Artykuł metodologiczny

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

46.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3349

⸱

17 stycznia 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University , 3School of Medicine, University of Pennsylvania , 4Department of Medicine, Division of Cardiology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Streszczenie

Ogólnym celem tej metody jest opisanie techniki poddawania przylegających komórek warunkom przepływu laminarnego oraz ocena ich reakcji na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu1.

Konstrukcja naszej komory przepływowej oraz układ przepływowy (Ryc. 1) zawierają przezroczysty obszar obserwacyjny, który umożliwia badanie adhezji komórek oraz obrazowanie morfologii komórek bezpośrednio przed przepływem (Ryc. 11A, B), w różnych punktach czasowych podczas przepływu (Ryc. 11C) oraz po przepływie (Ryc. 11D). Eksperymenty te zostały zilustrowane z wykorzystaniem ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz świńskich EPCs2,3.

Niniejsza metoda ma zastosowanie również w przypadku innych typów komórek adherentnych, np. komórek mięśni gładkich (SMCs) lub fibroblastów.

Komorę oraz wszystkie elementy układu można łatwo sterylizować w autoklawie parowym. W przeciwieństwie do innych komór, np. komór mikrofluidycznych, po eksperymencie przepływowym w warunkach sterylnych można odzyskać dużą liczbę komórek (> 1 milion, w zależności od wielkości komórek) do hodowli komórkowych lub innych analiz, np. ekstrakcji DNA lub RNA, immunohistochemii (Ryc. 11E) lub skaningowej mikroskopii elektronowej5. Naprężenie ścinające można regulować poprzez zmianę szybkości przepływu perfuzatu, lepkości cieczy lub wysokości i szerokości kanału. To ostatnie pozwala zmniejszyć objętość cieczy lub zapotrzebowanie na komórki, zapewniając jednocześnie utrzymanie przepływu jednowymiarowego. Pomiary wysokości komory między eksperymentami nie są konieczne, ponieważ wysokość komory nie zależy od zastosowania uszczelek, co znacznie ułatwia przeprowadzanie wielokrotnych doświadczeń. Ponadto konstrukcja układu umożliwia łatwe pobieranie próbek perfuzatu do analizy i/lub kwantyfikacji metabolitów wydzielanych przez komórki pod wpływem naprężenia ścinającego, np. tlenku azotu (Ryc. 12)6.

Protokół

1. Izolacja endotelialnych komórek progenitorowych

  1. Przed jakimikolwiek pobraniami obwodowej krwi ludzkiej należy przedłożyć protokół badawczy do Komisji Bioetycznej (IRB), a po jego zatwierdzeniu uzyskać świadomą zgodę ochotników-dawców (pobieranie krwi obwodowej i izolacja EPC została zatwierdzona przez IRB Uniwersytetu Duke i jest w pełni zgodna z wymogami regulacyjnymi USA dotyczącymi ochrony uczestników badań z ludźmi).
  2. W przypadku pracy z komórkami EPC pochodzenia zwierzęcego, należy uzyskać zatwierdzenie protokołu badawczego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Wszystkie nasze eksperymenty na świniach zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Duke i przeprowadzono je zgodnie z najwyższymi standardami humanitarnej opieki).
  3. W celu izolacji komórek progenitorowych śródbłonka należy pobrać 50 ml krwi obwodowej od wyrażającego zgodę ochotnika-dawcy za pomocą standardowej techniki flebotomii do worków do pobierania krwi wypełnionych antykoagulantem cytrynianem fosforanu dekstrozy, rozcieńczyć roztwór w stosunku 1:1 z buforem Hanksa (bez CaCl2, MgCl2, MgSO4) i nałożyć na równe objętości Histopaque, aby utworzyć wyraźnie zdefiniowane warstwy.
  4. Wirować (30 min, 740 g, niskie hamowanie) i zebrać warstwę komórek mononuklearnych (MNC) (tzw. buffy coat). Resuspendować i przemyć MNC 3 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez 10 min, 515 g, przed wysianiem na dwie płytki 12-dołkowe w pełnej pożywce wzrostowej EPC (pożywka MCDB-131 z 5 ml 200 mM L-glutaminy, 10% FBS oraz EGM-2 SingleQuots) w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
  5. Powoli wymieniać pożywkę co 24 godziny przez pierwsze 7 dni, a następnie co drugi dzień. Kolonie EPC można zidentyfikować po średnio 14 dniach na podstawie ich morfologii przypominającej brukowany chodnik. Gdy komórki EPC w kulturze pokryją ¼ powierzchni dołków płytki 12-dołkowej, należy przeprowadzić ekspansję komórek i potwierdzić tożsamość EPC za pomocą cytometrii przepływowej, badając obecność markerów powierzchniowych CD31 oraz brak CD14 i CD45, zgodnie z wcześniejszym opisem 6. Inne testy, które można przeprowadzić, obejmują analizę morfologii komórek oraz znakowanie DiI-Ac-LDL.
  6. W eksperymentach opisanych w niniejszym dokumencie, wyizolowane komórki EPC należy namnażać do momentu, aż staną się prawie konfluentne w 3 kolbach do hodowli komórkowej T-75 w pożywce EPC w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, 5% CO2.

2. Obliczanie naprężenia ścinającego

  1. Zalecamy przeprowadzenie tych obliczeń przed wykonaniem komory i kanału, aby dokładnie zrozumieć warunki, jakie można osiągnąć. Oblicz natężenie przepływu perfuzatu w obwodzie na podstawie pożądanych naprężeń ścinających, które mają zostać przyłożone do komórek, zgodnie z równaniem 1 1,

Wzór na natężenie przepływu \(Q=\frac{\tau wh^2}{6\mu}\), przedstawiający zasadę hydrodynamiki; równanie.

gdzie Q to pożądany przepływ, τ to docelowe naprężenie ścinające działające stycznie na komórki, w to szerokość komory przepływowej, h to wysokość komory przepływowej, a μ to lepkość perfuzatu (medium przepływowego).

