10 µm od centrum obrazu.
11. Wycentruj punkt ablacji za pomocą precyzyjnych regulacji lustra szynowego w mocowaniu kinematycznym. Będzie konieczna iteracyjna regulacja lustra zamontowanego na szynie oraz górnego lustra peryskopu, aby zarówno wycentrować punkt ablacji, jak i zachować jednorodny profil wiązki.
12. Oceń ostrość Z lasera, przemieszczając punkt ostrości systematycznie w górę i w dół w krokach 1 µm i wyzwalając laser ablacyjny. Rozszerzona, wyrównana i skorygowana pod kątem konwergencji wiązka powinna powodować maksymalną ablację w ognisku obrazu oraz słabą lub żadną ablację 1 µm powyżej lub poniżej ogniska (rys. 5).
13. Dostosuj ostrość Z rozszerzonej wiązki, przesuwając soczewkę L3 teleskopu galileuszowskiego (rys. 2).

3. Laserowa aksonotomia i mikroskopia poklatkowa regeneracji aksonów

1. Podgrzewać w mikrofalówce 10% agarozę (RPI Molecular Biology Grade EEO 0.1 A2090) w zrównoważonym roztworze soli fizjologicznej aż do całkowitego stopienia. Umieścić na płycie grzejnej, aby utrzymać ją w stanie płynnym podczas montażu.
2. Kroplę stopionej agarozy nanosi się na szkiełko przedmiotowe i spłaszcza innym szkiełkiem do postaci krążka o grubości około 20 um (jako dystancer wykorzystuje się pojedynczą warstwę taśmy czasowej na sąsiednich szkiełkach).
3. Do wycięcia okrągłego krążka o jednolitej średnicy 13 mm używa się nakrętki markera „Sharpie”.
4. Do centrum krążka dodaje się środek znieczulający (1ul Muscimolu 20mM) oraz mikrosfery (Chris Fang-Yen, komunikacja osobista) (1ul 2,65% polistyrenu 0,1 um w wodzie), a następnie 3-5 nicieni zorientowanych tak, aby leżały na lewym boku. Nakłada się szkiełko nakrywki, a następnie używa wazeliny do uszczelnienia nakrywki w celu zapobiegania odparowywaniu próbki (rys. 6).
5. Na początku każdej sesji laser ablacyjny jest ustawiany względem krzyżyka, zgodnie z powyższym opisem. Zamknąć migawkę bezpieczeństwa lasera.
6. Usunąć cel ustawieniowy lasera i obrazować zamontowanego dorosłego nicienia z odpowiednim markerem fluorescencyjnym w neuronach docelowych. Obrazować aksony przy podobnym powiększeniu (0,2 um/piksel lub większym) i ustawić pod krzyżykiem (rys. 7).
7. Otworzyć migawkę bezpieczeństwa lasera i aktywować laser ablacyjny podczas obrazowania. Ocenić stan aksonu po aktywacji lasera i powoli zwiększać moc lasera, aż do przecięcia aksonu. Do przecięcia aksonów potrzeba około 10-krotnie większej mocy lasera niż do utworzenia punktu ablacji na szkiełku z celem ustawieniowym (około 1uJ/ ns impuls). Zazwyczaj przecinamy przy użyciu 10 impulsów przy 2,5 kHz i mocy ustawionej na około 0,27mW (średnia moc mierzona przy preparacie za pomocą miernika mocy Coherent FieldMaxII, z laserem ustawionym w trybie ciągłym przy 250 Hz). Ustawienie mocy lasera ablacyjnego będzie stałe dla przecinania aksonów w przyszłych eksperymentach (rys. 7).
8. Prawidłowo przecięty akson wykazuje przerwę o długości około 0,5-1 um bez utraty jasności na dwóch przeciętych końcach (rys. 7). Znaczna utrata jasności lub duża przerwa (2-10 um) często oznacza rozległe uszkodzenia poza aksonem spowodowane pęcherzykiem kawitacyjnym. Odcinki proksymalny i dystalny aksonu rozdzielą się i utworzą bulwy retrakcyjne w ciągu następnych 30 minut (rys. 8 i Film).
9. Ustabilizować zamontowane nicienie na stoliku mikroskopu przez 30 minut przed rozpoczęciem rejestracji time-lapse. Zminimalizuje to dryf wynikający z różnic temperatur i kurczenia się agarozy.
10. Parametry obrazowania time-lapse są konfigurowane za pomocą oprogramowania do obrazowania powiązanego z systemem. Zazwyczaj obrazujemy 10-20 kroków Z (1um/krok) przy rozdzielczości 0,1-0,2 um/piksel, stosując ustawienia wzmocnienia, przysłony (pinhole), szybkości skanowania i mocy lasera obrazującego, które minimalizują ekspozycję przy zachowaniu pożądanej rozdzielczości przestrzennej. Interwały próbkowania wynoszą zazwyczaj od 1 do 5 minut przez 15 godzin, zależnie od pożądanej rozdzielczości czasowej (rys. 8 i Film).
11. Dane z obrazowania time-lapse są konwertowane na filmy za pomocą programów NIS Elements lub ImageJ.

