Method Article

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

DOI:

10.3791/3377

⸱

February 19th, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Department of Anatomy, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Research Centre of Heart, Brain, Hormone and Healthy Aging, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 3State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film demonstruje trzy rodzaje analiz morfometrycznych siatkówki, które obejmują pomiar grubości wewnętrznej warstwy jądrowej, ilościowe określenie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGC) i pomiar rozmiarów RGC. Technika ta może stanowić prostą, ale naukową platformę do analiz morfometrycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki zostały wykorzystane do badania chorób siatkówki. Na przykład komórki neuronalne zostały znacznie utracone w warstwie komórek zwojowych siatkówki (RGCL) w modelach szczurzych z ekscytotoksycznością wywołaną N-metylo-D-asparaginianem (NMDA)1, uszkodzeniem niedokrwienia siatkówki i reperfuzji2 i jaskrą3. Zmniejszenie grubości INL i wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL) zostało odwrócone za pomocą leczenia cytykoliną w oczach szczurów poddanych ekscytotoksyczności glutaminianu za pośrednictwem kwasu kainowego4. Zmianę gęstości RGC i wielkości somy obserwowano przy różnych terapiach farmakologicznych w oczach z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym3,5,6. W związku z tym posiadanie obiektywnych metod analizy morfometrii siatkówki może mieć ogromne znaczenie w ocenie patologii siatkówki i skuteczności strategii terapeutycznych.

Struktura siatkówki jest wielowarstwowa, a w siatkówce znajduje się kilka różnych rodzajów neuronów. Parametry morfometryczne siatkówki, takie jak liczba komórek, wielkość komórek i grubość różnych warstw, są bardziej złożone niż system hodowli komórkowych. Na wczesnym etapie parametry te można wykryć za pomocą innego dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania. Wartości są zwykle wartościami względnymi, a zmiana na dokładną wartość może wymagać dalszych dokładnych obliczeń. Ponadto śledzenie wielkości i morfologii komórek może nie być wystarczająco dokładne i czułe do analizy statystycznej, zwłaszcza w modelu jaskry przewlekłej. Pomiary użyte w tym protokole zapewniły bardziej precyzyjny i łatwy sposób. Bezwzględna długość linii i rozmiar komórki mogą być zgłaszane bezpośrednio i łatwe do skopiowania do innych plików. Na przykład, prześledziliśmy margines najbardziej wewnętrznych i zewnętrznych jąder w INL i utworzyliśmy linię, a następnie za pomocą oprogramowania narysowaliśmy kąt 90 stopni, aby zmierzyć grubość. O ile bez pomocy oprogramowania linia może być ukośna, a zmiana grubości siatkówki może nie być powtarzalna wśród poszczególnych obserwatorów. Ponadto można również określić ilościowo liczbę i gęstość RGC. Protokół ten skutecznie zmniejsza zmienność ilościowych cech siatkówki, zwiększa czułość w wykrywaniu minimalnych zmian.

Ten film pokaże trzy rodzaje analiz morfometrycznych przekrojów siatkówki. Obejmują one pomiar grubości INL, ilościowe określenie liczby RGC i pomiar rozmiarów RGC w wartości bezwzględnej. Te trzy analizy są przeprowadzane we współpracy z Stereo Investigator (MBF Bioscience — MicroBrightField, Inc.). Technika ta może stanowić prostą, ale naukową platformę do analiz morfometrycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Narzędzia

Mikroskop, Nikon

Stereo Badacz, MBF Bioscience – MicroBrightField, Inc.

2. Przygotowanie

  1. Przed przystąpieniem do jakiejkolwiek analizy morfometrycznej każda próbka siatkówki jest cięta na kawałki o grubości 4 mikronów i poddawana barwieniu H&E.
  2. Sekcja siatkówki jest podzielona na 4 regiony – górny obszar obwodowy, górny obszar centralny, dolny obszar obwodowy i dolny obszar centralny.
  3. Po zdefiniowaniu obszarów uzyskuje się obraz każdego obszaru w powiększeniach 10x40 pod mikroskopem o jasnej wiązce firmy Nikon.
  4. Teraz jesteśmy gotowi do analizy morfometrii siatkówki.

3. Pomiar grubości INL

  1. Zmierzono cztery pomiary grubości INL w każdym regionie. Cztery linie zostaną narysowane prostopadle od linii bazowej konturu do zewnętrznej granicy INL.
  2. Otwórz oprogramowanie o nazwie Stereo Investigator i wybierz obiektyw 40x z głównego paska narzędzi.
  3. Wybierz "Otwórz obraz" w zakładce "Plik". Wybierz obraz żądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować.
  4. Wybierz typ linii konturu z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi i naciśnij przycisk "Automatyczne przesuwanie".
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz "Proste śledzenie kliknięć".
  6. Narysuj linię konturu wzdłuż wewnętrznej granicy INL.
  7. Po zakończeniu rysowania kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz "Zakończ otwarty kontur".
  8. Wybierz znacznik na pasku narzędzi znacznika i dodaj znaczniki w punktach skrzyżowania.
  9. Po dodaniu wszystkich znaczników usuń zaznaczenie ikony znacznika na pasku narzędzi znacznika.
  10. Umieść kursor na środku jednego ze znaczników.

figure-protocol-1

  1. Wybierz "Szybki kąt pomiaru" w zakładce "Narzędzia".

figure-protocol-2

  1. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i odznacz opcję "Ciągłe".
  2. Zmierz kąt, klikając najpierw środek znacznika, który przylega do znacznika wybranego jako koniec segmentu linii.

