Równoległa komora przepływowa i ciągły obwód przepływu do oceny śródbłonkowych komórek progenitorowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływu laminarnego

Summary

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniu ścinającemu przepływu laminarnego w sterylnym obwodzie ciągłego przepływu. Adhezja komórek, morfologia mogą być badane przez przezroczystą komorę, próbki uzyskane z obwodu do analizy metabolitów oraz komórki pobrane po ekspozycji na ścinanie do przyszłych eksperymentów lub hodowli.

Abstract

Ogólnym celem tej metody jest opisanie techniki poddawania przylegających komórek warunkom przepływu laminarnego i oceny ich reakcji na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu¹.

Nasz projekt komory przepływowej i obwód przepływu (Rys. 1) zawiera przezroczysty obszar widzenia, który umożliwia testowanie adhezji komórek i obrazowanie morfologii komórek bezpośrednio przed przepływem (Rys. 11A, B), w różnych punktach czasowych podczas przepływu (Rys. 11C) i po przepływie (Rys. 11D). Eksperymenty te zilustrowano ludzkimi komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi pępowinowej (EPC) i EPC świń^2,3.

Ta metoda ma również zastosowanie do innych typów komórek przylegających, np. komórek mięśni gładkich (SMC) lub fibroblastów.

Komora i wszystkie części obwodu są łatwo sterylizowane za pomocą autoklawowania parowego. W przeciwieństwie do innych komór, np. komór mikroprzepływowych, duża liczba komórek (> 1 milion w zależności od wielkości komórki) może być odzyskana po eksperymencie przepływowym w sterylnych warunkach do hodowli komórkowej lub innych eksperymentów, np. ekstrakcji DNA lub RNA, immunohistochemii (ryc. 11E) lub skaningowej mikroskopii elektronowej⁵. Naprężenie ścinające można regulować, zmieniając natężenie przepływu perfuzatu, lepkość płynu lub wysokość i szerokość kanału. Ten ostatni może zmniejszyć objętość płynu lub zapotrzebowanie na komórki, zapewniając jednocześnie utrzymanie jednowymiarowego przepływu. Nie jest konieczne mierzenie wysokości komory między eksperymentami, ponieważ wysokość komory nie zależy od użycia uszczelek, co znacznie zwiększa łatwość wielu eksperymentów. Co więcej, konstrukcja obwodu umożliwia łatwe pobieranie próbek perfuzatu do analizy i/lub kwantyfikacji metabolitów wydzielanych przez komórki pod wpływem naprężeń ścinających płynu, np. tlenku azotu (rys. 12)⁶.

Protocol

1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka

1. Przed pobraniem obwodowej krwi ludzkiej należy przedłożyć protokół badawczy do Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB), a po jego zatwierdzeniu uzyskać świadomą zgodę dawców ochotników (pobranie krwi obwodowej i izolacja EPC zostały zatwierdzone przez IRB Uniwersytetu Duke'a i są w pełni zgodne z amerykańskimi wymogami regulacyjnymi dotyczącymi ochrony uczestników badań na ludziach).
2. Pracując z EPC pochodzenia zwierzęcego, poproś o zatwierdzenie protokołu badawczego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC). Wszystkie nasze eksperymenty na świniach zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Duke'a i zostały przeprowadzone zgodnie z najwyższymi standardami humanitarnej opieki.
3. W celu wyizolowania śródbłonkowych komórek progenitorowych należy pobrać 50 ml krwi obwodowej za pomocą standardowej techniki flebotomii od dawcy, który wyraził zgodę, do worków do pobierania krwi wypełnionych dekstrozą fosforanową cytrynianu antykoagulantu i rozcieńczyć roztwór w stosunku 1:1 buforowym roztworem soli Hanka (bez CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄) i nałożyć na równe objętości histopaku, aby utworzyć dobrze zdefiniowane warstwy.
4. Odwirować (30 min, 740 g, ustawienie niskiego pęknięcia) i zebrać warstwę komórki jednojądrzastej (MNC) (kożuch). Ponownie zawiesić i przepłukać MNC x 3 solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) x 10 min, 515 g, przed posiewem na dwie 12-dołkowe płytki w pełnej pożywce wzrostowej EPC (pożywka MCDB-131 z 5 ml 200 mM L-glutaminy, 10% FBS i EGM-2 SingleQuots) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
5. Powoli zmieniaj podłoże co 24 godziny przez pierwsze 7 dni, a następnie co drugi dzień. Kolonie EPC można zidentyfikować średnio po 14 dniach na podstawie morfologii kostki brukowej. Gdy EPC w hodowli pokryją 1/4 powierzchni 12-dołkowej, rozpręż komórki i potwierdź tożsamość EPC za pomocą cytometrii przepływowej, testując obecność markerów powierzchniowych CD31 i brak CD14, CD45, jak opisano wcześniej ⁶. Inne testy, które można wykonać, obejmują morfologię komórek i znakowanie za pomocą DiI-Ac-LDL.
6. W przypadku doświadczeń opisanych w niniejszym dokumencie, rozprężyć wyizolowane EPC, aż prawie zlewają się w 3 kolbach do hodowli komórek T-75 w pożywce EPC w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

2. Obliczanie naprężeń ścinających

1. Zalecamy, aby obliczenia te zostały wykonane przed wyprodukowaniem komory i kanału, aby dokładnie zrozumieć warunki, które można osiągnąć. Oblicz natężenie przepływu perfuzatu w swoim obwodzie na podstawie pożądanych naprężeń ścinających, które mają być przyłożone do komórek zgodnie z równaniem 1 ¹,

gdzie Q to pożądane natężenie przepływu, τ to docelowe naprężenie ścinające działające stycznie na komórki, w to szerokość komory przepływu, h to wysokość komory przepływu, a μ to lepkość perfuzatu (medium przepływowego).

