Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.
Artykuł metodologiczny
Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Co roku w Stanach Zjednoczonych setki tysięcy pacjentów przechodzi operację pomostowania tętnic wieńcowych.1 Około jednej trzeciej tych pacjentów nie posiada odpowiednich autologicznych naczyń dawcy ze względu na postęp choroby lub wcześniejsze pobrania. Celem inżynierii tkankowej naczyń jest opracowanie odpowiedniego alternatywnego źródła dla tych pomostów naczyniowych. Ponadto inżynieryjnie wytworzona tkanka naczyniowa może okazać się cenna jako żywe modele naczyniowe do badania chorób układu sercowo-naczyniowego. Zbadano kilka obiecujących podejść do inżynierii naczyń krwionośnych, przy czym wiele niedawnych badań koncentruje się na opracowaniu i analizie metod opartych na komórkach.2-5 W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiego samoorganizowania komórek w trójwymiarowe pierścienie tkankowe, które mogą być wykorzystywane in vitro do modelowania tkanek naczyniowych.
Aby to osiągnąć, zawiesiny komórek mięśni gładkich wysiewa się do okrągłych, pierścieniowych dołków agarozowych. Nieprzylepne właściwości agarozy pozwalają komórkom osiaść, zagregować się i skurczyć wokół słupka znajdującego się w centrum dołka, tworząc spójny pierścień tkankowy.6,7 Pierścienie te mogą być hodowane przez kilka dni przed pobraniem do analizy mechanicznej, fizjologicznej, biochemicznej lub histologicznej. Wykazaliśmy, że te pochodzące z komórek pierścienie tkankowe osiągają wytrzymałość na rozciąganie rzędu 100-500 kPa8, co przekracza wartość raportowaną dla innych konstruktów naczyniowych inżynierii tkankowej hodowanych przez podobny czas (<30 kPa).9,10 Nasze wyniki pokazują, że w krótkim czasie można uzyskać trwałe pierścienie tkanki naczyniowej pochodzenia komórkowego, co stwarza możliwość bezpośredniej i ilościowej oceny wkładu komórek oraz macierzy pochodzenia komórkowego (CDM) w strukturę i funkcję tkanki naczyniowej.
Protokół
1. Wykonanie formy do wysiewu komórek
Zacznij od wyfrezowania kawałka poliwęglanu o grubości 1/2", aby utworzyć 15 okrągłych, pierścieniowatych otworów z centralnym słupkiem o średnicy 2 mm. Wyfrezowane kanały mają głębokość 6 mm i szerokość 3,75 mm. Oczyść i osusz formę z poliwęglanu, aby usunąć wszelkie resztki plastiku powstałe w procesie frezowania.
Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w) bazy do utwardzacza, odgazuj w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza i wlej na formę z poliwęglanu. Odgazuj ponownie, aby usunąć pozostałe pęcherzyki, a następnie utwardzaj w piekarniku w temperaturze 60°C przez 4 godziny.
Po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon z PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, umyj wodą z mydłem i wysterylizuj w autoklawie. W autoklawie wysterylizuj również 2% (w/v) roztwór agarozy rozpuszczonej w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium).
Umieść szablon z PDMS na płaskiej powierzchni i wypełnij go stopioną agarozą, pipetując ją najpierw do każdej z form centralnych słupków, a następnie w przestrzeń wokół nich. Pozostaw agarozę do zestalenia (około 15 minut), a następnie odwróć formę, aby oddzielić agarozę od PDMS. Odetnij nadmiar agarozy wokół każdego z dołków i umieść dołki agarowe w płytkach 12-dołkowych.
2. Hodowla komórek i wysiew do pierścieni
Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny) wokół zewnętrznej części formy agarozowej, nie zakrywając górnej części form. Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw je do równoważenia przez około 15 minut podczas przygotowywania komórek.
Przy 90% konfluencji poddać komórki mięśni gładkich aorty szczura (rSMCs) trypsynizacji i resuspender do stężenia 5x106 cells/ml. Do każdego z pierścieniowych dołków agarozowych nanieść pipetą 100 μL zawiesiny komórkowej, wykonując ruchy okrężne w celu równomiernego rozprowadzenia komórek w każdym dołku.
Należy upewnić się, że półki w inkubatorze są wypoziomowane, a następnie umieścić płytki w inkubatorze i pozostawić je w spokoju na 24 godziny. Następnie co dwa dni wymieniać pożywkę, odsysając ją z obszaru wokół dołka i ponownie napełniając każdy dołek, aż dołek z agarozą zostanie całkowicie zanurzony.