  1. Typowa wartość lepkości (μ) stosowanego medium wynosi 0.9 cP (0.009 g cm-1 s-1). Należy zauważyć, że lepkość można również zwiększyć, stosując dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej, jeśli jest to pożądane 7. Typowa wartość docelowego naprężenia ścinającego (τ) wynosi 15 dynes/ cm2 (typowy naprężenie ścinające w tętnicach) lub 100 dynes/cm2, jeżeli pożądane jest nadsfizjologiczne naprężenie ścinające. Nasza komora ma zazwyczaj szerokość (w) 1.9 cm i wysokość (h) w zakresie 166 - 267 μm.

3. Wytwarzanie komory przepływowej

  1. Wytnij górną i dolną płytę komory z prostokątnego materiału ze stopu aluminium 6061 o wymiarach górnych 7 x 2 x 0.5" i wymiarach dolnych 7 x 2 x 0.25".
  2. Wyfrezuj w centralnej części górnej płyty wgłębienie o głębokości 0.125", pozostawiając 0.950" na każdym końcu, tworząc zbiornik na ciecz o szerokości 1.375" x głębokości 0.3125".
  3. Wywierć od spodu szczeliny o szerokości 1/16" x długości 0.625", aby przebić się do zbiornika na końcach dopływu i odpływu.
  4. Na końcach każdej górnej płyty wywierć centralnie umieszczony otwór 10/32" T.P.I. dla polipropylenowego króćca węża 1/8", aby przebił on zbiornik na ciecz. Na końcu dopływu wykonaj boczny korek z otworem przelotowym 10/32" T.P.I. dla polipropylenowego króćca węża 1/8".
  5. Zeszlifuj dolną stronę górnej płyty pod kątem 0.518 stopnia od dopływu cieczy do szklanego okna obserwacyjnego, aby zapewnić odpowiednie mieszanie cieczy.
  6. Wytnij w dolnej płycie otwór na szklane okno w linii z górnym oknem obserwacyjnym. Używając cementu akwariowego, wklej szkiełko przedmiotowe do komory. Pozostaw do utwardzenia na co najmniej 24 godziny. Upewnij się, że okno obserwacyjne jest cofnięte w taki sposób, aby szkiełko mikroskopowe 75 x 25 x 1 mm ściśle przylegało w komorze.
  7. Wykonaj gniazdo dla o-ringu wokół dolnej strony górnej i dolnej płyty w taki sposób, aby były one oddalone od siebie o 0.02". Włóż gumowe o-ringi.
  8. Wywierć 10 pasujących otworów 8/32" T.P.I. w górnej i dolnej komorze do użytku ze śrubami z płaskim łbem 8/32".

4. Montaż obwodu przepływowego

  1. Najpierw zmontuj cały obwód przepływowy, a następnie przystąp do jego sterylizacji.
  2. Przymocuj 36-calowy odcinek sztywnej rurki do jednego końca tłumika pulsacji (za pomocą złącza 1/8"). Do drugiego końca przymocuj 18-calowy odcinek miękkiej rurki.
  3. Umieść męski adapter luer 1/8" na końcu 18-calowego odcinka miękkiej rurki wspomnianego w kroku 4.2. Połącz męski luer z żeńskim adapterem luer 1/8". Przymocuj żeński luer do nowego 18-calowego odcinka miękkiej rurki.
  4. Wywierć trzy otwory w zakrętce zlewki szklanej o pojemności 250 ml, aby dopasować rurki. Włóż 1,5-calowy odcinek miękkiej rurki (jako odpowietrznik) do jednego otworu, a wolne końce rurki sztywnej i miękkiej przez pozostałe dwa otwory w zakrętce do szklanej butelki 250 ml (pełniącej rolę zbiornika) (Rys. 2). Upewnij się, że rurka sztywna sięga dna zbiornika (jako rurka odpływowa ze zbiornika).
  5. Zesterylizuj powyższe elementy w autoklawie parowym w temperaturze 121 °C przez 60 min. Dodatkowo zautoklawuj jedną kompletną komorę przepływową, 3 odcinki miękkiej rurki o długości 2", 1 męski i 1 żeński adapter luer 1/8", 4 śruby z płaskim łbem 8-32 o rozmiarze ½" oraz 6 śrub 8-32 o rozmiarze 5/16", jedną pęsetę, jedno szkiełko przedmiotowe 75 x 25 x 1 mm (lub inny wybrany materiał powierzchniowy dla komórek) oraz 2 ręczniki chirurgiczne.
  6. Umieść sterylne ręczniki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Na tym sterylnym polu ułóż obwód przepływowy, komorę przepływową, 4 kurki 4-drożne, 1 kurek 1-drożny oraz wszystkie wysterylizowane elementy z kroku 4.5.
  7. Używając sterylnych rękawiczek, połącz dwa kurki 4-drożne. Nałóż nasadki na otwarte porty do próbek.
  8. Odłącz męskie i żeńskie adaptery luer łączące dwa odcinki miękkiej rurki obwodu przepływowego i wstaw połączone kurki (Rys. 3).
  9. Przymocuj miękką rurkę włożoną do zbiornika do strzykawki 30 ml i wyjmij tłok strzykawki. Napełnij butelkę 125 ml pożywki EPC (Rys. 4).
  10. Włóż sterylny filtr strzykawkowy do odpowietrznika (Rys. 4).
  11. Przenieś obwód przepływowy do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  12. Zamocuj sztywną rurkę w głowicy pompy perystaltycznej przeznaczonej do tego typu rurek (Rys. 5). Upewnij się, że rurka nie nachodzi na prowadnice montażowe pompy. Zaznacz rurkę markerem w miejscach, w których opuszcza ona głowicę pompy po obu stronach.
  13. Upewnij się, że wszystkie kurki są zamknięte w stronę portów do próbek i otwarte wzdłuż obwodu przepływowego. Uruchom pompę. Zweryfikuj kierunek przepływu. Perfuzyt powinien przemieszczać się ze szklanego zbiornika przez sztywną rurkę do tłumika pulsacji.