4. Reprezentatywne wyniki:

Aksonotomia laserowa z wykorzystaniem tego systemu jest niezawodna i rutynowa. Wyniki przedstawione na rysunku 7 są typowe. Obrazowanie regeneracji aksonów w czasie (time-lapse) przy zastosowaniu tego protokołu jest bardzo stabilne. Rutynowo przecinamy i obrazujemy do 5 aksonów u 5 różnych osobników na jednym szkiełku, korzystając z pompy z ruchomym stolikiem. Jedynym ograniczeniem jest czas potrzebny na zebranie obrazów każdego aksonu; na przykład, jeśli zebranie stosu obrazów dla jednego aksonu trwa 20 sekund, to przy próbkowaniu co 180 sekund można pobrać próbki z maksymalnie 9 aksonów (9 stosów). Przykład pokazany na rysunkach 8 i 9 jest reprezentatywnym wynikiem. Około 10% eksperymentów daje rezultaty tej jakości. Pozostałe eksperymenty dostarczają dobrych danych na temat fenotypu regeneracji, ale są mniej estetyczne ze względu na niewielkie drgania robaka, które zazwyczaj pojawiają się po 5–8 godzinach unieruchomienia.

Rysunek 1 System ablacji laserowej. Laser Nd:YAG o długości fali 532 nm jest zamontowany na płycie podwyższającej w celu wyrównania jego wysokości z pozostałymi komponentami i przykręcony do płyty optycznej. (Izolator optyczny jest opcjonalny i prawdopodobnie nie jest wymagany). Polaryzator Glana-Thompsona oraz płytka półfalowa służą do precyzyjnej kontroli mocy lasera. Znajdują się one w precyzyjnie kalibrowanych uchwytach obrotowych. Należy zachować ostrożność przy ustawianiu pochłaniacza wiązki. Lustro narożne kieruje wiązkę lasera do dolnego lustra peryskopu. Górne lustro peryskopu kieruje wiązkę do lustra szynowego. Szyna jest zamontowana na dwóch platformach wspartych na prowadnicach. Podwójne soczewki galileuszowe są przymocowane do przesuwnych uchwytów szynowych. Zwróć uwagę na dodany moduł pośredni dedykowany laserowi ablacyjnemu. System można by bardziej skompaktować, usuwając izolator optyczny oraz lustro narożne i przenosząc laser, polaryzator Glana-Thompsona oraz płytkę półfalową na tylną krawędź płyty optycznej.

Rysunek 2 Podwójne soczewki kondycjonujące Galilego są wykorzystywane do rozszerzenia wiązki lasera TEMoo o średnicy 30 µm do jednorodnej wielkości 10 mm przy zerowej zbieżności. Pod jedną z platform utrzymujących szynę umieszczono podnośnik laboratoryjny. Ułatwia to regulację wysokości szyny podczas etapówy wyrównywania. Wstępnie ustaw wysokość szyny, montując soczewkę L1 do szyny i wykorzystując wiązkę kondensatora jako prowadnicę wyrównawczą. Dostosuj położenie szyny tak, aby wiązka kondensatora była skierowana do środka soczewki w oba końce szyny. Zapewni to wyrównanie szyny równolegle do osi optycznej mikroskopu. Może być konieczne uprzednie dostrojenie mikroskopu tak, aby odpowiadał on osi optycznej szyny. Użyj zacisków, aby utrwalić pozycję mikroskopu (patrz rys. 1). Zdejmij soczewkę zamontowaną na szynie. Następnie skieruj wiązkę lasera do środka wiązki kondensora w oba końce szyny. Umieszczenie kartki papieru na drodze wiązki jest wygodnym sposobem na jednoczesne zwizualizowanie obu wiązek. Należy użyć górnego lustra peryskopu, aby dopasować wiązkę lasera do wiązki kondensora w pobliżu lustra zamontowanego na szynie. Następnie należy użyć lustra zamontowanego na szynie, aby dopasować wiązkę lasera do wiązki kondensora na przeciwległym końcu szyny (najbliżej mikroskopu). Teraz należy zamontować wszystkie cztery soczewki na szynie, zgodnie z rysunkiem. Długość szyny, ogniskowa soczewek oraz ich rozmieszczenie będą zależeć od posiadanego mikroskopu i konfiguracji fizycznej. Krytycznymi parametrami są średnica wiązki lasera oraz rozmiar tylnej apertury wybranego obiektywu. Systemy optyczne nieskończone skupią idealnie równoległą wiązkę laserową (zerowa konwergencja). Odległość między L1 a L2 powinna być sumą ogniskowych soczewek, f1+f2, a odległość między L3 a L4 powinna odpowiednio wynosić f1'+f2'. Odległość między podwójnymi parami galileuszowymi nie jest krytyczna. Położenie L3 można precyzyjnie regulować w celu kontroli konwergencji wiązki;