3. Pobieranie pierścieni tkankowych i pomiary grubości
Po zakończeniu hodowli należy zdjąć pierścień z formy agarowej, przesuwając go nad centralnym wspornikiem.
Umieść pierścień w małej szalce Petriego z solą fosforobufferowaną (PBS), wycentruj próbkę i wykonaj zdjęcie za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.
Użyj programu do analizy obrazu w celu detekcji krawędzi i zmierz grubość pierścienia w 4 pozycjach (na górze, na dole, po lewej i po prawej stronie) wzdłuż jego obwodu. Oblicz średnią wartość grubości (t) dla każdego pojedynczego pierścienia i wykorzystaj tę wartość do obliczenia pola przekroju poprzecznego (2π(t/2)2).
4. Badania mechaniczne pierścieni
Ustaw maszynę do badań rozciągania (Instron EPS 1000) w pozycji poziomej. Zamontuj przetwornik siły 1N ±1mN oraz specjalne uchwyty do cienkich drutów (wykonane poprzez zginanie drutu ze stali nierdzewnej).
Zamocuj próbkę w kształcie pierścienia w dwóch cienkich uchwytach drutowych. Rozsuń uchwyty, aż do próbki zostanie przyłożone obciążenie wstępne 5 mN. Wprowadź pole powierzchni przekroju poprzecznego (obliczone na podstawie pomiarów grubości) i zapisz długość pomiarową.
Poddaj pierścienie 8 cyklom wstępnym pomiędzy obciążeniem zerowym a naprężeniem 50 kPa z prędkością 10 mm/min. Po ósmym cyklu wstępnym rozciągnij próbki do zerwania z prędkością 10 mm/min. Zerwanie uznaje się za spadek siły o 40% między jednym pomiarem a kolejnym. Dla każdej próbki pierścienia zmierz wytrzymałość na rozciąganie (UTS) oraz odkształcenie przy zerwaniu, a następnie oblicz maksymalny moduł styczny (MTM) na podstawie uzyskanych danych.
5. Montaż pierścieni tkankowych w celu wytworzenia rurek tkankowych
Niestandardowe uchwyty na probówki są wycinane z okrągłych dysków z poliwęglanu o średnicy 5 cm z prostokątnymi wycięciami (2 cm x 3 cm). W dyskach tych należy nawiercić otwory z gwintem, aby umożliwić skręcenie dwóch uchwytów ze sobą. Uchwyty na probówki należy wysterylizować w autoklawie, a następnie przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego i umieścić w pustej płytce Petriego.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy odciąć końce rurek silikonowych o średnicy 1.9 mm pod kątem, aby uzyskać ścięte krawędzie, a następnie poddać rurki silikonowe autoklawowaniu. Podczas autoklawowania rurek należy wypełnić szalkę Petriego pożywką.
Wyjmij pierścienie z dołków w agarozie i umieść je w płytce Petriego z pożywką. W tej samej płytce Petriego umieść autoklawowane rurki silikonowe, aby zwilżyć je przed użyciem.
Używając pęsety, umieść ścięty koniec rurki silikonowej w centrum pierścienia i ostrożnie nasuń pierścień na rurkę. Powtórz tę czynność dla pożądanej liczby pierścieni. Przesuń pierścienie tak, aby stykały się ze sobą, delikatnie popychając je sukcesywnie w obu kierunkach wzdłuż rurki. Metodę tę można zastosować w przypadku pierścieni pobranych już po jednym dniu hodowli.
Po zamontowaniu pierścieni należy wyrównać rurki silikonowe w uchwytach z poliwęglanu i skręcić obie części uchwytu. Umieść uchwyt w 100 mm czalce Petriego i dodaj 55 mL pożywki. Wymieniaj pożywkę co 3 dni przez cały czas trwania hodowli.
Aby wyjąć probówki z tkanką, należy zwolnić rurki silikonowe z uchwytu poliwęglanowego, a następnie za pomocą pęsety zsunąć probówki z tkanką z rurek silikonowych do szalki Petriego wypełnionej PBS.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu komórki agregują, tworząc pierścienie tkankowe o średnicy wewnętrznej odpowiadającej średnicy odpowiedniego trzpienia formy w ciągu 24 godzin. Krawędzie pierścieni są zazwyczaj gładkie i (jeśli są hodowane na płaskiej powierzchni) mają jednolitą grubość w całym obwodzie. Pierścienie tkankowe są łatwe w obsłudze i można je usunąć z dołków w celu przeprowadzenia późniejszych analiz mechanicznych i histologicznych (patrz Gwyther et al., 20118). Morfologia pierścienia tkankowego, skład macierzy oraz właściwości mechaniczne różnią się w zależności od liczby i rodzaju wysianych komórek.