5. Fluorescencyjne znakowanie EPC

  1. Podczas nagrzewania obwodu przepływowego do 37 °C, przygotuj komórki do wysiewu na szkiełko. Należy pamiętać, że znakowanie fluorescencyjne jest wymagane w przypadku wizualizacji komórek na materiałach nieprzezroczystych, np. tytanie (Ti).
  2. Przygotuj 1 mM roztwór zapasowy Cell Tracker Orange (CTO), rozpuszczając 50 μg proszku CTO w 90 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Należy chronić tę mieszaninę przed ekspozycją na światło (wyłączyć światło podczas pracy pod dygestorium).
  3. Przygotuj 2 μM roztwór roboczy CTO, rozcieńczając 36 μl roztworu zapasowego CTO w 18 ml bezsurowiczego medium MCDB-131.
  4. Przepłucz EPC w 3 kolbach hodowlanych T-75 z niemal konfluentnymi komórkami za pomocą 10 ml DPBS (bez Ca lub Mg).
  5. Do każdej kolby dodaj 6 ml 2 μM roztworu roboczego CTO. Inkubuj przez 15 min w 37 °C. Każdą kolbę przepłucz 2 razy 10 ml DPBS (bez Ca lub Mg).
  6. Do każdej kolby dodaj 4 ml trypsyny. Inkubuj w 37 °C przez 3 min. Zneutralizuj za pomocą 8 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
  7. Przemyj poprzez wirowanie przez 5 min przy 600g i resuspenduj w 5 ml medium do EPC.

6. Wysiew komórek na szkiełko przed montażem komory przepływowej

  1. Można zastosować szkiełko wykonane ze szkła, tytanu lub innego materiału, a jego powierzchnię można zmodyfikować poprzez nanoszenie polimeru metodą spin coatingu lub dodanie warstwy metalu. Umieść szkiełko w sterylnym prostokątnym naczyniu do hodowli komórkowej z czterema komorami (lub użyj flaszki ze szkiełkami do hodowli tkanek, jeśli pożądana jest powierzchnia polistyrenowa). Policz komórki i wysiej 1,5 x 106 komórek na szkiełko w 5 ml pożywki EPC na 6 hr, jeśli w momencie rozpoczęcia przepływu wymagana jest konfluenta warstwa komórek (Rys. 11A).
  2. Aby przetestować rozprzestrzenianie się i adhezję komórek pod wpływem naprężenia ścinającego płynu, pozwól 3 x 106 komórkom przytwierdzić się jedynie przez 15 min przed rozpoczęciem przepływu (szybki wysiew) (Rys. 11B).

7. Montaż komory przepływowej

  1. Używając sterylnych rękawiczek, połącz 2-calowy odcinek miękkiego przewodu z żeńskim adapterem luer 1/8". Połącz kolejny 2-calowy odcinek miękkiego przewodu z męskim adapterem luer 1/8".
  2. Przymocuj 2-calowy miękki przewód z żeńskim adapterem luer do portu wlotowego. Przymocuj 2-calowy miękki przewód z męskim adapterem luer do portu wylotowego. Do obu tych adapterów luer przymocuj 4-drożne kurki. Pozostały 2-calowy odcinek miękkiego przewodu połącz z łącznikiem portu bocznego wychodzącym z pułapki pęcherzykowej i przymocuj 1-drożny kurek (Rys. 6).
  3. Używając sterylnej pęsety, wyjmij preparat z zasianymi komórkami z naczynia do hodowli komórek (lub w przypadku użycia kolby z nasuwką, wyjmij kolbę z nasuwką) i umieść go w zagłębieniu na płycie dolnej komory przepływowej. Upewnij się, że preparat jest ułożony stroną z zasianymi komórkami do góry.
  4. Napewnij 10 ml ciepłego medium EPC na preparat. Pozwól, aby medium pokryło preparat i komorę przepływową, ale nie dopuść do przelania medium nad pierścieniem O-ring na płycie dolnej.
  5. Umieść płytę górną komory przepływowej na płycie dolnej, dopasowując otwory na śruby. Należy uważać, aby podczas tego kroku nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory, utrzymując obie płyty równolegle.
  6. Skręć płyty ze sobą (automatyczny śrubokręt z zasilaniem bateryjnym przyspiesza ten proces).
  7. Usuń pęcherzyki powietrza z wlotowej pułapki pęcherzykowej, otwierając 1-drożny kurek przymocowany do portu pułapki pęcherzykowej od strony wlotowej, a następnie delikatnie przepłucz przewód wlotowy medium EPC za pomocą strzykawki 10 ml. Następnie zamknij ten kurek i go zakapsluj (Rys. 7).
  8. Teraz usuń pęcherzyki powietrza z kanału komory, otwierając 4-drożny kurek portu wylotowego i delikatnie przepłukując komorę przepływową medium EPC, ponownie używając strzykawki 10 ml. Jeśli pozostaną duże pęcherzyki, unieś wylotowy koniec komory pod kątem 45° (Rys. 8).
  9. Zakapsluj wszystkie połączenia 4-drożnych kurków i zamknij je. Przenieś komorę przepływową wraz z zmontowanym układem przepływowym do inkubatora (Rys. 9).
  10. Zatrzymaj pompę układu przepływowego. Zamknij kurki układu przepływowego w kierunku przepływu, aby zapobiec wyciekom i zachować sterylność wnętrza komory. Przenieś komorę przepływową z dygestorium do układu przepływowego. Podłącz komorę przepływową do układu przepływowego. Otwórz kurki w kierunku przepływu. Wznów pracę pompy przepływowej. Upewnij się, że perfuzat przepływa w prawidłowym kierunku. Dostosuj szybkość przepływu do pożądanego naprężenia ścinającego.
  11. Podczas eksperymentu przepływowego komorę przepływową można odłączyć od układu w celu obrazowania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Aby to zrobić, odłącz komorę przepływową od układu przepływowego w miejscach połączeń kurek-kurek. Aby zachować sterylność komory, zamknij kurki układu przepływowego i kurki komory przepływowej w kierunku przepływu oraz zakapsluj wszystkie kurki przed wyjęciem układu przepływowego z inkubatora (Rys. 9).