Rysunek 3 Ustawienie wiązki laserowej poprzez podwójne soczewki galileuszowe. Zdejmij zaciski mikroskopu z jednej strony, aby umożliwić wysunięcie mikroskopu z drogi wiązki, przy czym pozostałe zaciski pozwolą na jego precyzyjne ponowne ustawienie. Pamiętaj o bezpieczeństwie przy pracy z laseremUpewnij się, że moc lasera została ustawiona na minimum za pomocą polaryzatora Glana-Thompsona. Włącz laser i zaobserwuj kształt wiązki na ścianie. Pomocne w wizualizacji plamki lasera może być przyklejony do ściany arkusz papieru. Systematycznie reguluj położenie soczewek, aby zapoznać się z ich wpływem na rozmiar i wygląd wiązki. Powinieneś zobaczyć obraz podobny do panelu A, w którym intensywna plamka znajduje się ekscentrycznie w obrębie słabiej oświetlonego profilu. Użyj lustra zamontowanego na szynie, aby przesunąć intensywną plamkę do centrum, jak pokazano na panelu B. Następnie użyj lustra zamontowanego na górnym peryskopie, aby uzyskać jednolity profil peryferyjny. Jeśli wszystko zostało poprawnie wyrównane, przesuwanie soczewek powinno teraz powodować symetryczne rozszerzanie się i zwężanie wiązki. Przesuń soczewki z powrotem do pozycji początkowych, zgodnie z rysunkiem 2. Teraz przechwyć wiązkę w odległości odpowiadającej tylnej przysłonie obiektywu. Powinna ona być kolista, mieć rozmiar co najmniej wystarczający do wypełnienia tylnej przysłony oraz jednolity stopień jasności. Dopuszczalna jest większa średnica, pod warunkiem posiadania wystarczającej mocy lasera do przeprowadzania ablacji. Oceń konwergencję, porównując średnicę wiązki w odległości tylnej przysłony obiektywu oraz na ścianie. W przypadku wiązki o zerowej konwergencji średnica powinna być identyczna. Skala: 10 mm.

Rycina 4 Współosiowość rozszerzonej wiązki lasera z wiązką kondensatora. Zakryj laser i przesuń mikroskop z powrotem na drogę wiązki lasera, wykorzystując zaciski jako ograniczniki do wyrównania. Włącz, wyrównaj i skup wiązkę kondensatora przy użyciu obiektywu. Zaklej okulary papierem, aby zapobiec wglądowi w intensywne odbite światło laserowe.Obróć rewolwer z obiektywami do pozycji otwartej. Połóż arkusz papieru na stole przedmiotowym, aby przesłonić wiązkę kondensora. Przełącz laser w tryb ciągły i usuń mechaniczną migawkę zabezpieczającą. Powinno być widać światło lasera przechodzące przez mikroskop. Poluzuj zaciski mikroskopu i delikatnie przesuń urządzenie, aby zgrać wiązkę lasera z wiązką kondensora. Wiązka lasera powinna być okrągła i o jednorodnej jasności. Przydatne może być dostrojenie soczewek zamontowanych na szynie. Jeśli kolimacja jest prawidłowa, wiązka lasera powinna równomiernie rozszerzać się i zwężać. Za pomocą lustra zamontowanego na szynie można wycentrować zwężoną wiązkę lasera względem minimalnej, wycentrowanej wiązki kondensora, a następnie rozszerzyć ją do pożądanego rozmiaru. Po ustawieniu pozycji zwężonej wiązki za pomocą lustra szynowego należy ponownie wyregulować górne lustro peryskopowe, aby zachować jednorodną jasność rozszerzonej wiązki. Jeśli nie uda się uzyskać okrągłej, wycentrowanej wiązki lasera, należy powtórzyć wcześniejsze etapy kolimacji.