Reprezentatywne wyniki dla pierścieni tkankowych wykonanych z różnych typów komórek, w różnych warunkach wysiewu i o różnym czasie hodowli przedstawiono w Tabeli 1. Pierścienie o średnicy wewnętrznej 2 mm stworzone z 5x105 rSMC wykazywały wyższe UTS niż pierścienie o średnicy 2 mm opisane w naszej poprzedniej publikacji (wykonane z 6,6x105 rSMC).8 Podobnie jak komórki szczura, ludzkie komórki mięśni gładkich (hSMC) łatwo agregowały, tworząc pierścienie tkankowe, które po zaledwie 14 dniach hodowli zawierały dużą ilość kolagenu (dane nie zostały przedstawione). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) również agregowały i tworzyły spójne pierścienie, lecz nie posiadały one wytrzymałości mechanicznej i pękały podczas początkowych faz wstępnego cyklowania w testach jednowymiarowego rozciągania.
| n | Liczba komórek | Grubość (mm) | Czas hodowli (dni) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Odkształcenie przy zerwaniu (mm/mm) | |
| pierścienie rSMC | 6 | 660,000 | 0.94±0.12 | 14 | 97±30 | 497±91 | 0.50±0.08 |
| pierścienie rSMC | 4 | 500,000 | 0.53±0.02 | 7 | 113±8 | 189±15 | 0.88±0.05 |
| pierścienie hSMC | 3 | 750,000 | 0.51±0.05 | 14 | 160±30 | 270±20 | 0.92±0.08 |
| pierścienie hMSC | 3 | 750,000 | 0.40±0.07 | 14 | Nie dotyczy | Nie dotyczy | N/A |
Tabela 1. Tabela przedstawiająca parametry hodowli i właściwości mechaniczne pierścieni o średnicy 2 mm wytworzonych z różnych typów komórek, przy różnych stężeniach wysiewu i czasie trwania hodowli.
Rycina 1. (A) Schemat procesu tworzenia pierścienia tkankowego. (B) Specjalna forma z poliwęglanu z frezowanymi wgłębieniami pierścieniowymi. Średnice centralnych słupków wynoszą 2 mm. (C) Matryca PDMS po oddzieleniu od formy z poliwęglanu. (D) Zagregowany pierścień tkankowy hodowany w formie agarozowej ze słupkiem o średnicy 2 mm. (E) Pierścień tkankowy o średnicy 2 mm w PBS. Paski skali = 6 mm (B, C) oraz 2 mm (D, E).
Rysunek 2. Reprezentatywny wykres krzywej naprężenie-odkształcenie uzyskany z jednowymiarowej próby rozciągania.
Dyskusja
W ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie metodami inżynierii tkankowej opartymi na komórkach lub „bezruszturowymi” (ang. scaffold-less), aby rozwiązać niektóre ograniczenia podejść opartych na zastosowaniu rusztowań. Biorąc pod uwagę, że tkanki pochodzenia komórkowego tworzone są z komórek i produkowanej przez nie macierzy, charakteryzują się one naturalnie znacznie wyższą gęstością komórkową, nie zawierają materiałów egzogennych i mogą składać się w całości z ludzkich komórek i białek. Przeszczepy naczyniowe wykonane z ludzkich komórek mogą osiągnąć znaczną wytrzymałość mechaniczną w przypadku braku egzogennych rusztowań (np. ciśnienie rozrywania 3400 mmHg w porównaniu do 1600 mmHg dla ludzkich żył sapanowych)12. Chociaż naczyniowe tkanki oparte na komórkach wykazują lepszą gęstość komórkową i wytrzymałość mechaniczną, większość obecnych metod wytwarzania (takich jak „inżynieria oparta na arkuszach"3,4,12 lub „biodruk"5,13) wymaga długich okresów hodowli (> 3 miesiące) lub specjalistycznego sprzętu do konstrukcji tkanek 3D. Opisana tutaj metoda pierścienia tkanki pochodzenia komórkowego umożliwia szybką samoorganizację komórkową w celu utworzenia wytrzymałych konstrukcji tkankowych 3D w krótkim czasie i bez użycia specjalistycznego sprzętu.
