Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Podsumowanie

Niniejszy film prezentuje trzy rodzaje analiz morfometrycznych siatkówki, obejmujące pomiar grubości wewnętrznej warstwy jądrowej, określenie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz pomiar wielkości RGCs. Technika ta może stanowić prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Streszczenie

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki są wykorzystywane w badaniu chorób siatkówki. Na przykład stwierdzono znaczną utratę komórek neuronalnych w warstwie komórek zwojowych siatkówki (RGCL) w modelach szczurzych z ekscytotoksycznością indukowaną N-metylo-D-asparaginianem (NMDA)¹, urazami niedokrwienno-reperfozyjnymi siatkówki² oraz jaskrą³. Zmniejszenie grubości warstwy wewnętrznej splotowej (INL) i warstwy splotowej wewnętrznej (IPL) zostało odwrócone dzięki leczeniu cytykoliną w oczach szczurów poddanych ekscytotoksyczności glutaminianowej wywołanej kwasem kianowym⁴. Zmiany gęstości RGC oraz rozmiarów somy zaobserwowano przy różnych terapiach farmakologicznych w oczach z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym^3,5,6. Zatem posiadanie obiektywnych metod analizy morfometrii siatkówki może mieć duże znaczenie w ocenie patologii siatkówki oraz skuteczności strategii terapeutycznych.

Struktura siatkówki jest wielowarstwowa i występuje w niej kilka różnych rodzajów neuronów. Parametry morfometryczne siatkówki, takie jak liczba komórek, ich wielkość i grubość poszczególnych warstw, są bardziej złożone niż w systemach hodowli komórkowych. Wcześniej parametry te można było wykrywać przy użyciu innych komercyjnych programów do obrazowania. Otrzymywane wartości miały zazwyczaj charakter względny, a ich zamiana na wartości bezwzględne wymagała dalszych precyzyjnych obliczeń. Ponadto obrysowywanie wielkości i morfologii komórek mogło nie być wystarczająco dokładne i czułe dla analizy statystycznej, szczególnie w modelu przewlekłego jaskry. Pomiary zastosowane w niniejszym protokole zapewniają bardziej precyzyjną i prostą metodę. Bezwzględna długość linii oraz wielkość komórek mogą być raportowane bezpośrednio i łatwo kopiowane do innych plików. Na przykład obrysowaliśmy krawędzie najbardziej wewnętrznych i zewnętrznych jąder w warstwie INL, tworząc linię, a następnie użyliśmy oprogramowania do wykreślenia kąta 90 stopni w celu pomiaru grubości. Bez pomocy oprogramowania linia mogłaby być skośna, a zmiany grubości siatkówki mogłyby nie być powtarzalne między poszczególnymi obserwatorami. Dodatkowo można określić liczbę i gęstość RGCs. Niniejszy protokół skutecznie zmniejsza zmienność w ilościowym określaniu cech siatkówki oraz zwiększa czułość w wykrywaniu minimalnych zmian.

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano trzy rodzaje analiz morfometrycznych przekrojów siatkówki. Obejmują one pomiar grubości INL, kwantyfikację liczby RGC oraz pomiar bezwzględnej wielkości RGC. Te trzy analizy są przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator (MBF Bioscience — MicroBrightField, Inc.). Technika ta stanowi prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Protokół

1. Narzędzia

Mikroskop, Nikon

Stereo Investigator, MBF Bioscience – MicroBrightField, Inc.

2. Przygotowanie

1. Przed przystąpieniem do jakiejkolwiek analizy morfometrycznej każda próbka siatkówki jest cięta na skrawki o grubości 4 µm i poddawana barwieniu H&E.
2. Skrawki siatkówki dzieli się na 4 obszary: górny obszar obwodowy, górny obszar centralny, dolny obszar obwodowy oraz dolny obszar centralny.
3. Po zdefiniowaniu obszarów wykonuje się obraz każdego z nich przy powiększeniu 10x40 za pomocą mikroskopu światła przechodzącego marki Nikon.
4. W tym momencie można przystąpić do analizy morfometrii siatkówki.

3. Pomiar grubości INL

1. W każdym regionie wykonano cztery pomiary grubości INL. Należy narysować cztery linie prostopadłe od linii bazowej konturu do zewnętrznej granicy INL.
2. Uruchom oprogramowanie Stereo Investigator i wybierz obiektyw 40x z głównego paska narzędzi.
3. W karcie „File” wybierz opcję „Image Open”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz poddać analizie.
4. Wybierz typ linii konturowej z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi i naciśnij przycisk „Auto Move”.
5. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i wybierz opcję „Simple Click Tracing”.
6. Narysuj linię konturową wzdłuż wewnętrznej granicy INL.
7. Po zakończeniu rysowania kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i wybierz „End Open Contour”.
8. Wybierz marker na pasku narzędzi markerów i dodaj markery w punktach styku.
9. Po dodaniu wszystkich markerów odznacz ikonę markera na pasku narzędzi markerów.
10. Ustaw kursor w centrum jednego z markerów.