figure-protocol-3

  1. Następnie przesuń mysz na środek odpowiedniego znacznika i kliknij ponownie.
  2. Przedłuż linię gumki do zewnętrznej krawędzi INL.
  3. Dostosuj kąt, aż zostanie osiągnięte 90°.

figure-protocol-4

  1. Kliknij lewym przyciskiem myszy w żądanej pozycji. Zaraz po kliknięciu pojawi się okno dialogowe pokazujące pomiar kąta.
  2. Naciśnij "Enter", trzymając mysz nieruchomo.

figure-protocol-5

  1. Kliknij lewym przyciskiem myszy okno obrysowywania, aby narysować linię od jednego końca do nowego zaznaczonego końca.
  2. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz "Zakończ otwarty kontur".

figure-protocol-6

  1. Narysuj pozostałe linie w różnych miejscach dokładnie w taki sam sposób, jak opisano wcześniej.
  2. Po narysowaniu wszystkich linii wybierz tryb edycji i odpowiednio zmień nazwy 4 segmentów linii.
  3. Cztery pomiary można uzyskać, naciskając przycisk "Pomiar konturu".
  4. Wybierz te 4 pomiary i wklej je do arkusza kalkulacyjnego, klikając "Kopiuj do schowka".
  5. Wybierz "Zapisz jako" w zakładce "Plik". Dane śledzenia można zapisać jako plik danych.

4. Kwantyfikacja liczby RGC

  1. Wybierz "Otwórz obraz" w zakładce "Plik". Wybierz obraz żądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować.
  2. Wybierz typ linii konturu z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi.
  3. Narysuj linię konturową wzdłuż granicy warstwy włókien nerwowych (NFL).
  4. Zakończ śledzenie za pomocą opcji "Zakończ otwarty kontur".
  5. Na każdym końcu dodaj jeden znacznik na końcu linii, a drugi w miejscu w pobliżu końcówki.
  6. Usuń zaznaczenie ikony znacznika na pasku narzędzi znacznika.
  7. Umieść kursor na środku znaczników na końcówce.
  8. Wybierz "Szybki kąt pomiaru" w zakładce "Narzędzia".
  9. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i odznacz opcję "Ciągłe".
  10. Wyreguluj linie gumki i zmierz kąt 90°.
  11. Naciśnij "Enter" po wyświetleniu okna dialogowego.
  12. Kliknij lewym przyciskiem myszy okno śledzenia, aby nowa linia mogła zostać prostopadło przedłużona od końcówki.
  13. Narysuj kolejną nową linię dokładnie w ten sam sposób na innym końcu.
  14. Tworzone są dwie granice, w obrębie których zliczana jest liczba RGC.
  15. Wybierz jedną granicę, ponieważ linia wykluczenia, której dotyka komórka, nie jest zliczana.
  16. Wybierz jeden typ znacznika i dołącz go do każdej aktywnej komórki.
  17. Wybierz inny typ znacznika dla martwych komórek.
  18. Liczba każdego rodzaju umieszczonych znaczników zostanie wyświetlona wraz z ikoną znacznika odpowiednio na pasku narzędzi znacznika.
  19. Wybierz tryb edycji i wybierz linię bazową konturu. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i zmień nazwę linii.
  20. Długość linii bazowej konturu można uzyskać, naciskając przycisk "Pomiar konturu".
  21. Liczba komórek może być następnie wyrażona w mm długości.
  22. Wybierz "Zapisz jako" w zakładce "Plik". Dane trasowania i znacznika można zapisać jako plik danych.

5. Pomiar rozmiaru komórki RGC

  1. Wybierz "Otwórz obraz" w zakładce "Plik". Wybierz obraz żądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować.
  2. Powiększ aktywną komórkę i wybierz typ linii konturu z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi.
  3. Narysuj linię konturu wzdłuż obwodu komórki.
  4. Mniej więcej na końcu kliknij prawym przyciskiem myszy okno śledzenia i wybierz "Zakończ zamykanie konturu".
  5. Obszar komórki zostanie wyświetlony pod elementem Obszar w oknie dialogowym Pomiar konturu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Jak uzyskać dokładniejszy pomiar grubości?

Możesz powiększyć obraz, klikając przycisk "Powiększ" i klikając lewym przyciskiem myszy w oknie śledzenia. Obramowanie INL jest wyraźnie widoczne. Jeśli końcówka linii nie znajduje się na zewnętrznej granicy INL, możemy dostosować linię w trybie edycji. Po wybraniu odpowiedniej linii kliknij prawym przyciskiem myszy okno śledzenia i wybierz "Wstaw punkt w wybranym konturze". Punkt może być dodany na zewnętrznej granicy, podczas gdy dodany punkt powi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace nad badaniami oczu w tym laboratorium są wspierane przez American Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund i HKU Small Project Fund (20097176185).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stereofoniczny
Olympus CorporationBX51
mikroskop mikroskopowy MicroBright Field Investigator

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
  2. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
  3. Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
  4. Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
  5. Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
  6. Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

null

Tags

Retinal MorphometryInner Nuclear Layer ThicknessRetinal Ganglion Cell CountRetinal Ganglion Cell SizeStereo Investigator SoftwareImage Analysis ProtocolBrightfield MicroscopyH E StainingRetinal Layer TracingCell Morphometry Measurement

Related Articles