8. Pobieranie próbek perfuzatu

  1. Aby ułatwić pobieranie próbek perfuzatu do analizy (np. syntezy tlenku azotu), należy najpierw zatrzymać pompę.
  2. Zamknąć kurek znajdujący się najbliżej tłumika pulsacji. Zdjąć z niego nasadkę ochronną i włożyć małą strzykawkę, np. 3 ml, do portu pobierania próbek. Zachować nasadkę i ułożyć ją do góry dnem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  3. Zamknąć kurek w kierunku komory przepływowej, pozostawiając otwarty port pobierania próbek oraz obwód w kierunku tłumika pulsacji.
  4. Pobrać z obwodu pożądaną ilość próbki, np. 150 μl. Zamknąć kurek w stronę portu pobierania próbek przed wyjęciem strzykawki. Próbkę perfuzatu przechowywać w opisanej fiolce i zamrozić w temperaturze - 80 °C (do późniejszego oznaczania tlenku azotu).
  5. Ponownie założyć nasadkę na port pobierania próbek i upewnić się, że wszystkie kurki są otwarte przed rozpoczęciem przepływu.

9. Reprezentatywne wyniki

Stosując naszą metodę szybkiego wysiewu, ludzkie komórki progenitorowe śródbłonka pochodzące z krwi mogą być wysiewane na szkiełka tytanowe przez 15 minut i przylegać przy fizjologicznych (tętniczych) siłach ścinania wynoszących 15 dynes/cm2.

Jak pokazano na Rysunku 10, komórki EPC rozprzestrzeniały się pod wpływem przepływu z 210 ± 11,4 μm2 bezpośrednio po wysianiu, do 657 ± 39,1 μm2 po 3 godzinach oraz do 1152 ± 55,3 μm2 po 24 godzinach działania naprężenia ścinającego cieczy o wartości 15 dynes/ cm2 (różnica między grupami jest istotna statystycznie przy p < 0,0001, ANOVA jednoczynnikowa). Równolegle do zwiększenia powierzchni komórek, którą można obrazować przez przezroczystą komorę za pomocą mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego, stopień okrągłości obliczony zgodnie z równaniem 2 6

Równanie okrągłości: \( \text{Roundness} = \frac{4 \pi \times \text{Area}}{\text{Perimeter}^2} \), obraz formuły.

spadły z 878 x 10-3 ± 5.9 x 10-3 bezpośrednio po wysianiu, do 671 x 10-3 ± 19.2 x 10-3 po 3 godzinach oraz do 526 x 10-3 ± 19.2 x 10-3 po 48 godzinach ekspozycji na to samo naprężenie ścinające płynu (różnica między grupami jest ponownie istotna statystycznie przy p < 0.0001, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA).

Rysunek 11D obrazuje, że komórki EPC ustawiają się i orientują w kierunku przepływu po 48 godzinach oddziaływania naprężeń ścinających cieczy o wartości 15 dynes/cm2 w porównaniu do ich przypadkowej orientacji po 6-godzinnym okresie statycznego wysiewu, przedstawionym na Rysunku 11A.

Nasza metoda pozwala również na pobieranie próbek perfuzatu w określonych punktach czasowych w celu analizy i/lub ilościowego oznaczenia wydzielanych metabolitów komórkowych. Jako reprezentatywny przykład przedstawiamy produkcję azotynów (NO2-) podczas 48-godzinnego eksperymentu z przepływem z udziałem świńskich EPC na Rysunku 12. Bezpośrednio zmierzyliśmy ten pierwotny produkt utleniania tlenku azotu (NO) jako marker zastępczy dla NO w próbkach medium pobranych z obiegu przepływowego w różnych punktach czasowych; wartości wyniosły 12,0 nmol po 6 godzinach, 13,1 nmol po 12 godzinach, 16,3 nmol po 24 godzinach i 24,6 nmol po 48 godzinach dla 1 x 106 komórek przy 15 dynes/cm2 6.

Schematy procesów chemicznych z układami reaktora okresowego i systemami filtracji.
Rycina 1. Schemat przedstawiający ogólny widok zestawu obwodu przepływowego i eksperymentu przepływowego. (A) Zestaw obwodu przepływowego bez komory przepływowej. W skład wchodzą: zbiornik, tłumik pulsacji, twarde rurki, miękkie rurki, 4-drożne kurki z podłączonymi adapterami luer oraz filtr powietrza. (B) Połączenie komory przepływowej z głowicą pompy przepływowej za pomocą segmentu twardej rurki. (C) Wprowadzenie szkiełka z zasiajanymi EPC do dolnej płyty komory przepływowej (D). Kompletny montaż obwodu przepływowego z komorą przepływową.

Schemat filtracji próżniowej, kolba, rurki, lejek; stosowane do rozdzielania fazy ciekłej i stałej w doświadczeniach laboratoryjnych.
Rysunek 2. Całkowicie zmontowany obwód przepływowy do sterylizacji.

Schemat układu do filtracji próżniowej z kolbą, rurkami i pułapką; stosowany do rozdziału fazy stałej od ciekłej.
Rycina 3. Zmontowany obwód przepływowy po sterylizacji, wraz z zaworami.

Schemat zestawu do filtracji próżniowej; proces polega na oddzielaniu ciał stałych od cieczy przy użyciu ssania.
Rycina 4. Napełnianie szklanego zbiornika 125 ml medium EPC.

Schemat pompy perystaltycznej przedstawiający układ przepływu cieczy do transferu płynów i ciągłego dozowania.
Rycina 5. Obwód przepływowy zacisnięty w głowicy pompy przepływowej przed wstawieniem komory przepływowej.

Schemat układu spektroskopowego przedstawiający komponenty i ścieżki pomiaru wzbudzenia optycznego.
Rycina 6. Zespół górnej płyty komory.

Schemat systemu chromatograficznego; metoda: separacja DNA; proces: oczyszczanie białek.
Rycina 7. Płukanie pułapki pęcherzykowej medium EPC w celu usunięcia pęcherzyków powietrza ze strony dopływowej komory.

Schemat chromatografii; konfiguracja sprzętu do procesu rozdzielania i analizy cieczy.
Rycina 8. Płukanie komory medium EPC w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z okienka szkiełka oraz z odpływu komory.

Dynamika płynów, schemat układu chromatograficznego; ilustruje przepływ cieczy i proces rozdziału.
Rycina 9. Całkowicie zmontowany obwód przepływowy z wstawioną komorą przepływową podczas eksperymentu przepływowego.