Rysunek 5 Wycentruj punkt ablacji i dostosuj zbieżność wiązki laserowej, aby uzyskać optymalną ostrość. Wyłącz laser i zamknij migawkę. Usuń papier i zamocuj lustrzaną laminkę obiektową (jako cel można również wykorzystać tusz z permanentnego markera na szkiełku nakrywkowym)²). Wykonaj obrazowanie zarysowań na powierzchni zwierciadlanej przy użyciu obiektywu olejowego 60X 1,4 NA). Następnie obrazuj powierzchnię za pomocą mikroskopu konfokalnego lub kamery CCD. Nie należy patrzeć przez okulary podczas włączonego lasera.Włącz laser i otwórz migawkę. Ustaw laser w trybie wyzwalania (trigger mode), na najniższą moc oraz częstotliwość 10 Hz. Wyzwól około 10 impulsów. Powinna pojawić się plamka ablacyjna o średnicy 1–5 $\mu$m w odległości do 10 $\mu$m od środka pola widzenia. W przypadku braku plamki ablacyjnej można zwiększać moc lasera w krokach 5–10%. Po zidentyfikowaniu plamki ablacyjnej wyśrodkuj ją w polu widzenia. Jeśli obraz ma rozdzielczość 512×512, ustaw krzyż celowniczy na współrzędnych 256, 256. Jeśli plamka lasera zostanie ustawiona w centrum, jej pozycja nie zmieni się podczas powiększania obrazu. Użyj lustra zamontowanego na szynie, aby przesunąć plamkę ablacyjną na centralny krzyż celowniczy. Ponownie oceń jednorodność wiązki lasera, obserwując wiązkę po zdjęciu obiektywu, zgodnie z opisem w powyższej Rysunce 4. Dostosuj jednorodność wiązki za pomocą lustra zamontowanego na górnym peryskopie. Powtórz ocenę położenia plamki ablacyjnej. Jest to proces iteracyjny, który należy powtarzać do momentu wyśrodkowania plamki ablacyjnej i uzyskania jednorodnej rozszerzonej wiązki. Przy prawidłowym ustawieniu plamka ablacyjna będzie okrągła, tak jak widoczne w punkcie „ablation spot at Focus” na rysunku. Następnie oceń ogniskowanie wiązki lasera w osi Z. Wyzwól laser, aby uzyskać plamkę ablacyjną o rozmiarze około 1 $\mu$m w centrum. Następnie przesuń preparat lateralnie o około 5 $\mu$m i ustaw ostrość 1 $\mu$m poniżej powierzchni preparatu docelowego. Wyzwól laser, korzystając z tych samych ustawień, których użyto do pierwszej plamki ablacyjnej. Powtórz czynność po ustawieniu ostrości 1 $\mu$m powyżej powierzchni preparatu docelowego. Jeśli wiązka lasera jest zogniskowana zgodnie z ostrością obrazu, powinien pojawić się wzór podobny do przedstawionego na tej rysunce. Największa plamka ablacyjna powinna odpowiadać ogniskowej obrazu, a plamki powyżej i poniżej ogniska powinny symetrycznie maleć. Dostosuj soczewkę L3, aby wyrównać płaszczyzny ogniskowania. Odsuwanie soczewki L3 od mikroskopu spowoduje zwiększenie zbieżności wiązki, a plamka ablacyjna przesunie się bliżej obiektywu. Małe

Rycina 6 Montaż nicieni do laserowej aksonotomii i obrazowania poklatkowego. Roztwór 10% agarozy w soli fizjologicznej jest podgrzewany aż do całkowitego stopienia. Małą kroplę nanosi się na szklany szkiełko przedmiotowe, a następnie spłaszcza drugim szkiełkiem w celu utworzenia płaskiego padu. Grubość padu reguluje się za pomocą taśmy na dwóch sąsiednich szkiełkach. Pozostawia się pad do stężenia przez około 1 minutę, po czym rozdziela się szkiełka. Do wycięcia padu o jednolitej wielkości około 13 mm wykorzystuje się kapturek markera „Sharpie”. Na środek padu nanosi się 1 µl 10 mM muskymolu oraz 1 µl mikrosfer (komunikacja osobista z Fang-Yen). Nicienie dodaje się do tej 2-mikrolitrowej kropli i orientuje przed nałożeniem szkiełka zakrywowego. Następnie za pomocą strzykawki (igła 20–25 G) nanosi się wazelinę na krawędź szkiełka zakrywowego, aby je uszczelnić.

Rysunek 7 Typowe wyniki aksonotomii laserowej u C. elegansNa obrazie A widoczny jest nienaruszony akson krótko przed i po laserowej aksonotomii. Przerwa wynosi zazwyczaj około 0,5–1 µm. Obraz B przedstawia laserową aksonotomię jednego aksonu bez uszkodzenia sąsiedniego aksonu znajdującego się w odległości około 1 µm. Laser ustawiono na moc około 10% (średnio 0,3 mW przy 250 Hz), 10 impulsów. Pasek skali wynosi 5 µm.

