Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Podsumowanie

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Streszczenie

Elektroporacja jest wydajną metodą dostarczania DNA oraz innych naładowanych makrocząsteczek do tkanek w precyzyjnych punktach czasowych i lokalizacjach. Na przykład elektroporację z dużym sukcesem wykorzystywano do badania rozwoju układu nerwowego i siatkówki u Xenopus, kurczaka oraz myszy ^1-10. Należy jednak zauważyć, że we wszystkich tych badaniach badacze nie kierowali się na tkanki miękkie. Ponieważ interesuje nas rozwój kraniofacjalny, dostosowaliśmy metodę w celu celowania w mezenchymę twarzy.

Przeszukując literaturę, ze zdziwieniem odkryliśmy, że istnieje bardzo niewiele doniesień o udanym transferze genów do tkanki chrzęstnej. Większość tych prac dotyczyła terapii genowej, takiej jak dostarczanie siRNA lub białek do chondrogennych linii komórkowych, bądź obejmowała modele zwierzęce zapalenia stawów ^11-13. W innych systemach, takich jak kurczak czy mysz, elektroporacja mezenchymy twarzy okazała się problematyczna (komunikaty osobiste, Dept of Craniofacial Development, KCL). Postawiliśmy hipotezę, że elektroporacja tkanek prochrząstkowych i chrzęstnych u Xenopus może przynieść lepsze efekty. W naszych badaniach wykazujemy, że transfer genów do chrząstek twarzy zachodzi wydajnie na wczesnych etapach (28), gdy pierwotek twarzy składa się jeszcze z tkanki miękkiej, przed różnicowaniem chrząstki.

Xenopus jest bardzo dostępnym systemem kręgowców do analizy rozwoju kraniofacialnego. Struktury kraniofacialne są lepiej widoczne w Xenopus niż w jakimkolwiek innym modelu kręgowca, przede wszystkim dlatego, że Xenopus embriony są zapładniane zewnętrznie, co umożliwia analizę najwcześniejszych etapów rozwoju oraz ułatwia obrazowanie na żywo z rozdzielczością pojedynczych komórek, a także ponowne wykorzystanie samic ¹⁴Wśród modeli kręgowców rozwijających się zewnętrznie, Xenopus jest bardziej użyteczny w analizach kraniofacjalnych niż rybki zebrafish, ponieważ Xenopus larwy są większe i łatwiejsze do preparowania, a rozwijający się obszar twarzy jest łatwiej dostępny do obrazowania niż analogiczny obszar u ryb. Ponadto, Xenopus jest ewolucyjnie bliższy ludziom niż danio pręgowany (˜o 100 milionów lat bliżej) ¹⁵Wreszcie, na tych etapach, Xenopus kijanki są przezroczyste, a jednoczesna ekspresja białek lub cząsteczek fluorescencyjnych umożliwi łatwą wizualizację rozwijających się chrząstek. Przewidujemy, że podejście to pozwoli nam na szybkie i wydajne testowanie potencjalnych cząsteczek w... in vivo system modelowy

Protokół

Część 1A. Sprzęt

Mikroskop: stereomikroskop prosty z obiektywem o małym powiększeniu

• Generator napięcia/impulsów: System do elektroporacji BTX ECM 830 Square Wave
• Wytwornica mikropipet: Wytwornica mikropipet P-87 (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: grubo nastawny lub łączony grubo i precyzyjnie, w zależności od preparacji
• Uchwyt do mikropipet: Fine Science Tools
• Elektroda: wykonana własnym sposobem
• Komora do elektroporacji: wykonana własnym sposobem

Elektrody w kształcie litery L:

1. Odciąć 8 cm wysokiej czystości drutu wolframowego o średnicy 0,4 mm (Goodfellow) i przymocować w jego środkowej części strzykawkę o pojemności 1 ml za pomocą masy plastycznej (stosujemy Blu-Tack). Pozostawić 4 cm drutu wolframowego wystającego poza końcówkę strzykawki i zgiąć go w kształt litery L w odległości 1 cm od końca (Rys. 1A).
2. Przyciąć końcówkę tak, aby odcinek końcowy miał długość 0,5 mm. Końcówka ta stanowi zakończenie elektrody.
3. Nadmiar drutu wolframowego poprowadzić równolegle do strzykawki i wykorzystać go do podłączenia generatora impulsów elektrody.
4. Powtórzyć proces w celu przygotowania pary elektrod.
5. Podłączyć elektrody do generatora impulsów prostokątnych za pomocą kabli DC.

Komora do elektroporacji

1. Wyłożyć dno szalki 90 mm warstwą nietoksycznej plasteliny o grubości ∼5 mm.
2. Napełnić szalkę pożywką do elektroporacji.
3. Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej nr 5 uformować wgłębienie w kształcie litery T (Rys. 2). Dłuższy odcinek wgłębienia powinien mieć wymiary ∼2 mm x 2 mm x 10 mm, a krótszy ∼2 mm x 2 mm x 5 mm. Szalkę do elektroporacji można umyć i użyć ponownie.