2. Typowa wartość lepkości (μ) dla stosowanego podłoża wynosi 0,9 cP (0,009 g ^{cm-1 s-1}). Należy pamiętać, że lepkość można również zwiększyć za pomocą dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej, jeśli jest to pożądane ⁷. Typowa wartość docelowego naprężenia ścinającego (τ) wynosi 15 dyn/^cm2 (typowe tętnicze naprężenie ścinające) lub 100 dyn/^cm2, jeśli pożądane jest suprafizjologiczne naprężenie ścinające. Nasza komora typowo ma szerokość (szer.) 1.9 cm i wysokość (h) w zakresie 166 - 267 μm.

3. Produkcja komór przepływowych

1. Wytnij górną i dolną płytę komory z prostokątnej kolby ze stopu aluminium 6061 o wymiarach górnych 7 x 2 x 0,5 "i dolnych wymiarach 7 x 2 x 0,25".
2. Wdychaj górną płytę w środkowej części na głębokość 0,125 cala, pozostawiając 0,950 cala na koniec na zbiornik płynu o szerokości 1,375 cala i głębokości 0,3125 cala.
3. Wywierć szczeliny o szerokości 1/16 cala i długości 0,625 cala od spodu, aby wniknąć do zbiornika na końcach dopływu i odpływu.
4. Na końcu każdej górnej płyty wywierć centralnie umieszczony otwór 10/32" na prowadnice na cal (TPI) na polipropylenowy króciec węża 1/8", aby przebić zbiornik płynu. Na końcu dopływu utwórz boczną zaślepkę z otworem przelotowym 10/32" TPI na polipropylenowy króciec węża 1/8".
5. Zwęź górną dolną stronę od dopływu płynu do szklanego okienka podglądu pod kątem 0,518 stopnia, aby uzyskać odpowiednie wymieszanie płynu.
6. Wytnij szklane okienko przesuwne w dolnej płycie w linii z górnym viewokienkiem. Za pomocą cementu akwariowego przyklej szklaną szkiełko do komory. Pozostawić do utwardzenia na co najmniej 24 godziny. Upewnij się, że viewokienko jest wpuszczone tak, aby szkiełko mikroskopu o wymiarach 75 x 25 x 1 mm było równo osadzone w komorze.
7. Utwórz wgłębienie na O-ring wokół spodu górnej i dolnej płyty tak, aby były oddalone od siebie o 0,02 cala. Włóż gumowe O-ringi.
8. Wywierć 10 pasujących otworów TPI 8/32" w górnej i dolnej komorze do użycia ze z płaskim 8/32".

4. Zespół obwodu przepływu

1. Najpierw zmontuj cały obwód przepływu, a następnie przystąp do jego sterylizacji.
2. Przymocuj 36-calowy odcinek twardej rurki do jednego końca impulsu dampener (przez złącze 1/8"). Do drugiego końca przymocuj 18-calowy segment miękkiej rurki.
3. Umieść męski adapter luer 1/8" na końcu sekcji miękkiej rurki 18", wymienionej w kroku 4.2. Podłącz męski luer do żeńskiego adaptera luer 1/8". Podłącz żeński luer do nowej miękkiej rurki segmentowej 18".
4. Wywierć trzy otwory w szklanej nasadce zlewki o pojemności 250 ml, aby pasowały do rurki. Włóż 1.5-calowy segment miękkiej rurki (jako odpowietrznik) do jednego otworu, a wolne końce twardej i miękkiej rurki przez pozostałe 2 otwory w nakrętce do szklanej butelki o pojemności 250 ml (jako zbiornik) (rys. 2). Upewnij się, że twardy przewód sięga dna zbiornika (jako rurka odpływowa ze zbiornika).
5. Sterylizować powyższe części w autoklawie parowym w temperaturze 121 °C przez 60 minut. Dodatkowo autoklawować w autoklawie jedną kompletną komorę przepływową, 3 x 2" segmenty miękkich wężyków, 1 męski i 1 żeński adapter Luer 1/8", 4 x 1/2" i 6 x z płaskim 5/16" 8-32, 1 para pęsety, jeden szkiełko szkiełkowe 75 x 25 x 1 mm (lub inny pożądany materiał powierzchni komórki), i 2 ręczniki chirurgiczne.
6. Umieść sterylne ręczniki w okapie z przepływem laminarnym. Umieść obwód przepływu, komorę przepływową, 4 x 4-drogowe zawory odcinające, 1 x 1-drogowy kran i wszystkie wysterylizowane części z kroku 4.5 na tym sterylnym polu.
7. Teraz użyj sterylnych rękawiczek, aby podłączyć dwa 4-drogowe kurki. Umieść zaślepki na otwartych portach próbki.
8. Odłącz męskie i żeńskie adaptery luer mocujące dwa miękkie segmenty rurki obwodu przepływu i włóż podłączone zawory odcinające (rys. 3).
9. Podłączyć miękki przewód włożony do zbiornika do strzykawki o pojemności 30 ml i wyjąć tłok strzykawki. Napełnij butelkę 125 ml pożywki EPC (rys. 4).
10. Umieścić sterylny filtr strzykawkowy w otworze wentylacyjnym (rys. 4).
11. Przenieść obieg przepływu do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
12. Clamp twardą rurkę w głowicy pompy rolkowej przeznaczonej do użytku z tego typu przewodami (rys. 5). Upewnij się, że rurka nie zachodzi na szyny montażowe pompy rolkowej. Zaznacz rurkę w miejscu, w którym wychodzi z głowicy pompy po obu stronach, za pomocą pisaka do znakowania.
13. Upewnij się, że wszystkie zawory odcinające są zamknięte w kierunku sample porty i otwarte wzdłuż obwodu przepływu. Uruchom pompę. Sprawdź kierunek przepływu. Perfuzat powinien przemieszczać się ze szklanego zbiornika przez twarde rurki do tłumika impulsów.