Rycina 8Typowa regeneracja neuronu L4 typu dzikiego. Jest to seria czasowa przedstawiająca ablację oraz zapis time-lapse regeneracji aksonu. Krótko po laserowej aksonotomii (0 min) widoczny jest stożek retrakcyjny. Do 138 minuty stożek retrakcyjny cofnął się całkowicie i rozpoczął proces przebudowy. Wzdłuż trzonu aksonu widoczne są sporadyczne wypustki błonowe (mikroszypy lub filopodia) (strzałki 138 i 324). W 360 minucie prawy kikut wykształcił dobrze uformowany, zwarty stożek wzrostu. W 414 minucie oba kitkuty posiadają wysunięte stożki wzrostu. Początkowe stożki wzrostu o charakterze embrionalnym stają się dystroficzne w miarę wzrostu w kierunku grzbietowego sznura nerwowego (414, 519 i 597 min). Dystroficzne stożki wzrostu zatrzymują się przed grzbietowym sznurem nerwowym (960 min). Groty strzałek wskazują kikut proksymalny i stożki wzrostu. Strzałki wskazują wypustki błonowe wzdłuż proksymalnego trzonu aksonu. Pasek skali 20 µm.

Film 1. Film przedstawiający regenerację aksonów typu dzikiego. Materiał wideo odpowiada punktom czasowym przedstawionym na Rysunku 8. Nicie zostały zamocowane zgodnie z opisem w protokole, a obrazy aksonów rejestrowano co trzy minuty przez około 10 godzin. W każdym punkcie czasowym wykonano stosy Z (20 x 1 μm), które następnie scalono w pojedyncze obrazy za pomocą algorytmu maksymalnej projekcji (NIS Elements). Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Istnieje wiele wartościowych opracowań dotyczących mikrochirurgii laserowej z wykorzystaniem różnych systemów laserowych^3,5-11. Lasery femtosekundowe IR są uznawane za „złoty standard” w subkomórkowej ablacji laserowej¹² i są wygodne, jeśli są zintegrowane z systemem obrazowania, lecz często okazują się zbyt kosztowne dla pojedynczych użytkowników. Jeśli do obrazowania próbki ze względu na głębokość penetracji wymagany jest laser femtosekundowy IR, prawdopodobnie będzie on niezbędny również do aksonotomii laserowej. W przypadku tkanek przezroczystych, w których aksony docelowe znajdują się w odległości 30-50 µm od powierzchni, możliwe jest zastosowanie niebieskich i zielonych laserów impulsowych o energii rzędu 20 µJ/impuls, kierowanych przez soczewkę imersyjną o wysokiej aperturze numerycznej (na). Uszkodzenia poboczne będą większe w przypadku laserów nanosekundowych i pikosekundowych w porównaniu z laserem femtosekundowym, szczególnie wraz ze wzrostem głębokości położenia aksonu docelowego. C. elegans jest przezroczysty, a wszystkie aksony znajdują się w odległości 20-30 µm od powierzchni. Rutynowo przecinamy aksony ruchowe położone w odległości do 5 µm od powierzchni. Z łatwością przecinaliśmy również aksony w obrębie pierścienia nerwowego, znajdujące się około 20 µm od powierzchni kutykuli. Ustaliliśmy, że granicą możliwości przecinania aksonów jest głębokość około 30-50 µm w obrębie średnicy dorosłego nicienia. Prawdopodobne jest, że opisany tutaj system ablacji laserowej będzie działał skutecznie w wielu różnych preparatach spełniających kryteria przezroczystości i głębokości położenia aksonów docelowych. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę teoretyczne zalety laserów femtosekundowych IR, jest nieco zaskakujące, że nanosekundowe i pikosekundowe lasery o długości fali 355 nm i 532 nm sprawdzają się tak dobrze w aksonotomii laserowej u C. elegans^6,13. Nie obserwujemy różnic w regeneracji aksonów w odpowiedzi na aksonotomię wykonaną za pomocą nanosekundowych laserów 440 nm, nanosekundowych laserów 532 nm oraz laserów femtosekundowych IR.

