Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana samoorganizacja komórkowa w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek do analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej

DOI:

10.3791/3366

⸱

25 listopada 2011

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich osadzone w dołkach agarozy w kształcie pierścienia agregują się i kurczą, tworząc wytrzymałe trójwymiarowe (3D) tkanki w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe w skali milimetrowej sprzyjają testom mechanicznym i służą jako elementy budulcowe do składania tkanek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdego roku, setki tysięcy pacjentów przechodzi operację pomostowania tętnic wieńcowych w Stanach Zjednoczonych. 1 Około jedna trzecia tych pacjentów nie ma odpowiednich autologicznych naczyń dawczych z powodu postępu choroby lub wcześniejszego zbioru. Celem inżynierii tkanki naczyniowej jest opracowanie odpowiedniego alternatywnego źródła dla tych pomostów. Ponadto zmodyfikowana tkanka naczyniowa może okazać się cenna jako żywe modele naczyniowe do badania chorób sercowo-naczyniowych. Zbadano kilka obiecujących podejść do inżynierii naczyń krwionośnych, a wiele ostatnich badań koncentruje się na rozwoju i analizie metod opartych na komórkach. 2-5 W niniejszym artykule przedstawiamy metodę szybkiego samoorganizowania się komórek w pierścienie tkankowe 3D, które można wykorzystać in vitro do modelowania tkanek naczyniowych.

Aby to zrobić, zawiesiny komórek mięśni gładkich są umieszczane w okrągłodennych pierścieniowych studzienkach agarozowych. Nieadhezyjne właściwości agarozy pozwalają komórkom osiadać, agregować i kurczyć się wokół słupka w środku studzienki, tworząc spójny pierścień tkankowy. 6,7 Pierścienie te mogą być hodowane przez kilka dni przed zbiorem w celu analizy mechanicznej, fizjologicznej, biochemicznej lub histologicznej. Wykazaliśmy, że te pierścienie tkankowe pochodzące z komórek dają przy 100-500 kPa ostatecznej wytrzymałości na rozciąganie8, co przekracza wartość podawaną dla innych konstruktów naczyniowych inżynierii tkankowej hodowanych przez podobny czas (<30 kPa). 9,10 Nasze wyniki pokazują, że w krótkim czasie można osiągnąć silne wytwarzanie pierścieni tkanki naczyniowej pochodzących z komórek i oferuje możliwość bezpośredniej i ilościowej oceny wkładu komórek i macierzy pochodzącej z komórek (CDM) w strukturę i funkcję tkanki naczyniowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja form do wysiewu komórek

Zacznij od zmielenia kawałka poliwęglanu o grubości 1/2", aby stworzyć 15, okrągłodennych, pierścieniowych studzienek o średnicy środkowego słupka 2 mm. Frezowane kanały mają głębokość 6 mm i szerokość 3,75 mm. Oczyść i osusz formę z poliwęglanu, aby usunąć wszelkie plastikowe zanieczyszczenia z procesu mielenia.

Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w) bazy do utwardzacza, odgazuj, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, i wlej na formę z poliwęglanu. Ponownie odgazuj, aby usunąć wszelkie pozostałe bąbelki i utwardź w piekarniku w temperaturze 60°C przez 4 godziny.

Po utwardzeniu, ostrożnie usuń szablon PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, umyj wodą z mydłem i przeprowadź autoklaw. Należy również przelać w autoklawie roztwór dwuprocentowej agarozy (w/v) rozpuszczony w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco.

Umieść szablon PDMS na równej powierzchni i wypełnij go stopioną agarozą, najpierw pipetując agarozę do każdej z form środkowego słupka, a następnie pipetując do przestrzeni wokół niej. Pozwól agarozie zestalić się (około 15 minut), a następnie odwróć formę, aby uwolnić agarozę z PDMS. Wytnij nadmiar agarozy z okolic każdego z dołków i umieść dołki agarozy na 12-dołkowych płytkach.

2. Hodowla komórkowa i siew pierścieniowy

Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny) wokół zewnętrznej strony formy agarozowej, nie zakrywając górnej części form. Umieścić płytki w inkubatorze i pozostawić je do równowagi przez około 15 minut podczas przygotowywania komórek.

Przy 90% zbieżności, trypsynizuj komórki mięśni gładkich aorty szczura (rSMC) i ponownie zawieszaj w stężeniu 5x106 komórek/ml. Odpipetuj 100 μL zawiesiny komórkowej do każdej z pierścieniowych studzienek agarozowych, używając okrężnych ruchów, aby nałożyć komórki do każdej studzienki.