5. Etykietowanie fluorescencyjne EPC

1. Podczas gdy obieg przepływu nagrzeje się do 37 °C, przygotuj komórki do wysiewu na szkiełko. Należy pamiętać, że znakowanie fluorescencyjne jest wymagane, jeśli komórki mają być wizualizowane na nieprzezroczystych materiałach, np. tytanie (Ti).
2. Stwórz 1 mM roztwór podstawowy Cell Tracker Orange (CTO), rozcieńczając 50 μg proszku CTO z 90 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Pamiętaj, aby chronić tę mieszaninę przed ekspozycją na światło (wyłącz światło podczas pracy pod okapem przepływowym).
3. Stwórz 2 μM roztwór roboczy CTO, rozcieńczając 36 μl roztworu podstawowego CTO w 18 ml pożywki MCDB-131 bez surowicy.
4. Przepłukać EPC w 3 blisko zlewających się kolbach do hodowli komórek T-75 za pomocą 10 ml DPBS (bez Ca lub Mg).
5. Dodać 6 ml roztworu roboczego 2 μM CTO do każdej kolby. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Przepłukać każdą kolbę x 2 10 ml DPBS (bez Ca i Mg).
6. Dodać 4 ml trypsyny do każdej kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizować 8 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
7. Przemyć przez odwirowanie x 5 min w temperaturze 600 g i ponownie zawiesić w 5 ml pożywki EPC.

6. Sadzenie komórek w szkiełku przed montażem komory przepływowej

1. Można zastosować zjeżdżalnię wykonaną ze szkła, tytanu lub innego materiału, a powierzchnię zjeżdżalni można modyfikować poprzez powlekanie przędzą polimeru lub dodanie warstwy metalu. Umieścić szkiełko w sterylnym, prostokątnym, czterokomorowym naczyniu do hodowli komórkowych (lub użyć szkiełka do hodowli tkankowych, jeśli pożądana jest powierzchnia polistyrenowa). Policz komórki i zasiewaj 1,5 x 10⁶ komórek na szkiełku w 5 ml pożywki EPC x 6 godzin, jeśli pożądana jest zlewająca się warstwa komórek na początku przepływu (ryc. 11A).
2. W celu zbadania rozprzestrzeniania się i adhezji komórek pod wpływem naprężeń ścinających płynu, pozwól 3 x 10⁶ komórek przylegać tylko przez 15 minut przed rozpoczęciem przepływu (szybki siew) (ryc. 11B).

7. Zespół komory przepływowej

1. Używając sterylnych rękawiczek, podłącz jeden segment miękkiej rurki 2" do żeńskiego adaptera luer 1/8". Podłącz kolejny 2-calowy segment miękkiej rurki do męskiego adaptera Luer 1/8".
2. Podłącz miękką rurkę 2" z żeńskim adapterem luer do portu dopływowego. Podłącz 2-calową miękką rurkę z męskim luerem do portu odpływowego. Podłącz 4-kierunkowe kurki do obu tych adapterów luer. Podłącz pozostałą 2-calową miękką rurkę do bocznego złącza portu wychodzącego z pułapki bąbelkowej i podłącz 1-kierunkowy kran (rys. 6).
3. Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij szkiełko z nasionami komórek z naczynia do hodowli komórkowej (lub, jeśli używasz kolby szkiełkowej, wyjmij kolbę na szkiełku) i umieść ją we wgłębieniu na dolnej płycie komory przepływowej. Upewnij się, że szkiełko jest umieszczone stroną z komórkami skierowaną do góry.
4. Odmierzyć pipetą 10 ml ciepłego podłoża EPC na szkiełko podstawowe. Pozwól, aby medium pokryło szkiełko i komorę przepływu, ale nie rozlewaj medium na O-ring na dolnej płycie.
5. Umieść górną płytę komory przepływowej na dolnej płycie, wyrównując otwory na. Uważaj, aby na tym etapie nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory, trzymając dwie płytki równolegle.
6. Przykręć ze sobą płytki (automatyczny śrubokręt zasilany bateryjnie przyspiesza ten proces).
7. Usunąć pęcherzyki powietrza z pułapki pęcherzykowej dopływu, otwierając 1-drogowy kran przymocowany do portu pułapki bąbelkowej po stronie dopływu i delikatnie przepłukać rurkę dopływu pożywką EPC za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Następnie zamknij ten kran i zakręć go (rys. 7).
8. Następnie usunąć pęcherzyki powietrza z kanału komory, otwierając 4-drogowy kran portu odpływowego i delikatnie przepłukując medium EPC przez komorę przepływową, ponownie za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Jeśli pozostaną duże pęcherzyki, podnieś koniec odpływu komory do kąta 45° (rys. 8).
9. Zakryj wszystkie 4-drogowe połączenia kranu i zamknij je. Przenieść komorę przepływową do inkubatora ze zmontowanym obwodem przepływu ( rys. 9).
10. Wstrzymaj pompę obwodu przepływu. Zamknąć kurki odcinające obwód przepływu w kierunku przepływu, aby zapobiec wyciekom i utrzymać sterylność wnętrza komory. Przetransportować komorę przepływową z okapu przepływowego do obwodu przepływowego. Podłączyć komorę przepływową do obwodu przepływu. Otworzyć kurki w kierunku przepływu. Wznów pompę przepływową. Upewnij się, że perfuzat przepływa we właściwym kierunku. Dostosuj natężenie przepływu do żądanego naprężenia ścinającego.
11. Podczas eksperymentu przepływowego komorę przepływową można wyjąć z obwodu w celu zobrazowania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. W tym celu należy odłączyć komorę przepływową od obwodu przepływu na połączeniach kurek-kurek. Aby zachować sterylność komory, przed wyjęciem obwodu przepływu z inkubatora należy zamknąć kurki odcinające obwodu przepływu i krany komory przepływowej w kierunku przepływu oraz zakryć wszystkie zawory odcinające (rys. 9).