Stałe UV lasery 355 nm kosztują mniej więcej tyle samo, co pompowane diodowo pasywnie przełączane w Q stałe lasery 532 nm, ale wymagają albo wyższych mocy, albo optyki, która efektywnie przepuszcza te krótsze długości fal. Większość elementów optycznych jest zaprojektowana tak, aby działać sprawnie z widzialnym światłem w zakresie 400-700 nm. Lasery 355 nm oferowałyby pewne zalety⁶, takie jak obniżony próg plazmy, mniejszy rozmiar plamki, a dichroik długoprzepustowy efektywnie kierowałby 100% lasera ablacyjnego na cel i pozwalał na jednoczesne obrazowanie GFP bez utraty sygnału z próbki. Niebieskie lasery 440 nm zachowałyby zalety pracy z laserem światła widzialnego (dobra wydajność ze standardową optyką i bezpieczeństwo). Niestety, koszt pompowanego diodowo przełączanego w Q stałego lasera 440 nm jest obecnie 3 razy wyższy niż koszt lasera 355 nm lub 532 nm o podobnej mocy. Projektując nowy system dla C. elegans, gdzie głębokość celu jest minimalna, wybralibyśmy soczewkę przezroczystą dla UV (koszt ok. 3 000 $ za soczewkę olejową 40X 1.3na z transmitancją 50-70% przy 355 nm) oraz laser 355 nm generujący 5-10 uJ/impuls przy 1-20 kHz.

Uważa się, że ablacja aksonów wynika z powstawania plazmy. Krótsze impulsy generują progi plazmowe przy niższej mocy, a objętości plazmy są mniejsze⁶. Celem jest wytworzenie jak najmniejszej i najkrótszej plazmy poprzez dostosowanie energii impulsu do najniższej mocy. Większe, długotrwałe plazmy generują pęcherzyki kawitacyjne, które uszkadzają sąsiednie komórki. Zazwyczaj stwierdzono, że ablacja z użyciem około 50-100 impulsów przy najwyższej częstotliwości (tj. 2,5kHz) daje najlepsze wyniki. Sugeruje to, że uszkodzenia mogą być stopniowo kumulowane w serii impulsów, co pozwala na lepszą kontrolę zakresu uszkodzeń. Opisany tutaj system ablacji laserowej jest bardzo tolerancyjny, pod warunkiem że wiązka jest precyzyjnie ustawiona i rozszerzona. Przecinanie aksonów u dorosłych nicieni rozpoczynamy przy 10% mocy lasera (średnio 0,3 mW mierzone przy 2500 Hz i szacowane 1 uJ/pulse) i możemy przecinać z ograniczonymi uszkodzeniami miejscowymi aż do 14% mocy. Przy mocy lasera od 15-39% można zaobserwować większe obszary uszkodzeń, jednak dopiero powyżej 40% mocy (średnio około 1 mW mierzone przy 2500 Hz) nicienie ulegają rozerwaniu z powodu dużych pęcherzyków kawitacyjnych i uszkodzenia kutykuli nicienia.

Artykuł Steinmeyer i wsp. 2010² stanowi doskonałe źródło informacji na temat budowy systemu ablacji laserowej. Leon Avery opracował również przejrzysty opis praktyczny systemu ablacji laserowego opartego na niedrogim laserze azotowym (N2) o długości fali 337 nm, w którym zamieścił cenne wskazówki praktyczne (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Projektując własny system, należy w pierwszej kolejności skonsultować się z przedstawicielem producenta mikroskopu, aby ustalić sposób skierowania wiązki lasera ablacyjnego do obiektywu mikroskopu. Mikroskop powinien być zamontowany na stole wibroizolacyjnym (Newport, TMI, Thor). Optymalnym rozwiązaniem jest blat typu breadboard, jednak można zastosować również pełny blat stalowy z pozycjonerami magnetycznymi. Dedykowany moduł pośredni w mikroskopie pionowym jest korzystny, ponieważ wszystkie elementy optyczne mogą pozostać na swoim miejscu. Jednak tańszym i wygodniejszym rozwiązaniem może być wykorzystanie portu kamery (w mikroskopie odwróconym) lub „kombinatora” podłączonego do portu epi-fluorescencyjnego. Należy znać rozmiar tylnej apertury oraz transmitancję (dla długości fali lasera ablacyjnego) obiektywu, którego zamierza się użyć. Po wyborze lasera (np. Crylas, TEEM, Crystal lub CRC) należy skontaktować się z firmą Thor lub Newport w celu uzyskania pomocy w doborze odpowiednich elementów optycznych, osprzętu i sprzętu bezpieczeństwa. W naszym przypadku zdecydowaliśmy się na podwójny rozszerzacz wiązki Galileusza w celu oszczędności miejsca, ale opcją jest również prostszy rozszerzacz Keplera (f2/f1=czynnik powiększenia). Najmniej kosztowny będzie rozszerzacz wiązki wykonany na zamówienie, jednak firmy Newport, Thor oraz kilku producentów laserów oferują wysokiej jakości komercyjne rozszerzacze wiązki. Niektórzy producenci laserów oferują również tłumiki manualne i sterowane elektronicznie, które mogą być ekonomiczne i oszczędzać miejsce, choć nie są tak wszechstronne jak polaryzator Glana-Thompsona i płytka półfalowa. Należy również zdecydować o sposobie sterowania laserem. Można zaprojektować sterownik oparty na LabView, użyć komercyjnego generatora TTL lub oprogramowania dostarczonego przez producenta lasera. Opcje te należy omówić z konkretnym producentem lasera.