Upewnij się, że półki inkubatora są równe, a następnie umieść płytki w inkubatorze i pozwól im siedzieć bez przeszkód przez 24 godziny. Następnie wymieniaj pożywkę co dwa dni, zasysając pożywkę z okolic studzienki i ponownie napełniając każdą studzienkę, aż studzienka agarozowa zostanie całkowicie zanurzona.

3. Pobieranie pierścieni tkankowych i pomiary grubości

Na zakończenie hodowli usuń pierścień z formy agarozowej, przesuwając go przez górną część środkowego słupka.

Umieść pierścień na małej szalce Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), wyśrodkuj próbkę i uzyskaj obraz za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.

Użyj programu do analizy obrazu do wykrywania krawędzi i zmierz grubość pierścienia w 4 pozycjach (góra, dół, lewo i prawo) na całym jego obwodzie. Obliczyć średnią wartość grubości (t) dla każdego pojedynczego pierścienia i użyć tej wartości do obliczenia pola przekroju poprzecznego (2π(t/2)2).

4. Mechaniczne testowanie pierścieni

Ustaw maszynę do prób rozciągania (Instron EPS 1000) w pozycji poziomej. Zamocuj ogniwo obciążnikowe 1N ±1mN i niestandardowe uchwyty z cienkiego drutu (utworzone przez zginanie drutu ze stali nierdzewnej).

Zamontuj próbkę pierścienia na dwóch uchwytach z cienkiego drutu. Rozsuń uchwyty, aż do przyłożenia do próbki obciążenia tarą 5 mN. Wprowadź pole przekroju poprzecznego (obliczone na podstawie pomiarów grubości) i zapisz długość miernika.

Wstępnie przekręć pierścienie 8 razy między obciążeniem tary a naprężeniem 50 kPa z prędkością 10 mm/min. Po ósmym cyklu wstępnym pociągnąć do uszkodzenia z prędkością 10 mm/min. Awaria jest odnotowywana jako zmniejszenie siły o 40% z jednego pomiaru na drugi. Dla każdej próbki pierścienia zmierz ostateczne naprężenie rozciągające (UTS) i odkształcenie przy zniszczeniu, a następnie oblicz maksymalny moduł styczny (MTM) na podstawie uzyskanych danych.

5. Zespół pierścienia tkankowego do produkcji tubek tkankowych

Niestandardowe uchwyty na rurki są wykonane z okrągłych 5 cm krążków z poliwęglanu z prostokątnymi wycięciami (2 cm x 3 cm). Wywierć gwintowane otwory w tych dyskach, aby umożliwić skręcenie ze sobą dwóch uchwytów. Autoklaw w autoklawie niestandardowych uchwytów probówek, a następnie przenieś do szafki bezpieczeństwa biologicznego i umieść na pustej szalce Petriego.

Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć końcówki silikonowych rurek o średnicy 1,9 mm pod kątem, aby uzyskać ścięte krawędzie, a następnie autoklawuj silikonowe rurki. Podczas autoklawowania probówek napełnij szalkę Petriego pożywką.

Usuń pierścienie z dołków agarozowych i umieść je na szalce Petriego z mediami. Umieść autoklawowane rurki silikonowe na tej samej szalce Petriego, aby zwilżyć je przed użyciem.

Użyj kleszczyków, aby umieścić skośny koniec silikonowej rurki w środku pierścienia i delikatnie wsuń pierścień na silikonową rurkę. Powtórz z żądaną liczbą pierścieni. Wsuń pierścienie w kontakt ze sobą, delikatnie popychając je kolejno w obu kierunkach wzdłuż rurki. Ta metoda może być stosowana do pierścieni zbieranych już po jednym dniu w kulturze.

Po zamontowaniu pierścieni, wyrównaj silikonowe rurki w uchwytach z poliwęglanu i skręć ze sobą dwie części uchwytu. Umieścić uchwyt na szalce Petriego o średnicy 100 mm i dodać 55 ml pożywki. Wymieniaj się pożywką co 3 dni przez cały czas trwania hodowli.

Aby usunąć rurki z tkanką, zwolnij rurki silikonowe z uchwytu z poliwęglanu i użyj kleszczyków, aby zsunąć rurki z rurki silikonowej na szalkę Petriego wypełnioną PBS.

6. Reprezentatywne wyniki:

Gdy protokół jest wykonywany poprawnie, komórki łączą się, tworząc pierścienie tkankowe o wewnętrznej średnicy równej średnicy odpowiedniego słupka formy w ciągu 24 godzin. Krawędzie pierścieni są zwykle gładkie i (jeśli są hodowane na równej powierzchni) mają jednolitą grubość na całym obwodzie. Pierścienie tkankowe są łatwe w obsłudze i można je wyjąć z dołków w celu późniejszej analizy mechanicznej i histologicznej (patrz Gwyther i in., 20118). Morfologia pierścienia tkankowego, skład macierzy i właściwości mechaniczne różnią się w zależności od liczby i rodzaju wysiewanych komórek.