Część 1B. Odczynniki

DNA lub naładowane makromolekuły

• Mikropipety: kapilary z borokrzemianowego szkła o szerokości 1 mm i długości 4" (WPI, TW100-F)
• Podłoże hodowlane: Normal Amphibian Media (NAM)
• >Zatrag 10 X: 1100 mM NaCl, 20 mM KCL, 10 mM Ca(NO₃)₂•4H₂O, 1 mM EDTA.
  • Autoklawować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  • NAM 1 X: Rozcieńczyć z zatragu 10x, buforować 0,1 mM NaHCo₃ oraz 0,2 mM Na₃PO₄.
• Xenopus laevis kijanki, stadium 28

Przygotowanie DNA:

1. Przygotować plazmidy ekspresyjne zgodnie ze standardowymi protokołami.
2. Resuspendować DNA do końcowego stężenia 1 μg/μl w nukleazowo wolnej H₂0.

* Pozytywne wyniki uzyskano przy użyciu wektorów zawierających silny promotor CMV, takich jak pCS2+ [16]. Do analizy linii komórkowych zazwyczaj włączamy DNA kodujące zielone białko fluorescencyjne (pCS2+GFP) w stężeniu końcowym 0,1 μg/μl. [Testowano również stężenia DNA w zakresie 0,1-3 μg/μl. Stwierdzono, że stężenia poniżej 0,8 μg/μl skutkują nieefektywnym znakowaniem komórek, natomiast stężenia DNA powyżej 2 μg/μl nie poprawiały wydajności elektroporacji.]

Przygotowanie oligonukleotydów morfolinowych:

(Uwaga: MO muszą być znakowane fluorescencyjnie (zmodyfikowane 3'-karboksyfluoresceiną) lub w inny sposób naładowane).

1. Resuspender oligonukleotydy morpholino (MO) (Genetools, www.genetools.com) do stężenia 2 mM w wodzie H₂0 wolnej od nukleaz.
2. Podgrzać alikwot roztworu zapasowego w temperaturze 65°C przez 5 minut.
3. Rozcieńczyć do stężenia końcowego 0,5 mM w wodzie wolnej od nukleaz.

* Przetestowano roztwory MO o stężeniu 0,1-1 mM. Roztwory MO o stężeniu 0,5 mM okazały się wystarczające do elektroporacji wielu komórek mezenchymalnych.

Mikropipety

1. Przygotować mikropipety z kapilar z borokrzemianowego szkła (szerokość 1 mm, długość 4", WPI nr TW100-F). Użyć wyciągacza do igieł, aby przygotować mikropipety z obszarem zwężenia o długości 8-12 mm i cienką końcówką.
2. Zgnieść końcówkę w odległości ok. 2 mm od wierzchołka za pomocą pęsety, aby uzyskać poszarpane przełamanie.

Podłoża

1. Pożywka inkubacyjna: Przygotować świeżą pożywkę 3/4 Normal Amphibian Media (NAM) z roztworu stokowego 1x. Dodać 0,025 mg/ml gentamycyny.
2. Pożywka do elektroporacji: jak powyżej, z dodatkiem 0,1% benzokainy (Sigma, 06950).

2. Elektroporacja

Przygotowanie mikropipety

1. Napełnić mikropipetę ∼1 μl roztworu do iniekcji.
2. Zabezpieczyć mikropipetę w mikromanipulatorze i podłączyć do mikroinjektora (Picospritzer II).
3. Ustawić mikropipetę pod kątem 50° względem blatu stołu.
4. Ustawić ciśnienie iniekcji na 20 PSI.
5. Skalibrować mikropipetę, aby podawać 30 nl na impuls.

Przygotowanie kijanek

1. Zanurzyć larwy Xenopus w stadium 28 w podłożu do elektroporacji na 5 minut w celu przeprowadzenia znieczulenia.
2. Przenieść znieczulonego kijanka do komory elektroporacyjnej wypełnionej podłożem do elektroporacji. Umieścić embrion w długiej studzience tak, aby głowa spoczywała w złączu T stroną grzbietową do dołu, a stroną brzuszną do góry. Głowa powinna być lekko uniesiona w stosunku do ogona.
3. Za pomocą pęsety delikatnie unieruchomić kijanka w studzience, otaczając go plasteliną. (Uwaga: Jeśli kijanek nie zostanie unieruchomiony, może drgnąć i dotknąć elektrody podczas elektroporacji. W takim przypadku należy odrzucić kijanka, ponieważ tkanki twarzy zostaną poważnie uszkodzone).