Przedstawiona lista wykorzystanego sprzętu służy jedynie jako ogólna wskazówka. Opisany tutaj system kosztował około 15 000 USD przy rozbudowie naszego istniejącego systemu obrazowania. W lokalnych wydziałach fizyki zazwyczaj można znaleźć osobę, która chętnie wprowadzi w praktykę bezpiecznej pracy z laserami z otwartą wiązką.

W literaturze opisano niedawno alternatywne metody unieruchamiania i obrazowania poklatkowego C. elegans.¹⁴

Rozwiązywanie problemów

Najtrudniejszym i najbardziej krytycznym etapem jest dopasowanie wycentrowanej wiązki rozszerzonej do osi optycznej mikroskopu. Po wycentrowaniu i rozszerzeniu wiązki za pomocą soczewek Galileusza należy dołożyć wszelkich starań, aby dopasować ją z dokładnością do 5 um względem osi optycznej mikroskopu PRZED użyciem luster sterujących do końcowej regulacji centrowania. Nadmierne korzystanie z luster sterujących w celu dopasowania wiązki do mikroskopu spowoduje przesunięcie jej poza oś rozszerzacza wiązki. ZACHOWUJĄC NAJWYŻSZA OSTROŻNOŚĆ można osłabić wiązkę laserową za pomocą odpowiedniego filtra ND i bezpośrednio obserwować profil wiązki laserowej na celu refleksyjnym (lustrze o powierzchni przedniej). Można delikatnie przesuwać mikroskop, aby precyzyjnie wycentrować wiązkę w polu widzenia obiektywu 60X (jeśli nie można jej wycentrować w zakresie góra/dół, należy dostosować wysokość szyny). Profil wiązki można wykorzystać do precyzyjnego dopasowania osi optycznej mikroskopu, aby uzyskać wycentrowaną wiązkę, która jest okrągła i symetrycznie „rozszerza się” (flaring). Asymetryczne rozszerzenie wskazuje, że oś mikroskopu nie jest idealnie dopasowana (lub szyna nie jest wypoziomowana). Na koniec należy wyregulować L3 i zaobserwować równomierne i symetryczne rozszerzanie oraz zwężanie wiązki. Należy precyzyjnie ustawić ostrość mikroskopu na powierzchni celu, a następnie wyregulować L3 tak, aby skupić wiązkę laserową w jak najmniejszym punkcie. Powinno to skutkować tym, że wiązka laserowa znajduje się w odległości do 5 um od centrum podczas obrazowania za pomocą systemu LSCM lub CCD, a punkt ablacji znajduje się w odległości do 1um od ogniska Z.

Jeśli zauważysz, że dochodzi do „rozrywania” nicieni lub systematycznie powstają duże pęcherzyki kawitacyjne podczas przecinania aksonów, problem najprawdopodobniej wynika z precyzyjnego ustawienia lasera ablacyjnego. Upewnij się, że punkt ablacji o minimalnej średnicy (<500nm) jest zlokalizowany w ognisku Z (reguluj konwergencję za pomocą soczewki L3) oraz w punkcie referencyjnym XY (reguluj za pomocą ostatniego lustra zamontowanego kinematycznie).

Celowanie w aksony znajdujące się bliżej powierzchni będzie wymagało mniejszej mocy lasera. Podobnie, w przypadku mniejszych zwierząt (L1 i L2) aksonotomia będzie wymagać mniejszej mocy lasera w porównaniu do celowania w te same aksony u osobników dorosłych.

Jeśli aksony typu dzikiego nie regenerują się lub ulegają blaknięciu, należy spróbować zmniejszyć moc lasera obrazującego lub obniżyć częstotliwość próbkowania. Jeśli nicienie giną lub stają się chore, należy spróbować zmniejszyć procentową zawartość agarozy w krokach 1%. Należy upewnić się, że szkiełko nakrywki nie jest przesuwane po zamocowaniu nicieni, ponieważ w przypadku stosowania agarozy o wysokim stężeniu i mikrosfer często prowadzi to do ich śmierci.