Wykres słupkowy powierzchni EPC (µm²) w funkcji godzin przepływu; analiza danych wzrostu komórek śródbłonka.
Rycina 10. Powierzchnia EPC (w μm2) zwiększa się w czasie trwania eksperymentu z przepływem.

Obrazy mikroskopowe; porównanie fluorescencji i barwienia komórek, schemat przedstawiający zróżnicowane struktury komórkowe.
Rycina 11. (A) Obraz z mikroskopu świetlnego przedstawiający EPC z HUCB wysiane na szkiełku przedmiotowym pokrytym fibronektyną przez 6 hours przed przepływem, powiększenie 100 x. (B) EPC z HUCB znakowane CTO i szybko wysiane na szkiełku z Ti przez 15 min przed przepływem, wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu 100 x. (C) To samo szkiełko z Ti z EPC z HUCB jak w punkcie (B), po 3 hours przepływu przy 100 dynes/ cm2, obrazowane przez przezroczystą komorę przy powiększeniu 100 x. Zwróć uwagę na rozprzestrzenianie się komórek, przy wciąż losowej orientacji po 3 hours przepływu. (D) To samo szkiełko z Ti, tym razem po 48 hours ekspozycji na przepływ przy powiększeniu 100 x. EPC są znakowane CTO, a jądra komórkowe zabarwione barwnikiem Hoechst (niebieski) po przepływie. Zwróć uwagę na ustawienie komórek w kierunku przepływu. (E) Porównanie EPC świńskich na Ti po 48 hours przepływu i ekspozycji na naprężenie ścinające wynoszące 15 dynes/ cm2. Granice komórek zabarwiono przeciwciałem anty-PECAM (zielony), a jądra barwnikiem kwasów nukleinowych Sytox Orange. Zwróć uwagę na ustawienie komórek w kierunku przepływu.

Wykres produkcji azotynów; pokazuje EPC przez godziny przepływu; dane dotyczące kinetyki odpowiedzi komórkowej.
Rycina 12. Wykres przedstawia produkcję NO przez świńskie EPC podczas 48 godzin przepływu. Główny produkt utleniania NO, azotyny (NO2-), mierzono jako marker zastępczy dla NO w próbkach medium pobranych w różnych punktach czasowych podczas przepływu.

Schemat projektu inżynieryjnego płyt aluminiowych z wymiarami, przedstawiający widoki przekroju poprzecznego.
Rycina 13. Komora przepływowa jest wykonana z prostokątnego kęsa stopu aluminium 6061, gdzie sekcja górna (A) ma wymiary 0.5" x 2" x 7", a sekcja dolna (B) 0.25" x 2" x 7". Dolna powierzchnia styku z o-ringiem sekcji górnej jest strugowana do grubości 0.45" w celu zapewnienia płaskości niezbędnej do uszczelnienia. Centralna część górnej części jest zaciosana do 0.125", co pozostawia 0.95" na każdym końcu dla zbiornika cieczy o wymiarach 0.3125" x 1.375". Zbiornik w sekcji górnej posiada gwint 3/8-24 T.P.I. i głębokość 0.25", aby umożliwić montaż gwintowanych korków ze stali nierdzewnej. Od spodu wyfrezowano szczeliny o wymiarach 1/16" x 0.625", które penetrują zbiornik. Korek po stronie wlotowej posiada otwór przelotowy 10/32" dla polipropylenowego króćca węża 1/8" do podłączenia kurka. Każdy koniec jednostki posiada centralnie rozmieszczoną część z gwintem 10/32 T.P.I. o głębokości 0.25" dla polipropylenowego króćca węża 1/8" w elemencie końcowym o wymiarach 0.45" x 2". Końce wykorzystują otwór 0.07" od dna gwintów, który penetruje zbiornik. Dolna strona sekcji górnej posiada obszar zwężający się o szerokości 0.6875", pod kątem 0.518 stopnia od środka szczeliny LH na dystansie 1.460". Zwężenie to przechodzi w obszar płaski o szerokości 0.6875" x głębokości 0.0118", znajdujący się 0.590" od końca zagłębienia na szkło (lub inną powierzchnię, np. preparat tytanowy). Powierzchnia płaska ta musi być zlicowana ze szkłem (lub inną powierzchnią, np. preparatem tytanowym) po zainstalowaniu preparatu. Zwężenie i powierzchnia płaska są wypolerowane. Powierzchnia preparatu jest zagłębiona o 0.0118" względem dolnej powierzchni. Zagłębienie 0.0118" kontynuuje się do szczeliny zbiornika na końcu RH. O-ring jest osadzony w rowku wokół szczelin i preparatu, pozostawiając 0.020" oryginalnej powierzchni między rowkiem o-ringu a preparatem. Jednostka górna i dolna są nawiercone pod dziesięć otworów. Sekcja górna posiada otwory przelotowe dla wkrętów z łbem stożkowym 8/32 T.P.I. Sekcja dolna posiada otwory rozmieszczone zgodnie z otworami górnymi, które są gwintowane 8/32 T.P.I.. Jednostka dolna posiada okno z przezroczystego szkła, zagłębione i zlicowane z jej powierzchnią, zlokalizowane nad szklanym preparatem powierzchni komórki (lub preparatem tytanowym). Jednostka posiada rowek na o-ring, który obejmuje szczeliny w jednostce górnej, z szerokością pozostawiającą 0.04" oryginalnej powierzchni między dolnym preparatem a wewnętrznym rowkiem o-ringu. O-ringi to czerwony silikon AS568A, numer Dash 044 dla sekcji górnej i 046 dla sekcji dolnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję ryciny 13.

Dyskusja

Nasz obwód przepływowy oraz komora przepływowa pozwalają nam poddać komórki adherentne, np. EPCs, określonym naprężeniom ścinającym płynu. Ponieważ górna i dolna część komory są przezroczyste, adhezję i morfologię komórek można oceniać w czasie rzeczywistym, bezpośrednio przez komorę, lub po zakończeniu eksperymentu przepływowego i rozmontowaniu komory. Na tym etapie komórki mogą zostać zebrane w warunkach sterylnych i ponownie wysiane lub wykorzystane do izolacji DNA lub RNA itp. w celu przeprowadzenia dalszych analiz.

