Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Podsumowanie

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Streszczenie

Mysi glejak 261 (GL261) jest uznawany za model in vivo, który odtwarza wiele cech ludzkiego glejaka wielopostaciowego (GBM). Linia komórkowa ta została pierwotnie indukowana poprzez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie 3-metylcholantrenu u syngenicznej szczepu myszy C57BL/6 ¹; w związku z tym można wykorzystać immunologicznie kompetentne myszy C57BL/6. Chociaż w tym przypadku stosujemy GL261, poniższy protokół może zostać wykorzystany do implantacji i monitorowania każdego wewnątrzczaszkowego modelu guza u myszy. Komórki GL261 zostały zmodyfikowane tak, aby stabilnie eksprimować lucyferazę świetlikową (GL261-luc). Stworzyliśmy również linię komórkową GL261-luc2 o większej jasności poprzez stabilną transfekcję genu luc2 eksprimowanego z promotora CMV. W celu wyeliminowania tłumienia światła spowodowanego czarną skórą i futrem wykorzystano myszy C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (wariant albinos C57BL/6) z National Cancer Institute, Frederick, MD. Dzięki zastosowaniu myszy C57BL/6 albinos możliwe jest obrazowanie in vivo przy użyciu systemu obrazowania in vivo IVIS Spectrum od dnia implantacji (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Linie komórkowe GL261-luc oraz GL261-luc2 wykazały takie samo zachowanie in vivo jak macierzyste komórki GL261. Do wspólnych cech histologicznych występujących w ludzkich GBM oraz w tym modelu mysim należą: martwica guza, pseudopalisady, neowaskularyzacja, naciekanie, nadkomórkowość oraz stan zapalny ¹.

Przed implantacją zwierzęta znieczulono poprzez dostrychalne wstrzyknięcie ketaminy (50 mg/kg), ksylazyny (5 mg/kg) i buprenorfiny (0,05 mg/kg), umieszczono w aparacie stereotaktycznym i wykonano skalpelem nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki. Wykonano otwór trepanacyjny 0,1 mm za bregma i 2,3 mm na prawo od linii środkowej. Igłę wprowadzono na głębokość 3 mm, a następnie wycofano o 0,4 mm, do głębokości 2,6 mm. W ciągu 3 minut wstrzyknięto 2 μl komórek GL261-luc lub GL261-luc2 (10⁷ komórek/ml). Otwór trepanacyjny zamknięto woskiem kostnym, a nacięcie zaszyto.

Po implantacji stereotaktycznej komórki bioluminescencyjne są wykrywalne od dnia implantacji, a guz można analizować przy użyciu funkcji rekonstrukcji obrazu 3D urządzenia IVIS Spectrum. Zwierzęta otrzymują podskórnie wstrzyknięte 150μg lucyferyny /kg masy ciała na 20 min przed obrazowaniem. Obciążenie guzem jest ilościowo określone na podstawie średniej bioluminescencji guza w czasie. Myszy z guzami były obserwowane codziennie w celu oceny stanu chorobowego i poddano je eutanazji w przypadku wystąpienia jednego lub więcej z następujących objawów: letargu, braku zdolności do poruszania się, zgarbionej postawy, braku pielęgnacji ciała, anoreksji prowadzącej do utraty >10% masy ciała. Podczas sekcji zwłok guzy były widoczne u wszystkich zwierząt.

Protokół

1. Hodowla komórek

1. Linia komórkowa GL26 została pozyskana z Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. Aby umożliwić ilościowy pomiar szybkości wzrostu guza, komórki GL261 uczyniono bioluminescencyjnymi, wykorzystując system Lentiphos HT (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) z mieszanką pakującą Lenti-X HT Packaging Mix (Clontech Laboratories, Inc.) oraz plazmidem FUW-GL (hojny dar z laboratorium J.B. Rubin, MD, PhD). Komórki hodowano w medium DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS; Clontech Laboratories, Inc.) wolnej od tetracykliny. Komórki GL261 poddano również stabilnej transfekcji genem kodującym luc2 przy użyciu wektora pGL4.51[luc2/CMV/Neo] (Promega Corp, Madison, WI) oraz odczynnika do transfekcji FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) zgodnie z warunkami określonymi przez producenta. Gen luc2 jest wersją zoptymalizowaną kodonowo lucyferazy świetlika, która zapewnia znacznie wyższą emisję światła niż standardowy gen luc. Stabilne transfekty selekcjonowano i utrzymywano w medium DMEM zawierającym 10% FCS i 100 μg/ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
2. Przed implantacją hodowane komórki zbiera się poprzez trypsynizację, płucze jednokrotnie w medium DMEM bez surowicy i resuspendsuje w medium DMEM bez surowicy do stężenia 1 x 10⁷ komórek/ml.