Jeśli nicienie pękają lub giną podczas sesji time-lapse, przyczyną jest: 1. Zbyt wysokie stężenie agarozy. 2. Uszkodzenie kutykuli przez laser ablacyjny. 3. Przesunięcie szkiełka nakrywkowe po montażu. Jeśli przyczyną jest uszkodzenie kutykuli, dotyczyć będzie ono wyłącznie zamontowanych nicieni, które były poddawane działaniu lasera ablacyjnego.

Jeśli robak zbyt mocno porusza się podczas sesji time-lapse, należy spróbować zwiększyć stężenie agarozy w krokach 0,5%. Zdrowe aksony u zdrowych osobników są zawsze „aktywne” i wykazują stały poziom fluorescencji. Jeśli zauważysz nagły spadek fluorescencji lub aktywności, oznacza to, że robak obumiera lub jest martwy. Liczne paciorkowate lub pofragmentowane aksony są pewnym znakiem obumierającego lub martwego osobnika.

Jeśli mają Państwo problem z utrzymaniem aksonów w ognisku przez całą sesję time-lapse, przyczyną może być kilka różnych problemów. W pierwszej kolejności należy sprawdzić dryft stolika, obrazując obojętny preparat na szkiełku przedmiotowym przez 10 hrs. Dryft rzędu kilku mikronów może wynikać z niestabilności termicznej, ale przesunięcie większe niż 5 um prawdopodobnie wynika z problemów mechanicznych mikroskopu. Częściej występują problemy z montażem. Przed rozpoczęciem sesji time-lapse należy pozwolić zamocowanym nicieniom na wyrównanie temperatury ze stolikiem mikroskopu przez 30 minut. Należy również sprawdzić, czy uszczelnienie z wazeliny nie uległo rozszczelnieniu w trakcie sesji time-lapse.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa odczynnika	Firma	Numer katalogowy	Uwagi (opcjonalnie)
Laser 535 nm	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal oraz CRC oferują również porównywalne lasery)
Wszystkie elementy optyczne i sprzęt			(Thor oferuje porównywalną optykę i sprzęt)
Uchwyt optyczny SUPREMA, średnica 1,0 cala	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
Słupek o średnicy 1", wysokości 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Achromatyczna płytka falowa zerowego rzędu, opóźnienie ½ fali, 400-700 nm	Newport Corp.	10RP52-1	1
Stoły obrotowy, otwór 1"	Newport Corp.	RSP-1T	1
Słupek o średnicy 1", wysokości 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Polaryzator kalcytowy Glan-Laser, 430-700 nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
Obrotowy uchwyt polaryzatora	Newport Corp.	RM25A	1
Dystans ¼" do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-0.25	1
Słupek o wysokości ½" i średnicy 1"	Newport Corp.	PS-0.5	1
Widelec do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Pułapka wiązki	Newport Corp.	PL15	1
Uchwyt obiektywu mikroskopowego	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
Słupek o średnicy 1", wysokości 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Widelec do słupka o średnicy 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Lustro laserowe Nd:YAG wysokiej energii, średnica 25,4 mm, 45°, 532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
Uchwyt optyczny SUPREMA, średnica 1,0 cala, z otworem montażowym	Newport Corp.	SN100C-F	2
Precyzyjna śruba regulacyjna z pokrętłem, zakres 12,7 mm, 100 TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K	4
Adapter gwintowy, ¼-20 zewnętrzny, 8-32 wewnętrzny	Newport Corp.	SS-1-B	2
Zacisk prętowy do pręta o średnicy 1,5 cala	Newport Corp.	340-RC	2
Pręt, wysokość 14 cali (35,5 cm)	Newport Corp.	40	1
Wózek szynowy dla X26, kwadratowy, długość 40 mm	Newport Corp.	CN26-40	4
Szyna stalowa, długość 384 mm (15")	Newport Corp.	X26-384	1
Platforma prętowa dla pręta o średnicy 1,5 cala	Newport Corp.	300-P	2
Pręt, wysokość 14 cali (35,5 cm)	Newport Corp.	40	2
Soczewka plano-wklęsła, średnica 12,7 mm, EFL -25 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
Soczewka plano-wypukła, średnica 25,4 mm, EFL 50,2 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
Soczewka plano-wypukła, średnica 25,4 mm, EFL 62,9 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
Stały uchwyt soczewki, średnica 0,5", wysokość osi 1,0"	Newport Corp.	LH-0.5	2
Stały uchwyt soczewki, średnica 1,0", wysokość osi 1,0"	Newport Corp.	LH-1	2
Mikrosfery 0,1 µm	Polysciences, Inc.	00876
Agaroza	Research Products International Corp.	A20090	EEO matters
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523