11. Wybierz opcję „Quick Measure Angle” w zakładce „Tools”.

12. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i odznacz opcję „Continuous”.
13. Zmierz kąt, klikając najpierw w centrum markera, który znajduje się obok markera wybranego jako koniec odcinka linii.

14. Następnie przenieś kursor na środek odpowiedniego markera i kliknij ponownie.
15. Przeciągnij linię pomocniczą do zewnętrznej granicy INL.
16. Dostosuj kąt, aż zostanie osiągnięta wartość 90°.

17. Kliknij lewym przyciskiem myszy w żądanym położeniu. Bezpośrednio po kliknięciu pojawi się okno dialogowe z pomiarem kąta.
18. Naciśnij klawisz „Enter”, trzymając mysz w bezruchu.

19. Kliknij lewym przyciskiem myszy w oknie śledzenia, aby narysować linię od jednego końca do nowo wybranego końca.
20. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz opcję „End Open Contour”.

21. Narysuj pozostałe linie w różnych pozycjach w dokładnie taki sam sposób, jak opisano wcześniej.
22. Po narysowaniu wszystkich linii wybierz tryb edycji (Editing mode) i odpowiednio zmień nazwy 4 segmentów linii.
23. Cztery pomiary można uzyskać, naciskając przycisk „Contour Measurement”.
24. Wybierz te 4 pomiary i wklej je do arkusza kalkulacyjnego, klikając „Copy to Clipboard”.
25. Wybierz „Save As” w zakładce „File”. Dane obrysowania można zapisać jako plik danych.

4. Ilościowe określanie liczby RGC

1. Wybierz opcję „Image Open” w karcie „File”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować.
2. Wybierz typ linii konturowej z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi.
3. Narysuj linię konturową wzdłuż krawędzi warstwy włókien nerwowych (NFL).
4. Zakończ obrysowanie za pomocą opcji „End Open Contour”.
5. Na każdym końcu dodaj jeden marker na końcówce linii i drugi w pozycji blisko końcówki.
6. Odznacz ikonę markera na pasku narzędzi markerów.
7. Ustaw kursor w centrum markerów znajdujących się na końcówce.
8. Wybierz „Quick Measure Angle” w karcie „Tools”.
9. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i odznacz opcję „Continuous”.
10. Dostosuj linie pomocnicze i zmierz kąt 90°.
11. Po wyświetleniu okna dialogowego naciśnij klawisz „Enter”.
12. Kliknij lewym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania, aby nowa linia mogła zostać przedłużona prostopadle od końcówki.
13. Narysuj kolejną nową linię w dokładnie ten sam sposób na drugim końcu.
14. Powstają dwie granice, w obrębie których zlicza się liczbę RGC.
15. Wybierz jedną granicę jako linię wykluczającą, przy której komórki stykające się z nią nie są liczone.
16. Wybierz jeden typ markera i przypisz go do każdej żywej komórki.
17. Wybierz inny typ markera dla komórek martwych.
18. Liczba umieszczonych markerów każdego typu zostanie wyświetlona odpowiednio obok ikony markera na pasku narzędzi markerów.
19. Wybierz tryb edycji i zaznacz linię bazową konturu. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i zmień nazwę linii.
20. Długość linii bazowej konturu można uzyskać, naciskając przycisk „Contour Measurement”.
21. Liczba komórek może następnie zostać wyrażona na mm długości.
22. Wybierz „Save As” w karcie „File”. Obrys i dane markerów można zapisać jako plik danych.

5. Pomiar rozmiaru komórki RGC

1. Wybierz „Image Open” w karcie „File”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować.
2. Przybliż obraz żywej komórki i wybierz typ linii konturu z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi.
3. Narysuj linię konturu wzdłuż obwodu komórki.
4. Pod koniec rysowania kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz „End close contour”.
5. Pole powierzchni komórki zostanie wyświetlone w polu Area w dialogowym oknie Contour Measurement.

Dyskusja

1. Jak uzyskać dokładniejszy pomiar grubości?

Obraz można powiększyć, klikając przycisk „Zoom in”, a następnie klikając lewym przyciskiem myszy w oknie kreślenia. Granica INL jest wyraźnie widoczna. Jeśli koniec linii nie znajduje się na zewnętrznej granicy INL, można ją skorygować w trybie edycji (Editing mode). Po wybraniu odpowiedniej linii należy kliknąć prawym przyciskiem myszy w oknie kreślenia i wybrać opcję „Insert Point in Selected Contour”. Punkt może zostać dodany na zewnętrznej grani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stereowy investigator		Mikroskopia w jasnym polu
Mikroskop		Olympus Corporation	BX51