8. Pobieranie próbek perfuzacji

1. W celu łatwego pobierania próbek perfuzatu do analizy (np. syntezy tlenku azotu) należy najpierw wstrzymać działanie pompy.
2. Zamknij kran znajdujący się najbliżej tłumika impulsów. Zdjąć nasadkę ochronną i włożyć małą strzykawkę, np. strzykawkę o pojemności 3 ml, do portu na próbkę. Zachowaj nakrętkę i upewnij się, że nie zostanie zanieczyszczona, umieszczając ją do góry nogami.
3. Zamknąć zawór odcinający w kierunku komory przepływowej, pozostawiając port próbki i obwód w kierunku tłumika impulsów otwarty.
4. Pobrać żądaną ilość próbki, np. 150 μl, z obwodu. Zamknąć zawór odcinający w kierunku portu próbki przed wyjęciem strzykawki. Przechowywać próbkę perfuzatu w oznakowanej fiolce i zamrażać w temperaturze -80 °C (w celu oznaczenia tlenku azotu w późniejszym czasie).
5. Ponownie zamknij port próbki i upewnij się, że wszystkie zawory odcinające są otwarte przed rozpoczęciem przepływu.

9. Reprezentatywne wyniki

Korzystając z naszej metody szybkiego siewu, komórki progenitorowe śródbłonka pochodzące z ludzkiej krwi mogą być umieszczane na szkiełkach tytanowych przez 15 minut i przylegać do nich pod wpływem fizjologicznych (tętniczych) sił ścinających 15 dyn/cm².

Jak pokazano na rysunku 10, EPC rozprzestrzeniają się pod wpływem przepływu od 210 ± 11,4 μm², bezpośrednio po wysianiu, do 657 ± 39,1 μm² po 3 godzinach i do 1152 ± 55,3^μm2 po 24 godzinach naprężenia ścinającego płynu 15 dyn/^cm2 (różnica między grupami jest statystycznie istotna przy p < 0,0001, 1-kierunkowa ANOVA). Równolegle do wzrostu powierzchni komórki, którą można zobrazować przez przezroczystą komorę za pomocą mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego, okrągłość oblicza się zgodnie z równaniem 2 ⁶

zmniejszono z 878 x ^10-3 ± 5,9 x ^10-3, natychmiast po wysianiu, do 671 x ^10-3 ± 19,2 x ^10-3 po 3 godzinach, oraz do 526 x ^10-3 ± 19,2 x ^10-3 po 48 godzinach tej samej ekspozycji na naprężenie ścinające płyn (różnica między grupami jest ponownie statystycznie istotna przy p < 0,0001, 1-kierunkowa ANOVA).

Rysunek 11D ilustruje, że EPC wyrównują się i orientują w kierunku przepływu po 48 godzinach naprężenia ścinającego płynu przy 15 dynach/^cm2 w porównaniu do ich losowej orientacji po okresie statycznego wysiewu wynoszącym 6 godzin, pokazanym na rysunku 11A.

Nasza metoda pozwala również na uzyskanie próbek perfuzatu w określonych punktach czasowych do analizy i/lub kwantyfikacji wydzielanych metabolitów komórkowych. Jako reprezentatywny przykład przedstawiamy produkcję azotynów (NO₂-) podczas 48-godzinnego eksperymentu przepływowego z EPC świń na rysunku 12. Bezpośrednio zmierzyliśmy ten pierwotny produkt utleniania tlenku azotu (NO) jako zastępczy marker NO w pożywkach próbek pobranych z obwodu przepływu w różnych punktach czasowych na 12,0 nmol po 6 godzinach, 13,1 nmol po 12 godzinach, 16,3 nmol po 24 godzinach i 24,6 nmol po 48 godzinach dla 1 x 10⁶ komórek przy 15 dynach / cm^{2 6}.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający przegląd montażu obwodu przepływu i eksperymentu przepływowego. (A) Zespół obwodu przepływu bez komory przepływowej. W zestawie znajduje się zbiornik, tłumik impulsów, twarde rurki, miękkie rurki, 4-drogowe kurki i podłączone adaptery luer, a także filtr powietrza. (B) Podłączenie komory przepływowej przez segment twardej rurki do głowicy pompy przepływowej. (C) Wprowadzenie szkiełka z ziarnem EPC do dolnej płyty komory przepływowej (D). Kompletny montaż obwodu przepływu z komorą przepływową.

Rysunek 2. Całkowicie zmontowany obwód przepływowy do sterylizacji.

Rysunek 3. Zmontowany obieg przepływu po sterylizacji z zaworami odcinającymi w komplecie.

Rysunek 4. Napełnianie szklanego zbiornika 125 ml pożywki EPC.

Rysunek 5. Obwód przepływu zaciśnięty w głowicy pompy przepływowej przed włożeniem komory przepływowej.

Rysunek 6. Zespół płyty górnej komory.