Aby uzyskać przepływ laminarny, konstrukcja komory musi spełniać kilka warunków.

Po pierwsze, przepływ musi być laminarny, co można zweryfikować obliczając liczbę Reynoldsa (Re), która stanowi stosunek sił bezwładności do sił lepkości. (Jeśli przeważają siły lepkości, Re jest mała, a przepływ jest laminarny lub „w pełni rozwinięty” – zazwyczaj dla Re < 2300. Jeśli przeważają siły bezwładności, przepływ staje się coraz bardziej chaotyczny, aż do momentu wystąpienia turbulencji, co ma miejsce dla Re > 4000.) Wartość Re można obliczyć zgodnie z równaniem 3 8,

Wzór na liczbę Reynoldsa, równanie dynamiki płynów, kluczowe pojęcie w analizie przepływu

gdzie ρ to gęstość płynu, Q to natężenie przepływu, μ to lepkość, w i h to odpowiednio szerokość i wysokość komory, a Dh to średnica hydrauliczna, zdefiniowana zgodnie z równaniem 48,

Wzór na średnicę hydrauliczną do analizy przepływu w kanałach prostokątnych.

Liczba Reynoldsa dla naszych trzech komór przepływowych o wysokościach od 166 - 267 μm wynosi od 13,9 - 34,6 przy natężeniach przepływu obliczonych w celu uzyskania naprężenia ścinającego wynoszącego 15 dynes /cm2. Przy natężeniach przepływu obliczonych dla naprężenia ścinającego 100 dynes/ cm2, liczba Reynoldsa w komorach wynosiła od 90,4 - 234. Wszystkie te wartości liczby Reynoldsa są znacznie niższe niż 2300 i spełniają kryterium przepływu laminarnego.

Po drugie, aby pole prędkości i naprężenie ścinające były niezależne od odległości wzdłuż kanału przepływowego (tzn. w pełni rozwinięte), odległość od wlotu płynu do preparasu musi być większa niż długość wlotowa, Le. Warunek ten można spełnić, obliczając długość wlotową zgodnie z równaniem 59.

Równanie termodynamiczne Lₑ = 0.04hRₑ w badaniu analizy naukowej.

Dla wartości wymienionych powyżej długość wlotowa wynosi od 0,01 do 0,25 cm.

Po trzecie, aby zapewnić, że prędkość i naprężenie ścinające w kierunku bocznym nie odbiegają znacząco od wartości dla jednowymiarowego przepływu w kanale (ΔPh/2L), stosunek h/w musi być znacznie mniejszy niż 1. Aby średnie naprężenie ścinające przy ściankach w warunkach przepływu dwuwymiarowego stanowiło 95% naprężenia ścinającego przy ściankach w przepływie jednowymiarowym, h/w musi wynosić 0,10, a aby naprężenie ścinające przy ściankach w warunkach przepływu dwuwymiarowego stanowiło 97,5% naprężenia ścinającego przy ściankach w przepływie jednowymiarowym, h/w musi wynosić 0,05. Przy wymiarach zaprojektowanej przez nas komory przepływowej wynoszących 1,7 cm szerokości i 166 - 267 μm wysokości, kryteria te są spełnione.

Ciśnienie będzie zmieniać się wyłącznie w kierunku przepływu, pod warunkiem braku bocznych gradientów ciśnienia na wlocie. Można to ocenić, stosując barwniki lub cząsteczki w ścieżce przepływu. Ponadto, w przypadku eksperymentów z przepływem ustalonym, w obwodzie przepływowym umieszcza się tłumik pulsacji. Tłumik ten eliminuje większość pulsacji wywoływanych przez pompę perystaltyczną w obwodzie, co pozwala na przyjęcie założenia o przepływie ustalonym. Należy zauważyć, że zastosowany tłumik pulsacji powinien być kompatybilny z pompą i cewkami użytymi w obwodzie, aby mógł skutecznie eliminować pulsacje w przepływie wyjściowym dla konkretnych częstotliwości pompy perystaltycznej. W naszej demonstracji tłumik pulsacji Masterflex L/S zapewnia przepływ laminarny, gdy jest stosowany w linii tłocznej z dowolną pompą z serii Masterflex L/S (0 - 600 RPMs) i cewką I/P 26. Do uzyskania przepływu pulsacyjnego można zastosować pompę programowalną w celu generowania różnych kształtów fal.

W przypadku przepływu pulsacyjnego do generowania różnych kształtów fal można użyć pompy programowalnej.

Ponadto układ został zaprojektowany w taki sposób, aby próbki perfuzatu można było łatwo pobierać w różnych punktach czasowych, bez ryzyka kontaminacji komórek lub medium przepływowego. W naszym przykładzie stężenie NO2- mierzono metodą chemiluminescencji przy użyciu analizatora tlenku azotu Ionics/Sievers (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO) zgodnie z wcześniejszym opisem10. Jako reduktor do analizy azotynów zastosowano jodek potasu w kwasie octowym (14,5 M kwas octowy i 0,05 M KI), który posiada potencjał redukcyjny pozwalający na konwersję azotynów do NO, lecz jest niewystarczający do redukcji wyższych tlenków azotu, takich jak azotany, co czyni go stosunkowo specyficznym dla azotynów. Całkowita ilość wytworzonych azotynów została obliczona jako iloczyn uzyskanego stężenia i całkowitej objętości układu, z uwzględnieniem objętości utraconej podczas pobierania próbek6.