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę opracowaną przez nas w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek mięśni gładkich szczura o średnicy wewnętrznej 2 mm. W niniejszym przykładzie pierścienie tkankowe hodowano przez 7 dni (a następnie przez kolejne 7 dni w celu fuzji pierścieni i tworzenia cewek). Jednak pierścienie z komórek mięśni gładkich szczura (i człowieka) o średnicy 2 mm można usunąć z dołków; są one wystarczająco spójne do manipulacji (np. przeniesienia na rurki silikonowe) już jeden dzień po wysianiu komórek. Ponadto za pomocą tej metody można tworzyć wytrzymałe pierścienie tkankowe o różnych średnicach wewnętrznych (2, 4 i 6 mm), zmieniając po prostu średnicę trzpienia oryginalnej formy poliwęglanowej.8 Niedawno zmodyfikowaliśmy również projekt formy poliwęglanowej, aby umożliwić odlew pięciu dołków do wysiewu o średnicy 2 mm w jednej wielodołkowej komorze agarozowej, co pozwala na zużycie mniejszej ilości PDMS i agarozy oraz mieści się w jednym dołku płytki 6-dołkowej (dane nie przedstawiono). Zmiany średnicy trzpienia, szerokości dołka do wysiewu, promienia krzywizny zaokrąglonego dna, liczby dołków do wysiewu lub głębokości dołków do wysiewu można wprowadzać po prostu poprzez zmianę specyfikacji w pliku CAD do obróbki CNC formy poliwęglanowej. Wreszcie, pojedyncza forma poliwęglanowa może służyć do wykonania nieograniczonej liczby szablonów z PDMS, a każdy szablon z PDMS można czyścić, autoklawować i ponownie wykorzystywać kilkadziesiąt razy.
Oprócz zmiany rozmiaru pierścieni tkankowych, wykonaliśmy pierścienie z wielu różnych typów komórek, w tym: pierwotnych komórek mięśni gładkich (SMC) szczura (Cell Applications, R354-05), pierwotnych komórek mięśni gładkich ludzkiej tętnicy wieńcowej (Lonza, CC-2583), pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych11 (dar od dr. George'a Pinsa, WPI Dept. of Biomedical Engineering), fibroblastów płuc szczura (RFL-6, ATCC CCL-192) oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (Lonza, PT-2501). Każdy z tych typów komórek agreguje i kurczy się wokół centralnych słupków, tworząc pierścienie tkankowe; przy czym organizacja komórkowa, skład macierzy pozakomórkowej (ECM) oraz właściwości mechaniczne konstruktów różnią się dla każdego typu komórek. Parametry siewania dla każdego typu komórek muszą zostać określone empirycznie na podstawie rozmiaru komórek oraz ich zdolności do agregacji. Zatem, choć ten system tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego jest niezwykle wszechstronny, protokół może wymagać niewielkich modyfikacji w celu optymalnego formowania tkanki w przypadku różnych typów komórek.
Geometria pierścienia tkankowego ułatwia załadunek i ocenę właściwości materiałowych tkanki za pomocą opisanego badania rozciągania jednowymiarowego. Istnieje również znaczący precedens wykorzystywania pierścieniowych segmentów naczyń krwionośnych do pomiaru skurczu naczyniowego i funkcji fizjologicznych. Badania wstępne wskazują, że pierścienie tkankowe pochodzenia komórkowego mogą być montowane na urządzeniu do miografii drucianej w celu pomiaru odpowiedzi farmakologicznej i generowania siły skurczu (dane nie przedstawiono). Podsumowując, możliwość szybkiego wytwarzania samorzutnie organizujących się pierścieni komórkowych do analiz histologicznych, mechanicznych, fizjologicznych i biochemicznych sugeruje istnienie potężnego nowego narzędzia, które może być przydatne w modelowaniu struktury i funkcji tkanki naczyniowej w stanie zdrowia i choroby.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy wyrażają wdzięczność Neilowi Whitehouse'owi (WPI, Higgins Machine Shop) za pomoc przy obróbce CNC. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować Adrianie Herze (WPI Computing and Communications Center) za pomoc w programowaniu w MATLAB, a także Kate Beverage i Josephowi Cotnoirowi (WPI Academic Technology Center) za pomoc w obsłudze programu Camtasia. Sophie Burke i Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) dostarczyły dodatkowe materiały wideo. Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health (R15 HL097332), UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (stypendium badawcze dla studentów dla J.Z.H.) oraz Worcester Polytechnic Institute (letnie stypendium badawcze dla studentów dla J.Z.H. oraz instytucjonalne fundusze startowe dla M.W.R.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Polydimetylosiloksan (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agaroza | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| System obrazowania cyfrowego | DVT Corporation | Model 630 | |
| Maszyna do badań jednowymiarowych | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Oprogramowanie do detekcji krawędzi | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
Bibliografia
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
Przedruki i uprawnienia