Rysunek 7. Przepłukiwanie pułapki pęcherzyków pożywką EPC w celu usunięcia pęcherzyków powietrza ze strony dopływu do komory.

Rysunek 8. Przepłukiwanie komory medium EPC w celu usunięcia pęcherzyków z suwaka i strony odpływowej komory.

Rysunek 9. Całkowicie zmontowany obwód przepływu z włożoną komorą przepływową podczas eksperymentu przepływowego.

Rysunek 10. Powierzchnia EPC (w μm²) zwiększa się w czasie trwania eksperymentu przepływowego.

Rysunek 11. (A) Obraz mikroskopu świetlnego EPC HUCB osadzonych na szkiełku pokrytym fibronektyną x 6 godzin przed przepływem w powiększeniu 100x. (B) HUCB EPC oznaczone CTO i szybko rozsiewane na szkiełku Ti x 15 minut przed przepływem, wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w powiększeniu 100x. (C) Ten sam szkiełko Ti z HUCB EPC jak w (B), po 3 godzinach przepływu przy 100 dynach/^cm2 i zobrazowane przez przezroczystą komorę przy 100-krotnym powiększeniu. Zwróć uwagę na rozmieszczenie komórek, ale nadal losową orientację po 3 godzinach przepływu. (D) Ten sam szkiełko Ti, teraz po 48 godzinach ekspozycji na przepływ przy 100-krotnym powiększeniu. EPC są znakowane CTO, a jądra komórkowe są barwione barwnikiem Hoechst (niebieskim) po przepływie. Zwróć uwagę na wyrównanie komórek w kierunku przepływu. (E) EPC świń dla porównania na Ti po 48 godzinach przepływu i 15 dynach/^cm2 ekspozycji na naprężenia ścinające. Granice komórek wybarwiono barwnikiem anty-PECAM (zielonym), a jądra barwieniem Sytox Orange Nucleic Acid. Zwróć uwagę na wyrównanie komórek do kierunku przepływu.

Rysunek 12. Wykres przedstawia BRAK produkcji EPC świń w ciągu 48 godzin przepływu. Pierwszorzędowy produkt utleniania NO, azotyn (NO₂-), mierzono jako marker zastępczy NO z próbek pożywki pobranych w różnych punktach czasowych podczas przepływu.

Rysunek 13. Komora przepływowa wykonana jest z prostokątnej kolby ze stopu aluminium 6061, przy czym górna sekcja (A) ma wymiary 0,5 "x 2" x 7", a dolna sekcja (B) 0,25 "x 2" x 7". Górna część jest strugana na spodniej powierzchni styku O-ringu do 0,45 cala, aby zapewnić płaskość do uszczelnienia. Górna część jest zagłębiona w środkowej części na 0,125", co pozostawia 0,95" na końcu na zbiornik płynu o wymiarach 0,3125" x 1,375". Zbiornik górnej części jest gwintowany 3/8-24 TPI i ma głębokość 0,25 cala, aby otrzymać gwintowane korki ze stali nierdzewnej. Szczeliny o wymiarach 1/16" x 0,625" zostały obrobione w spodniej części, która przenika do zbiornika. Korek po stronie dopływu ma otwór przelotowy 10/32" na polipropylenowy króciec węża 1/8" do przymocowania do kranu odcinającego. Każdy koniec jednostki ma centralnie umieszczoną gwintowaną część 10/32 TPI o głębokości 0,25 cala na polipropylenowy króciec węża 1/8" na końcu 0,45" x 2". Końce wykorzystują otwór 0,07 cala od dołu gwintu, aby przeniknąć do zbiornika. Spód górnej części ma zwężający się obszar o szerokości 0,6875 cala, 0,518 stopnia od środka szczeliny LH na odległość 1,460 cala. Ten stożek wtapia się w płaską powierzchnię o szerokości 0,6875 cala x głębokości 0,0118 cala i 0,590 cala od końca wgłębienia w szkło (lub inną powierzchnię, np. tytanową prowadnicę). To płaskie mieszkanie musi być zlicowane ze szkłem (lub inną powierzchnią, np. tytanową prowadnicą) po zamontowaniu prowadnicy. Stożek i płaskość są polerowane. Powierzchnia prowadnicy jest zagłębiona w stosunku 0,0118" do dolnej powierzchni. Wgłębienie 0,0118" ciągnie się do szczeliny zbiornika po prawej stronie. O-ring jest całkowicie zagłębiony wokół szczelin i suwaka, pozostawiając 0,020 cala oryginalnej powierzchni między rowkiem O-ringu a suwakiem. Jednostka górna i dolna są wiercone na dziesięć otworów. W górnej części znajdują się otwory przelotowe na z stożkowym płaskim 8/32 TPI. Dolna część ma otwory umieszczone pasujące do górnych otworów i jest gwintowana 8/32 TPI. Dolna jednostka ma przezroczyste szklane okienko przesuwne wpuszczone w jedną stronę, którego powierzchnia znajduje się nad szkiełkiem szkiełkowym (lub szkiełkiem tytanowym). Jednostka posiada rowek na O-ring, który obejmuje szczeliny w górnej części o szerokości pozostawienia 0,04 cala oryginalnej powierzchni między dolnym suwakiem a wewnętrznym rowkiem O-ringu. O-ringi są wykonane z czerwonego silikonu AS568A, numer kreski 044 dla górnej części i 046 dla dolnej części. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 13.