Poniższe kroki są kluczowe dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów przepływowych:

  1. Należy dążyć do uniknięcia powstawania pęcherzyków powietrza podczas konfiguracji przepływu, ponieważ mogą one spowodować oderwanie komórek od powierzchni. Można tego uniknąć, zachowując ostrożność podczas nakładania górnej części komory przepływowej na część dolną; najlepiej zrobić to, utrzymując obie części równolegle do siebie i opuszczając górną część na dolną jednym ruchem, bez korygowania jej położenia. Dzięki temu małe pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się i/lub unosić w kanale przepływowym, zostaną skierowane do pułapek na pęcherzyki znajdujących się na obu końcach aluminiowej obudowy.
  2. Ważne jest, aby upewnić się, że rurka odpływowa w zbiorniku sięga do jego dna. W przeciwnym razie, jeśli poziom perfuzatu spadnie nieco poniżej końcówki rurki, do rurki prowadzącej ze zbiornika do komory może zostać zassane powietrze.
  3. Badacz powinien znać kierunek przepływu pompy, aby pompa przypadkowo nie zaczęła pracować w przeciwnym kierunku po uruchomieniu przepływu, co skutkowałoby zassaniem powietrza do obiegu i komory.
  4. Aby uniknąć powstawania piany (wynikającej z obecności zdenaturowanych białek w surowicy), zaleca się opuszczenie rurki prowadzącej z komory do zbiornika na wysokość około jednej uncji powyżej poziomu perfuzatu wewnątrz zbiornika. Utrzymanie jej powyżej poziomu medium przepływowego pozwala jednak na weryfikację przepływu do zbiornika podczas eksperymentu.
  5. Podczas skręcania elementów komory ważne jest, aby jedną ręką mocno trzymać obudowę, a drugą obsługiwać wkrętarkę elektryczną. Należy pamiętać, że ruch wkrętarki elektrycznej zostanie zamieniony na moment obrotowy, który po dokręceniu śruby może spowodować gwałtowne szarpnięcie komory.
  6. Aby zapobiec powstawaniu fal ciśnienia w obiegu i odrywaniu komórek od powierzchni, należy upewnić się, że wszystkie kurki są otwarte przed uruchomieniem przepływu.
  7. Szczególnie w przypadku długoterminowych badań przepływu (> 48 godzin) zalecamy stosowanie twardszych i bardziej odpornych rurek do wkładania w głowicę pompy, aby zapobiec ich pękaniu.
  8. Możliwe jest „migrowanie” rurek wewnątrz głowicy pompy z powodu źle dopasowanych zębów głowicy. Dlatego sugerujemy zwrócić szczególną uwagę na to, jak rurka jest zabezpieczona w głowicy pompy, oraz zaznaczyć oba końce rurki markerem, aby można było łatwo zauważyć, czy rurka została „wciągnięta” lub przesunięta podczas eksperymentu.
  9. Przed rozpoczęciem perfuzji zawsze należy starannie sprawdzić każdy złączy obiegu i komory, aby zapobiec wyciekowi perfuzatu podczas eksperymentu z powodu wadliwego połączenia. Jest to szczególnie istotne w przypadku złączy dopływowych i odpływowych tłumików pulsacji!
  10. Należy pamiętać o ograniczeniu ekspozycji na światło w przypadku stosowania znaczników fluorescencyjnych.

Możliwym ograniczeniem naszej komory przepływowej jest fakt, że jej wysokość jest stała i zależy od wysokości kanału wyfrezowanego w aluminium. Ma to jednak tę zaletę, że nie ma potrzeby weryfikacji i regulacji wysokości kanału przed każdym eksperymentem, co upraszcza obliczenia naprężenia ścinającego poprzez zwykłe dostosowanie przepływu pompy do pożądanej wartości. W zależności od celów badawczych pożądane może być zwiększenie naprężenia ścinającego bez zwiększania prędkości pompy. W takim przypadku zalecamy zwiększenie lepkości perfuzatu, np. poprzez dodanie dekstranu do medium11.

Potencjalnym ograniczeniem układu przepływowego jest duża objętość użytego medium, co może być problematyczne przy próbie ilościowego oznaczenia bardzo niskich stężeń metabolitów komórkowych. Choć nie pokazano tego w niniejszym materiale, możliwe jest znaczne zmniejszenie objętości układu poprzez zastosowanie mniejszego zbiornika i tłumika pulsacji oraz skrócenie i zmniejszenie średnicy cewek.

Dodatkowo istnieje kilka innych dostępnych komercyjnie systemów, które mogą być wykorzystane do przykładania naprężenia ścinającego płynu do komórek w hodowli. Systemy oparte na mikrofluidyce, np. system BioFlux firmy Fluxion, umożliwiają jednoczesną analizę komórek w różnych mikrofluidycznych kanałach przepływowych, do których roztwór jest wprowadzany przez płytki wielodołkowe pełniące funkcję zbiorników wejściowych i wyjściowych dla tych kanałów12,13,14. Jednakże systemy te oraz inne systemy mikrofluidyczne nie są kompatybilne ze standardowymi szkiełkami mikroskopowymi i nie pozwalają na odzyskanie wystarczającej liczby komórek do dalszych eksperymentów, takich jak RT-PCR lub Western Blot. Ponadto są one mniej przyjazne dla użytkownika, kosztują minimum 40 000 USD i w zależności od wyposażenia dodatkowego mogą osiągnąć całkowity koszt przekraczający 100 000 USD.

Dwa systemy makrofluidyczne dostępne w Flexcell International Corporation, systemy Flexcell Streamer i FlexFlow, zostały z powodzeniem wykorzystane do badania komórek śródbłonka15,16,17, ludzkich komórek pierścienia włóknistego18 oraz fibroblastów19 w warunkach przepływu płynu. Trzeci system, dostępny za pośrednictwem GlycoTech, został wykorzystany do badania adhezji komórek nowotworowych20 oraz adhezji leukocytów21 do monowarstw śródbłonka.

System Streamer umożliwia jednoczesne badanie kilku slajdów w tych samych warunkach naprężenia ścinającego, lecz nie posiada okna obserwacyjnego i – w przeciwieństwie do naszej konstrukcji – nie pozwala na wizualizację komórek w czasie rzeczywistym podczas przepływu.

System FlexFlow posiada okno obserwacyjne, lecz wymaga użycia mikroskopu pionowego, który może nie być standardowym mikroskopem dostępnym w większości laboratoriów. Co więcej, system FlexFlow wymaga, aby szkiełko nakrywkowe z naniesioną warstwą komórek zostało odwrócone podczas umieszczania go w komorze przepływowej. Uniemożliwia to wizualizację komórek fluorescencyjnych na powierzchni nieprzezroczystej, takiej jak szkło powlekane tytanem, co demonstrujemy w naszej pracy. Wreszcie, specjalistyczne szkiełka nakrywkowe muszą być kupowane konkretnie do systemu FlexFlow, którego koszt wynosi kilka tysięcy dolarów, podobnie jak w przypadku systemu Flexcell Streamer.