2. Przygotowanie do operacji ²

1. Przez cały czas trwania operacji utrzymywane jest sterylne środowisko, obejmujące wszystkie instrumenty chirurgiczne, materiały, rękawiczki, obłożenia itp.
2. Dziesięciotygodniowe myszy C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL/6) są pozyskiwane z National Cancer Institute at Frederick Animal Production Program i wykorzystywane przy średniej wadze 20 gramów (NCI, Frederick, MD).
3. Zwierzęta są znieczulane poprzez dostrypanytno-brzuszny wtrysk ksylazyny (5 mg/kg), ketaminy (50 mg/kg) oraz buprenorfiny (0,05 mg/kg). Przed rozpoczęciem operacji wykonuje się ucisk palca u stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Każdy ruch (nawet niewielki) jakiejkolwiek części ciała zwierzęcia jest sygnałem zmniejszenia poziomu znieczulenia. W takim przypadku zwierzę natychmiast otrzymuje dodatkowe 3,3 mg/kg ksylazyny i 26,6 mg/kg ketaminy. Temperatura ciała jest utrzymywana przy użyciu lampy i sterylnych opatrunków zakrywających ciało.
4. Po odpowiednim znieczuleniu zwierzę zostaje umieszczone na wyściełanym podłożu stereotaktycznego uchwytu głowy (Model 900 Small Animal Stereotaxic, David Kopf Instruments) [Rycina 1].
5. Niewielka ilość (1/4 cala) maści nawilżającej do oczu AKWA Tears Opthalmic Lubricant Ointment jest nakładana na rogówki.
6. Zwierzę zostaje unieruchomione w ramie stereotaktycznej poprzez otwarcie pyska (umieszczając palec wskazujący i kciuk wokół żuchwy zwierzęcia) i wsunięcie górnych przednich zębów w wgłębienie w ramie stereotaktycznej. Zacisk zostaje dokręcony, aby unieruchomić głowę zwierzęcia w uchwycie, upewniając się, że głowa jest wyrównana, a oczy wycentrowane, dbając jednocześnie o to, aby nie wywierać nadmiernej siły na głowę zwierzęcia.
7. Wężyk do O₂ zostaje przyklejony taśmą w pobliżu nozdrzy zwierzęcia. Przepływ tlenu wynosi 0,5 l/min.
8. Dolna część grzbietu i ogon zostają przyklejone taśmą do podłoża stereotaktycznego, uważając, aby nie utrudniać oddychania.
9. Miejsce nacięcia chirurgicznego zostaje ogolone. Do przemycia obszaru między oczami aż do obszaru między uszami jodem używane są patyczki nasączone Povidine-Iodine Swab Sticks, dbając o to, aby jod nie ściekał do oczu zwierzęcia.
10. Komórki są przygotowywane do implantacji bezpośrednio przed operacją i okresowo mieszane, aby zapobiec ich osiadaniu.
11. Strzykawka 10 μl o długości 50 mm firmy World Precision Instrument (WPI), Sarasota, FL, z igłą ściętą o rozmiarze 26 G, zostaje napełniona inokulum komórkowym. Jeśli komórki wydają się być skupione, może być konieczne ponowne napełnienie strzykawki.
12. Strzykawka 10 μl zostaje następnie umieszczona w mikroinjektorze UMP3-1 UltraMicroPump (WPI, Sarasota, FL).