Elektroporacja

1. Wprowadzić końcówkę mikropipety bezpośrednio za gruczoł cementowy, do mezenchymy twarzy.
2. Wstrzyknąć 30 nl roztworu do mezenchymy.
3. Wycofać mikropipetę.
4. Szybko ustawić końcówki elektrod równolegle do głowy zarodka (Rys. 3).
5. Przyłożyć 8 impulsów prostokątnych o napięciu 20 V i czasie trwania 50 ms.
6. Wycofać elektrody.
7. Za pomocą pęsety ostrożnie wyjąć kijanka z dołka i przenieść do 3/4 NAM z 0,025 mg/ml gentamycyny.
8. Kijanki można inkubować w 3/4 NAM z 0,025 mg/ml przez noc lub dłużej.
9. Po 24 godzinach przeprowadzić selekcję zarodków pod kątem wydajności elektroporacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

3. Reprezentatywne wyniki:

Zastosowanie cząsteczek fluorescencyjnych umożliwia łatwe przesiewanie elektroporowanych embrionów. Rysunek 4 przedstawia typową partię kijankami poddanych elektroporacji MO ok. 12, 48 i 96 godzin po zabiegu, inkubowanych w temperaturze 14,5°C. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej MO można wizualizować natychmiast po elektroporacji; fluorescencja utrzymuje się przez kilka dni po zabiegu. Według naszych doświadczeń fluorescencja jest słabo widoczna w stadium 46 (ok. 5 dni później). W chrząstkach fluorescencja gwałtownie spada po rozpoczęciu różnicowania (ok. st 42); jednak fluorescencja MO utrzymuje się silniej w innych typach komórek, takich jak endoderm rzekoma. Mikroskopia fluorescencyjna wykazuje, że oligonukleotydy są wbudowane w kilka tkanek czaszkowo-twarzowych, w tym w chrząstkę. Fluorescencję oligonukleotydów często można zaobserwować w tkankach po obu stronach głowy. Jest to prawdopodobnie spowodowane szybką dyfuzją roztworu wstrzykiwanego w obrębie luźnej mezenchymy czaszkowo-twarzowej przed elektroporacją.

Rycina 1 Samodzielnie wykonane elektrody. Drut wolframowy w kształcie litery L jest przymocowany do strzykawki 1 ml za pomocą nietoksycznej glinki lub masy plastycznej. (A) Długość końca elektrody wynosi 5 mm. (B) Należy zamocować parę elektrod w taki sposób, aby ich końce biegły równolegle. Elektrody są podłączone do generatora impulsów za pomocą kabli DC.

Rycina 2 Komora do elektroporacji. (A) Szalka o średnicy 90 mm wyłożona plasteliną jest wypełniona pożywką, a w niej wycięto w kształcie litery T komorę przy użyciu pęsety zegarmistrzowskiej nr 5. (B) Dłuższy bok ma wymiary 2 mm X 2 mm X 10 mm, natomiast krótszy 2 mm X 2 mm X 5 mm. Głowa embrionu spoczywa w rozwidleniu litery T, stroną brzuszną do góry.

Rysunek 3 Schemat przedstawiający procedurę elektroporacji. Kijanka w stadium St. 28 zostaje umieszczona w komorze do elektroporacji stroną brzuszną do góry. Mikropipetę wprowadza się do mezenchymy twarzy pod gruczołem cementowym. Wykonuje się iniekcję. Mikropipetę usuwa się, a elektrody w kształcie litery L ustawia się równolegle wzdłuż głowy. Przykładamy osiem prostokątnych impulsów o czasie trwania 50 ms i napięciu 20 V. Elektrody zostają wycofane. Kijanki hoduje się do pożądanych stadiów. Ekspresję MO lub GFP wizualizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rysunek 4 Reprezentatywne kijanki 12 (A), 48 (B) i 96 (C) godzin po elektroporacji (odpowiednio stadia 30, 34 i 44). (A"-B") Fluorescencyjne MO można zwizualizować w obrębie mezonchymu kraniofacjalnego w stadiach 30 i 34. Fluorescencję można wykryć w chrząstkach w stadium 44 (grot strzałki, C'-C"). Jelito wykazuje silną autofluorescencję.

Dyskusja

W tym filmie zademonstrowaliśmy możliwość dostarczania genów za pomocą elektroporacji do mezenchymy twarzy kijanek Xenopus. Stosując to podejście, możemy pominąć wczesne efekty rozwojowe manipulacji funkcją genu, co pozwala nam celować w konkretne tkanki w późniejszych punktach czasowych. Nasze badania pokazują, że można oddziaływać na heterogenne populacje mezenchymalnych komórek kraniotwarzowych, co umożliwia badanie linii komórkowych komórek poddanych elektroporacji, a także autonomicznych wymagań komórkowych dla białek będących przedmiotem zainteresowania. W połączeniu z obrazowaniem na żywo możemy wykorzystać tę metodę do badania funkcji genów w czasie, podczas rozwoju kraniotwarzowego. Ta nowatorska metoda podkreśla przydatność Xenopus do badania organogenezy. Przewidujemy, że metoda ta może zostać szeroko zaadaptowana do badania morfogenezy i różnicowania innych tkanek.