Firma GlycoTech oferuje okrągłe i prostokątne komory przepływowe z równoległymi płytkami, które są znacznie tańsze, lecz wykonane z odlewanego akrylu, którego nie można wygodnie sterylizować w autoklawie w taki sposób, jak naszej komory. Warto zauważyć, że inne opisane jako autoklawowalne komory przepływowe wydają się niepraktyczne, ponieważ wymagają one specjalnych soczewek mikroskopowych22,23. System GlycoTech wykorzystuje uszczelki z gumy silikonowej umieszczone między płytką górną a dolną, których grubość zmienia się przy wielokrotnym użytkowaniu, co z czasem wpływa na wysokość komory (producent zaleca zakup nowych uszczelek po każdych dziesięciu użyciach). Nasza aluminiowa komora z wbudowanymi pierścieniami O-ring umożliwia całkowite przyleganie płytek górnej i dolnej oraz zapewnia stałą wysokość komory pomiędzy eksperymentami. Wreszcie, w wielu konstrukcjach komór przepływowych, w tym w komorach GlycoTech, do uzyskania szczelnego zamknięcia niezbędne są pompy próżniowe, które w naszej konstrukcji nie są wymagane.

Choć nie pokazano tego tutaj, komora przepływową można utrzymywać pod mikroskopem przez cały czas trwania eksperymentu przepływowego w celu obrazowania adhezji i/lub zachowania komórek w czasie rzeczywistym. Jeśli jest to pożądane, zalecamy stosowanie lamp grzewczych lub podkładki grzewczej pod komorą w celu utrzymania temperatury perfuzatu na poziomie 37 °C. Ponadto pompę rolkową można zastąpić pompą strzykawkową, jeśli nie jest pożądana „recyrkulacja” komórek, metabolitów, leków badawczych lub czynników24.

Możliwe jest również przepływanie komórek znakowanych w różny sposób nad komórkami adherentnymi, np. fluorescencyjnych płytek nad warstwą konfluentnych EPC (stosując test płytek opisany przez Achneck i wsp.6,25) w celu oceny oddziaływań międzykomórkowych w warunkach naprężenia ścinającego cieczy. Nasza komora przepływowa łączy w sobie cenne cechy innych dostępnych komór przepływowych, takich jak port pobierania perfuzatu i okno obserwacyjne, a także posiada istotną zaletę w postaci kompatybilności z mikroskopem odwróconym lub prostym. Jest ona w pełni autoklawowalna i umożliwia powtarzanie eksperymentów przy stałej wysokości komory, bez konieczności stosowania pomp próżniowych w celu uzyskania szczelnego zamknięcia.

Oświadczenia

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Cole-Parmer Instrument Co.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Joe’owi Owenowi z warsztatu aparatury i maszyn biomedycznych za jego niestrudzone wysiłki przy obróbce i montażu części komory przepływowej oraz Mattowi Maudsleyowi z Leica Microsystems za pomoc w opracowaniu technik obrazowania komórek w komorach przepływowych. Jesteśmy wdzięczni Kevinowi Collinsowi z Duke Perfusion Services oraz dr Steve’owi Wallace’owi z Katedry Inżynierii Biomedycznej za pomocne sugestie dotyczące projektu obwodu przepływowego. Chcielibyśmy również podziękować National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program za wsparcie Alexandry Jantzen oraz NIH za wsparcie w ramach grantu „Autologous EPC lining to improve biocompatibility of circulatory assist devices” RC1HL099863-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 10 mlCole-Parmer07940-12
Korki trójdrożne 1-drożneCole-Parmer30600-00
Strzykawka 30 mlBD Biosciences309650
Korki trójdrożne 4-drożneCole-Parmer30600-04
Stop aluminum AlloyN/A6061
Szalki do hodowli komórkowej (4-dołkowe, prostokątne)Thermo Fisher Scientific, Inc.267061
Cell Tracker OrangeInvitrogenC34551
DMSOResearch Organics2162D
DPBS (-/-)Invitrogen14190-144
EGM-2 SinglequotsLonza Inc.CC-4176
Adapter Luer żeńskiCole-ParmerSI-45500-04
FibronektynaSigma-AldrichF0895-2MG
Butelka szklana (250 ml) z nakrętkąCole-Parmer34594-24
Przewód sztywnyCole-Parmer06508-16
HBSSSigma-AldrichH8264-500ML
HistopaqueSigma-AldrichH8889-500ML
Roztwór barwiący H–chstSigma-AldrichH6024
Hyclone FBSThermo Fisher Scientific, Inc.SH30071.01
L-glutaminaLonza Inc.17-605E
Adapter Luer męskiCole-ParmerEW-45505-04
Pożywka MCDB-131, 1XCellgro15-100-CV
Złączki polipropylenowe zでrdzeniemCole-Parmer06365-90
Pierścienie O-ringN/AAS568A
Tłumik pulsacjiCole-Parmer07596-20
Napęd pompy (napęd ekonomiczny Masterflex L/S o zmiennej prędkości)Cole-Parmer7524-40
Głowica pompy (głowica pompy Masterflex Easy Load)Cole-Parmer07518-60
SuwakCole-Parmer48500-00
Przewód miękkiCole-Parmer96400-16
Filtr strzykawkowyCole-Parmer02915-12
Barwnik kwasów nukleinowych Sytox OrangeInvitrogenS-11368
Trypsyna EDTALonza Inc.CC-5012
Roztwór neutralizujący trypsynęLonza Inc.CC-5002

Bibliografia

  1. Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
  2. Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
  3. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
  4. Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
  5. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
  6. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  7. Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
  8. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).
  9. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).
  10. Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
  11. Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
  12. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
  13. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  14. Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
  15. Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
  16. Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
  17. Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
  18. Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
  19. Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
  20. Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
  21. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
  22. Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
  23. Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  24. Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
  25. Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprężenie ścinające płynuadhezja komórkowamorfologia komórekmikroskopia fluorescencyjnapobieranie próbek perfuzatutlenek azotu
Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.