Discussion

Nasz obwód przepływu i komora przepływowa pozwalają nam poddawać przylegające ogniwa, np. EPC, określonym naprężeniom ścinającym płynu. Ponieważ górna i dolna część komory są przezroczyste, adhezja i morfologia komórek mogą być oceniane w czasie rzeczywistym, przez samą komorę lub po eksperymencie przepływu i demontażu komory przepływowej. W tym momencie komórki mogą być pobierane w sterylnych warunkach i albo ponownie powlekane, albo używane do zbierania ich DNA lub RNA itp., w celu dalszej analizy.

Aby uzyskać przepływ laminarny, konstrukcja komory musi być taka, aby spełnionych było kilka warunków.

Po pierwsze, przepływ musi być laminarny, co można zweryfikować, obliczając jego liczbę Reynoldsa (Re), która jest stosunkiem sił bezwładności do sił lepkości. (Jeśli przeważają siły lepkościowe, Re jest małe, a przepływ jest laminarny lub "w pełni rozwinięty" - zwykle dla Re < 2300. Jeśli przeważają siły bezwładności, przepływ staje się coraz bardziej przypadkowy, aż stanie się turbulentny, jak ma to miejsce w przypadku Re > 4000). Możemy obliczyć Re zgodnie z równaniem 3 ⁸,

Gdzie ρ jest gęstością płynu, Q jest natężeniem przepływu, μ jest lepkością, w i h są odpowiednio szerokością i wysokością komory, a D_h jest średnicą hydrauliczną, zdefiniowaną zgodnie z równaniem 4⁸,

Liczba Reynoldsa naszych trzech komór przepływowych, o wysokościach od 166 do 267 μm, waha się od 13,9 do 34,6 przy natężeniach przepływu obliczonych w celu uzyskania naprężenia ścinającego 15 dyn / cm². Przy natężeniach przepływu obliczonych dla naprężenia ścinającego 100 dyn/^cm2, liczba komór Reynoldsa wahała się od 90,4 do 234. Wszystkie te liczby Reynoldsa są znacznie niższe niż 2300 i spełniają kryterium przepływu laminarnego.

Po drugie, aby pole prędkości i naprężenie ścinające były niezależne od odległości wzdłuż kanału przepływowego (tj. w pełni rozwinięte), odległość od wlotu płynu do ślizgu musi być większa niż długość wlotu, L_e. Można to spełnić, obliczając długość wejścia, zgodnie z równaniem 5⁹.

Dla wartości podanych powyżej długość wejścia wynosi od 0,01 do 0,25 cm.

Po trzecie, aby zapewnić, że prędkość i naprężenie ścinające w kierunku poprzecznym nie różnią się znacząco od wartości dla jednowymiarowego przepływu kanałowego (ΔPh/2L), stosunek h/w musi być znacznie mniejszy niż 1. Aby średnie naprężenie ścinające ściany w warunkach przepływu dwuwymiarowego wynosiło 95% naprężenia ścinającego ściany przy przepływie jednowymiarowym, h/w musi być równe 0,10, a aby naprężenie ścinające ściany w warunkach przepływu dwuwymiarowego wynosiło 97,5% naprężenia ścinającego ściany przy przepływie jednowymiarowym, h/w musi być równe 0,05. Dzięki zaprojektowanym przez nas wymiarom komory przepływowej wynoszącym 1,7 cm szerokości i 166 - 267 μm wysokości, kryteria te są spełnione.

Ciśnienie będzie się zmieniać tylko w kierunku przepływu, jeśli na wejściu nie ma bocznych gradientów ciśnienia. Można to ocenić za pomocą barwników lub cząstek na ścieżce przepływu. Ponadto, w przypadku eksperymentów ze stałym przepływem, do obwodu przepływu wkładany jest tłumik impulsów. Tłumik impulsów eliminuje większość pulsacyjności powodowanej przez pompę rolkową w obwodzie i pozwala nam w przybliżeniu przyjąć założenie stałego przepływu. Należy zauważyć, że zastosowany tłumik impulsów powinien być kompatybilny z pompą i rurkami zastosowanymi w obwodzie, aby mógł skutecznie eliminować pulsacje w przepływie wyjściowym dla określonych częstotliwości pompy rolkowej. W naszej demonstracji tłumik impulsów Masterflex L/S osiąga przepływ laminarny, gdy jest używany na linii tłocznej z dowolną pompą Masterflex serii L/S (0 - 600 obr./min) i przewodami I/P 26. W przypadku przepływu pulsacyjnego można użyć programowalnej pompy do generowania różnych przebiegów.

W przypadku przepływu pulsacyjnego można użyć programowalnej pompy do generowania różnych przebiegów.

Co więcej, obwód został zaprojektowany w taki sposób, że próbki perfuzatu można łatwo zbierać w różnych punktach czasowych bez ryzyka zanieczyszczenia ogniw lub przepływu. W naszym przykładzie stężenie NO₂- mierzono metodą chemiluminescencji za pomocą analizatora tlenku azotu Ionics/Sievers (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), jak opisano wcześniej¹⁰. Reduktorem stosowanym do analizy azotynów był jodek potasu w kwasie octowym (14,5 M kwas octowy i 0,05 M KI), który ma potencjał redukcyjny do przekształcania azotynów w NO, ale jest niewystarczający do redukcji wyższych tlenków azotu, takich jak azotany, a zatem jest stosunkowo specyficzny dla azotynów. Całkowitą ilość wytworzonego azotynu obliczono jako iloczyn wytworzonego stężenia i całkowitej objętości obwodu, po skorygowaniu o objętość utraconą podczas pobierania próbek⁶.