Reprezentatywne wyniki z pierścieni tkankowych wykonanych z różnych typów komórek, warunków wysiewu i długości hodowli są pokazane w Tabeli 1. Dwa pierścienie ID mm wykonane z 5x105 rSMC wykazywały wyższy UTS niż pierścienie utworzone z naszych wcześniej opublikowanych pierścieni 2 mm (wykonane z 6,6x105 rSMC). 8 Podobnie jak komórki szczurów, ludzkie komórki mięśni gładkich (hSMC) łatwo agregowały się, tworząc pierścienie tkankowe, które zawierały dużą ilość kolagenu już po 14 dniach hodowli (dane nie pokazane). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) również agregowały i tworzyły spójne pierścienie, ale brakowało im wytrzymałości mechanicznej i pękały podczas początkowych faz recyklingu jednoosiowej próby rozciągania.

  n Numer komórki Grubość (mm) Czas trwania kultury (dni) UTS (kPa) MTM (kPa) Odkształcenie niszczące (mm / mm) Pierścienie rSMC 6 660 000 osób 0,94±0,12 14 Numer katalogowy, nr kat. 97±30 Numer katalogowy: 497±91 0,50±0,08 Pierścienie rSMC 4 500 000 osób 0,53±0,02 7 Numer katalogowy 113±8 189±15 0,88±0,05 Pierścienie hSMC 3 750 000 osób 0,51±0,05 14 Numer katalogowy: 160±30 270±20 0,92±0,08 Pierścienie hMSC 3 750 000 osób 0,40±0,07 14 N/a N/a N/a

Tabela 1. Tabela przedstawiająca parametry hodowli i właściwości mechaniczne pierścieni 2 mm wygenerowanych z różnych typów komórek, stężeń wysiewu i czasu trwania hodowli.

figure-protocol-1
Rysunek 1. (A) Schemat procesu generowania pierścieni tkankowych. (B) Niestandardowa forma z poliwęglanu z frezowanymi studzienkami pierścieniowymi. Średnica środkowego słupka wynosi 2 mm. (C) Szablon PDMS po oderwaniu go od formy poliwęglanowej. (D) Zagregowany pierścień tkankowy hodowany w formie agarozowej z wkładką 2 mm. (E) Pierścień tkankowy o średnicy dwóch mm w PBS. Podziałka = 6 mm (B, C) i 2 mm (D, E).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Reprezentatywny wykres krzywej naprężenie-odkształcenie otrzymanej z jednoosiowej próby rozciągania.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio wzrosło zainteresowanie metodami inżynierii tkankowej opartymi na komórkach lub "bez rusztowań", aby rozwiązać niektóre ograniczenia podejść opartych na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Biorąc pod uwagę, że tkanki pochodzenia komórkowego są tworzone z komórek i wytwarzanej przez nie macierzy, z natury zawierają znacznie większą gęstość komórek, nie zawierają materiałów egzogennych i mogą być wykonane w całości z ludzkich komórek i białek. Przeszczepy naczyniowe wykonane z komórek ludzkich mogą osiągnąć znaczną wytrzymałość mechaniczną przy braku rusztowań egzogennych (np. ciśnienie rozrywające 3400 mmHg w porównaniu do 1600 mmHg w przypadku ludzkich żył odpiszczelowych)12. Chociaż tkanki naczyniowe oparte na komórkach wykazują zwiększoną gęstość komórek i wytrzymałość mechaniczną, większość obecnych metod wytwarzania (takich jak "inżynieria oparta na arkuszach"3,4,12 lub "biodrukowanie"5,13) wymaga długich okresów hodowli (> 3 miesiące) lub specjalistycznego sprzętu do budowy tkanek 3D. Opisana tutaj metoda pierścienia tkankowego pochodzenia komórkowego umożliwia szybką samoorganizację komórkową w celu utworzenia solidnych konstruktów tkankowych 3D w krótkim czasie i bez użycia specjalistycznego sprzętu.

Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę, którą opracowaliśmy w celu stworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek mięśni gładkich mięśni gładkich szczura o średnicy wewnętrznej 2 mm. W tym przykładzie pierścienie tkankowe hodowano przez 7 dni (a następnie hodowano przez dodatkowe 7 dni w celu zespolenia pierścieni i utworzenia rurki). Jednak 2-milimetrowe pierścienie komórek mięśni gładkich szczurów (i ludzi) można usunąć ze studzienek i są one wystarczająco spoiste, aby można je było przenosić (np. przenosić na rurki silikonowe) już jednego dnia po wysianiu komórek. Ponadto za pomocą tej metody można tworzyć wytrzymałe pierścienie tkankowe o różnych średnicach wewnętrznych (2, 4 i 6 mm), po prostu zmieniając średnicę słupka oryginalnej formy poliwęglanowej. 8 Niedawno zmodyfikowaliśmy również konstrukcję formy z poliwęglanu, aby umożliwić odlewanie pięciu studzienek wysiewających o średnicy 2 mm w jednej wielodołkowej komorze agarozowej, która zużywa mniej PDMS i agarozy i mieści się w jednym dołku na płytce 6-dołkowej (dane nie pokazane). Zmiany średnicy słupka, szerokości dołka wysiewającego, promienia krzywizny zaokrąglonego dna, liczby dołków wysiewających lub głębokości dołków wysiewających można modyfikować po prostu poprzez zmianę specyfikacji w pliku CAD do obróbki CNC formy poliwęglanowej. Wreszcie, pojedyncza forma z poliwęglanu może być użyta do wytworzenia nieograniczonej liczby szablonów PDMS, a każdy szablon PDMS może być czyszczony, autoklawowany i ponownie używany dziesiątki razy.

Oprócz zmiany rozmiaru pierścieni tkankowych, wykonaliśmy pierścienie z wielu różnych typów komórek, w tym: pierwotnych SMC szczurów (Cell Applications, R354-05), pierwotnych SMC ludzkich tętnic wieńcowych (Lonza, CC-2583), pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych11 (hojny dar dr George'a Pinsa, Wydziału Inżynierii Biomedycznej WPI), fibroblastów płuc szczurów (RFL-6, ATCC CCL-192) i mezenchymalnych komórek macierzystych (Lonza, PT-2501). Każdy z tych typów komórek agreguje się i kurczy wokół środkowych słupków, tworząc pierścienie tkankowe; chociaż organizacja komórkowa, skład ECM i właściwości mechaniczne konstruktów różnią się dla każdego typu komórki. Parametry rozsiewania dla każdego typu komórek muszą być empirycznie określone na podstawie wielkości komórek i ich zdolności do agregacji. Dlatego, chociaż ten system tworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek jest niezwykle wszechstronny, protokół może wymagać niewielkich korekt w celu optymalnego tworzenia tkanek z różnymi typami komórek.

Geometria pierścienia tkankowego ułatwia ładowanie i ocenę właściwości materiału tkankowego za pomocą jednoosiowej próby rozciągania, zgodnie z opisem. Istnieje również istotny precedens stosowania segmentów pierścienia naczyń krwionośnych do pomiaru skurczu naczyń krwionośnych i funkcji fizjologicznych. Wstępne badania wskazują, że pierścienie tkankowe pochodzące z komórek mogą być zamontowane na drucianym urządzeniu miograficznym w celu pomiaru reakcji farmakologicznej i generowania siły skurczu (dane nie pokazane). Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do szybkiego wytwarzania samoorganizujących się pierścieni komórkowych do analizy histologicznej, mechanicznej, fizjologicznej i biochemicznej sugeruje nowe, potężne narzędzie, które może być przydatne do modelowania struktury i funkcji tkanki naczyniowej w zdrowiu i chorobie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Neilowi Whitehouse'owi (WPI, Higgins Machine Shop) za pomoc w obróbce CNC. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować Adrianie Herze (WPI Computing and Communications Center) za pomoc w programowaniu MATLAB, a także Kate Beverage i Josephowi Cotnoirowi (WPI Academic Technology Center) za pomoc przy Camtasia. Sophie Burke i Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) dostarczyły dodatkowy materiał wideo. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (R15 HL097332), UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (stypendium badawcze dla J.Z.H.) i Worcester Polytechnic Institute (letnie stypendium badawcze dla J.Z.H. oraz fundusze na rozpoczęcie działalności instytucjonalnej dla M.W.R.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
AgarozaLonza Inc.50000
DMEMMediatech, Inc.15-017-CV
Surowica bydlęca płodu (FBS)PAA LaboratoriesA05-201
Penicylina/StreptomycynaMediatech, Inc.30-002-CI
Cyfrowy system obrazowaniaDVT CorporationModel 630
Jednoosiowa maszyna wytrzymałościowaInstronElectroPuls E1000
Oprogramowanie do wykrywania krawędziDVTCorporation Framework 2.4.6

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
  2. Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
  3. Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
  4. L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
  5. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
  6. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
  7. Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
  8. Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
  9. Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
  10. Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
  11. Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
  12. Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
  13. Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie pier cieni tkankowychkom rki mi ni g adkichdo ki agarozoweanaliza mechanicznabadanie wytrzyma o ci na rozci ganiemacierz pochodzenia kom rkowegoin ynieria tkankowa naczyszablon PDMSforma agarozowa

Powiązane artykuły