Następujące kroki mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wykonania eksperymentów przepływu:

1. Pożądane jest unikanie tworzenia się pęcherzyków podczas ustawiania przepływu, ponieważ pęcherzyki mogą odrywać komórki od ich powierzchni. Można tego uniknąć, zachowując ostrożność podczas umieszczania górnej części komory przepływowej na dolnej części, co najlepiej osiągnąć poprzez trzymanie obu równolegle do siebie i opuszczanie górnej części na dno jednym ruchem bez ponownej regulacji. W ten sposób małe pęcherzyki powietrza, które mogą być obecne i/lub unosić się w kanale przepływowym, zostaną przekierowane do pułapek pęcherzykowych na obu końcach aluminiowej obudowy.
2. Ważne jest, aby upewnić się, że rurka odpływowa w zbiorniku sięga do dna zbiornika. W przeciwnym razie powietrze może zostać zassane do rurki prowadzącej ze zbiornika do komory, jeśli poziom perfuzatu spadnie nieco poniżej końca rurki.
3. Badacz powinien być zaznajomiony z kierunkiem przepływu pompy, aby pompa nie pracowała przypadkowo w przeciwnym kierunku po rozpoczęciu przepływu, co skutkowałoby zasysaniem powietrza do obwodu i komory.
4. Aby uniknąć tworzenia się piany (z powodu zdenaturowanych białek zawartych w surowicy), zalecamy obniżenie rurki prowadzącej z komory do zbiornika do około jednego cala powyżej poziomu perfuzatu wewnątrz zbiornika. Jednak utrzymanie go powyżej poziomu medium przepływowego pozwala na weryfikację przepływu do zbiornika podczas eksperymentu.
5. Podczas skręcania ze sobą części komory ważne jest, aby jedną ręką mocno chwycić obudowę, a drugą obsługiwać śrubokręt elektryczny. Należy pamiętać, że ruch śrubokręta elektrycznego zostanie przekształcony w moment obrotowy, który może "rozrzucić komorę" po dokręceniu.
6. Aby uniknąć tworzenia się fal ciśnienia w obwodzie i podnoszenia ogniw z ich powierzchni, przed rozpoczęciem przepływu upewnij się, że wszystkie krany są otwarte.
7. Szczególnie w przypadku długoterminowych badań przepływu (> 48 godzin) zalecamy stosowanie twardszych i bardziej sprężystych przewodów, które należy włożyć do głowicy pompy, aby zapobiec pękaniu przewodów.
8. Możliwe jest, że rurka "migruje" wewnątrz głowicy pompy z powodu źle wyregulowanych zębów głowicy pompy. Dlatego sugerujemy zwrócenie szczególnej uwagi na to, jak rurka jest zamocowana w głowicy pompy i oznaczenie każdego końca rurki pisakiem do znakowania, tak aby można było łatwo zauważyć, czy rurka jest "wciągnięta" lub przemieszczona podczas eksperymentu.
9. Zawsze dokładnie sprawdzaj każde złącze obwodu i komory przed rozpoczęciem perfuzji, aby zapobiec wyciekowi perfuzatu podczas eksperymentu z powodu wadliwego połączenia. Jest to szczególnie ważne w przypadku króćców dopływowych i odpływowych tłumików impulsów!
10. Pamiętaj o ograniczeniu ekspozycji na światło, jeśli używasz etykiet fluorescencyjnych.

Możliwym ograniczeniem naszej studzienki przepływowej jest to, że wysokość jest ustalana na podstawie wysokości kanału obrobionego w aluminium. Ma to jednak tę zaletę, że nie trzeba sprawdzać i regulować wysokości kanału przed każdym eksperymentem, a tym samym upraszcza obliczenia naprężeń ścinających, dostosowując przepływ pompy do żądanej wartości. W zależności od celów badawczych może być pożądane zwiększenie naprężeń ścinających bez zwiększania prędkości pompy. W takim przypadku zalecamy zwiększenie lepkości perfuzatu, np. dodanie dekstranu do podłoża¹¹.

Możliwym ograniczeniem obwodu przepływu jest duża objętość użytego podłoża, co może być problematyczne przy próbie ilościowego określenia bardzo małych stężeń metabolitów komórkowych. Chociaż nie pokazano tutaj, możliwe jest znaczne zmniejszenie objętości obwodu poprzez zastosowanie mniejszego zbiornika i tłumika impulsów oraz zmniejszenie długości i średnicy przewodów.

Ponadto istnieje kilka innych dostępnych na rynku systemów, które można wykorzystać do zastosowania naprężeń ścinających płynu do komórek w hodowli. Systemy mikroprzepływowe, np. system BioFlux firmy Fluxion, umożliwiają jednoczesną analizę komórek w różnych kanałach przepływu mikroprzepływowego załadowanych roztworem do płytek studzienkowych pełniących rolę zbiorników wejściowych i wyjściowych dla tych kanałów^12,13,14. Jednak te i inne systemy mikroprzepływowe nie są kompatybilne ze standardowymi szkiełkami mikroskopowymi i nie pozwalają na odzyskanie wystarczająco dużej liczby komórek do dalszych eksperymentów, takich jak RT-PCR lub Western Blot. Co więcej, są mniej przyjazne dla użytkownika, kosztują co najmniej 40 000 USD i mogą osiągnąć łącznie ponad 100 000 USD, w zależności od wyposażenia dodatkowego.

Dwa systemy makroprzepływowe dostępne w firmie Flexcell International Corporation, Flexcell Streamer i FlexFlow, zostały z powodzeniem wykorzystane do badania komórek śródbłonka^15,16,17, ludzkich komórek^{pierścieniowych18} i fibroblastów19 w warunkach przepływu płynu. Trzeci system, dostępny za pośrednictwem GlycoTech, został wykorzystany do badania adhezji komórek nowotworowych²⁰ i adhezji leukocytów²¹ do monowarstw śródbłonka.

System Streamer pozwala na jednoczesne uruchamianie kilku suwaków w tych samych warunkach naprężenia ścinającego, ale brakuje mu okienka podglądu i - w przeciwieństwie do naszej konstrukcji - nie pozwala na wizualizację przepływających komórek w czasie rzeczywistym.

System FlexFlow ma okienko obserwacyjne, ale wymaga mikroskopu pionowego, który może nie być standardowym mikroskopem używanym w większości laboratoriów. Ponadto system FlexFlow wymaga odwrócenia szkiełka nakrywkowego pokrytego komórkami po umieszczeniu w komorze przepływowej. Wyklucza to wizualizację komórek fluorescencyjnych na nieprzezroczystej powierzchni, takiej jak szkło pokryte tytanem, co demonstrujemy w naszym badaniu. Wreszcie, specjalistyczne szkiełka nakrywkowe należy zakupić specjalnie dla systemu FlexFlow, który mieści się w wielotysięcznym przedziale cenowym, podobnie jak system Flexcell Streamer.

GlycoTech oferuje okrągłe i prostokątne komory przepływowe z równoległymi płytkami, które są znacznie tańsze, ale wykonane z odlewanego akrylu, którego nie można wygodnie sterylizować w autoklawie, jak nasza komora. Warto zauważyć, że inne komory przepływowe, które zostały opisane jako autoklawowalne, wydają się niepraktyczne, ponieważ wymagają specjalnych soczewek mikroskopowych^22,23. System GlycoTech wykorzystuje uszczelki z kauczuku silikonowego umieszczone pomiędzy górną i dolną płytą, które przy wielokrotnym użyciu będą zmieniać swoją grubość, a tym samym zmieniać wysokość komory w czasie (producent zaleca zakup nowych po każdych dziesięciu użyciach). Nasza aluminiowa komora z wbudowanymi O-ringami pozwala na całkowite przeciwstawienie górnej i dolnej płyty oraz zapewnia stałą wysokość komory między eksperymentami. Wreszcie, pompy próżniowe są niezbędne do uzyskania szczelnego uszczelnienia w wielu konstrukcjach komór przepływowych, w tym w komorach GlycoTech, które nie są konieczne w naszym projekcie.

Chociaż nie pokazano tutaj, komora przepływowa może być przechowywana pod mikroskopem podczas całego eksperymentu przepływu w celu obrazowania w czasie rzeczywistym adhezji i / lub zachowania komórek. Jeśli jest to pożądane, zalecamy użycie lamp grzewczych lub podgrzewanej podkładki pod komorą, aby utrzymać temperaturę perfuzatu na poziomie 37 °C. Ponadto pompę rolkową można zastąpić pompą strzykawkową, jeśli nie jest pożądana "recyrkulacja" komórek lub metabolitów lub badanych leków lub środków²⁴.

Możliwe jest również przepływanie inaczej znakowanych komórek przez przylegające komórki, np. fluorescencyjne płytki krwi po warstwie zbiegających się EPC (przy użyciu testu płytek krwi opisanego przez Achnecka i ^wsp.6,25) w celu oceny interakcji między komórkami pod wpływem naprężenia ścinającego płynu. Nasza komora przepływowa łączy w sobie cenne cechy innych dostępnych komór przepływowych, takich jak port do pobierania próbek perfuzatu i okienko podglądu, a jej ważną zaletą jest kompatybilność z mikroskopem odwróconym lub pionowym. Jest w pełni autoklawowalny i pozwala na wielokrotne eksperymenty na stałej wysokości komory i bez konieczności stosowania pomp próżniowych w celu uzyskania szczelnego uszczelnienia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Strzykawka	Cole-Parmer	07940-12
1-Way Stopcoks	Cole-Parmer	30600-00
30 ml Strzykawka	BD Biosciences	309650
4 -Drogowe zawory odcinające	Cole-Parmer	30600-04
stopu aluminium	N/A	6061
(4-dołkowe, prostokątne)	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
DMSO	Research Organics	2162D
DPBS (-/-)	Invitrogen	14190-144
EGM-2 Singlequots	Lonza Inc.	CC-4176
Żeński adapter Luer	Cole-Parmer	SI-45500-04
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-2MG
a href="http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3459424& pfx=EW" target="_blank">Szklana butelka (250ml) z nakrętką	Cole-Parmer	34594-24
Twarde rurki	Cole-Parmer	06508-16
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Histopaque	Sigma-Aldrich	H8889-500ML
H– chst roztwór do barwienia	Sigma-Aldrich	H6024
Hyclon FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30071.01
L-glutamina	Lonza Inc.	17-605E
Męski adapter Luer	Cole-Parmer	EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium	Cellgro	15-100-CV
a href="http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0636590& pfx=EW" target="_blank">Złączki z polipropylenu kolczastego	Cole-Parmer	06365-90
O-rings	Nie	AS568A
Tłumik impulsów	Cole-Parmer	07596-20
Pump-Drive (ekonomiczny napęd Masterflex L/S o zmiennej prędkości)	Cole-Parmer	7524-40
Głowica pompy (głowica pompy Masterflex Easy Load)	Cole-Parmer	07518-60
Slajd	Cole-Parmer	48500-00
Miękkie rurki	Cole-Parmer	96400-16
Filtr strzykawkowy	Cole-Parmer	02915-12
Sytox Pomarańczowe barwienie kwasem nukleinowym	Invitrogen	S-11368
Trypsyna EDTA	Lonza Inc.	CC-5012
Roztwór neutralizujący trypsynę	Lonza Inc.	Zobacz materiał CC-5002