3. Implantacja wewnątrzczaszkowa ²

1. Nacięcie skóry wykonuje się za pomocą ostrza skalpela nr 15 i pęsety z ząbkami. Wykonuje się nacięcie o długości 10-15 mm wzdłuż linii środkowej, zaczynając od miejsca między oczami zwierzęcia, kierując się w stronę uszu, aby odsłonić bregma (punkt przecięcia szwu strzałkowego i czołowego na szczycie czaszki). Należy upewnić się, że punkt bregma został prawidłowo zidentyfikowany, ponieważ można go pomylić z obszarem zatok, który znajduje się dystalnie względem bregma [Rysunek 2].
2. Po sedacji zwierzę otrzymuje wstrzyknięcie bupiwakainy 0,25% (2,5 mg/ml) w miejsce nacięcia.
3. Otwór trepanacyjny wykonuje się 0,1 mm za punktem bregma i 2,3 mm na prawo od linii środkowej, powoli obracając ręcznie igłę 16 G o długości 1½ cala, przykładając niewielki nacisk podczas obracania, aż do przebicia czaszki i odsłonięcia mózgu.
4. Igła strzykawki jest przesuwana w dół do odpowiedniej pozycji za pomocą stereotaktycznego uchwytu do strzykawek z mikronapędem, aż lekko dotknie powierzchni mózgu. Z tej pozycji igła jest wprowadzana do mózgu na głębokość 3 mm i pozostawiona w tym miejscu przez 3 minuty.
5. Igłę wycofuje się o 0,4 mm, do całkowitej głębokości 2,6 mm poniżej powierzchni mózgu, tworząc niewielką kieszeń, do której zostaną wprowadzone komórki. Na tym etapie można opcjonalnie wykonać zdjęcie rentgenowskie igły w organizmie zwierzęcia, aby upewnić się co do prawidłowego rozmieszczenia i głębokości.
6. Suspensja komórkowa jest infundowana przez 3 minuty przy użyciu mikroinjektora ustawionego na objętość 2000 nL (2 μL) przy szybkości infuzji 667 nL/minutę.
7. Igłę pozostawia się w miejscu wprowadzenia przez 2 minuty, aby zapobiec wyciekowi z miejsca infuzji.
8. Igłę powoli i całkowicie wycofuje się z tkanki.
9. Otwór trepanacyjny wypełnia się woskiem kostnym za pomocą dyssektora Penfielda.
10. Nacięcie zszywa się nicią Vicryl 4-0 (1,5 Metric), upewniając się, że w skórze nie pozostały duże przerwy. Vicryl jest materiałem szwy rozpuszczalnym, zatem szwy nie muszą być usuwane po zagojeniu się nacięcia.
11. Po operacji zwierzęta umieszcza się w klatce pod lampą grzewczą, ustawioną na wysokości zapewniającej ogrzanie dna klatki do 30°C. Gdy zwierzęta całkowicie się obudzą (oceniając to po normalnym ruchu w klatce), są one przenoszone z powrotem do zakwaterowania grupowego. Przez 5 dni po operacji do wody pitnej dodaje się doustnie ibuprofen. 100 mg ibuprofenu dla dzieci (100mg/5ml) dodaje się do standardowej butelki z wodą dla gryzoni o pojemności 473 ml. Zwierzęta są obserwowane codziennie, a obrazowanie i ważenie odbywa się co 3 dni. Dwa tygodnie po implantacji częstotliwość obserwacji zostaje zwiększona do dwóch razy dziennie. Zwierzęta są uśmiercane, gdy wykazują oznaki pogarszającego się stanu zdrowia, co obejmuje zwiniętą postawę ciała, zmniejszoną ruchomość i widoczną utratę masy ciała (≥20%). Objawy te są opublikowaną odpowiedzią na guz i powtarzalnie pojawiają się około 1 dnia przed śmiercią spowodowaną przez nowotwór.

4. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ³

1. Uruchom oprogramowanie [Living Image].
2. System obrazowania IVIS zostaje zainicjowany poprzez kliknięcie przycisku [Initialize IVIS System] w prawym dolnym rogu panelu sterowania.
3. Wybierz tryb obrazowania [Luminescent] w lewym górnym rogu panelu sterowania.
4. W celu wyznaczenia optymalnego czasu obrazowania po wtryśnięciu lucyferyny konieczne jest przeprowadzenie badania kinetycznego [Figure 3]. Poniższy opis dotyczy lucyferazy świetlika;
   1. Wstrzyknij zwierzęciu 10μl/g masy ciała D-lucyferyny dla świetlika (15mg/ml w PBS; Caliper Life Sciences Catalog XR-1001 lub podobny produkt innego dostawcy), zgodnie z opisem poniżej.
   2. Odczekaj 3 minuty, a następnie znieczul mysz, umieszczając ją w komorze do znieczulenia gazowego (2% gazu izofluranu w O₂).
   3. Wyłącz dopływ gazu znieczulającego do komory, otwórz zawór znieczulający oraz podciśnienie w kolektorze IVIS. Natychmiast umieść uspokojone zwierzę na platformie obrazowej z kontrolą temperatury, upewniając się, że nozdrze myszy jest prawidłowo umieszczone w kolektorze znieczulenia gazowego. Pierwszy obraz należy wykonać około 5 minut po wtryśnięciu lucyferyny. W urządzeniu IVIS Spectrum można jednocześnie obrazować do 5 zwierząt. Jeśli obrazowanych jest mniej niż 5 zwierząt, można zatkać niewykorzystane kolektory, aby oszczędzać gaz izofluranowy.
   4. Kontynuuj wykonywanie obrazów co 3 minuty, tworząc sekwencję trwającą do godziny, aby wygenerować krzywą kinetyczną ekspresji lucyferyny.
      1. Kliknij przycisk [Sequence Setup] w panelu sterowania.
      2. Pojawi się edytor sekwencji.
      3. W panelu sterowania określ ustawienia dla pierwszego obrazu bioluminescencyjnego w sekwencji.
         1. Zaleca się rozpoczęcie od średniego binningu (Medium Binning).
         2. Zalecamy również użycie funkcji Auto-Exposure w celu wyznaczenia optymalnego czasu ekspozycji.
         3. Wybierz przycisk [Delay] w edytorze sekwencji i określ czas opóźnienia wynoszący 3 minuty między poszczególnymi akwizycjami.
      4. Kliknij [Add] w edytorze sekwencji. Parametry akwizycji zostaną wówczas dodane do tabeli.
      5. Powtórz krok 4 dla każdego obrazu w sekwencji.
   5. Po wyznaczeniu krzywej można określić optymalny czas obrazowania, nanosząc siłę sygnału (intensywność) w funkcji czasu. Obrazuj zwierzęta w czasie najwyższej liczby fotonów in vivo, aby uzyskać najsilniejszy i najdokładniejszy sygnał.
5. W początkowych eksperymentach stosowano wtryskiwanie lucyferyny do jamy brzusznej (i.p.), jednak wstrzyknięcia i.p. sporadycznie prowadziły do zmiennych wyników, wykazujących niewielką lub żadną bioluminescencję w guzie. Postawiliśmy hipotezę, że sporadyczny, przypadkowy brak sygnału wynikał z dostarczenia lucyferyny do jelit lub innych narządów wewnętrznych. Zaczęliśmy zatem stosować podskórne (s.c.) wstrzyknięcia lucyferyny, co pozwoliło uzyskać większą powtarzalność obrazowania [Figure 3].
6. Dwadzieścia minut po wstrzyknięciu s.c. zwierzęta są znieczulane poprzez umieszczenie ich w komorze z 2% gazem izofluranu w O₂ aż do utraty reaktywności.
7. Znieczulone zwierzęta są przenoszone do komory obrazującej. W badaniu kinetycznym należy stosować maść oftalmiczną ze względu na czas trwania obrazowania. Nie jest ona wymagana w innych procedurach obrazowania, ponieważ trwają one krótko.
8. Obraz jest pozyskiwany przy średnim binningu i 5-minutowym czasie ekspozycji. Można również zastosować opcję automatycznej akwizycji.
9. Jeśli sygnał jest nasycony i/lub słaby przy średnim binningu, można dostosować binning lub czas ekspozycji.
10. Pliki programu i kolejne komentarze do obrazów są zapisywane w katalogu użytkownika na komputerze.

5. Obrazowanie 3D ³

1. Kliknij kartę [Imaging Wizard] w oknie [Sequence Setup] panelu sterowania.
2. Wybierz tryb obrazowania [Bioluminescence] na ekranie startowym Imaging Wizard i kliknij [Next].
3. W oknie „Bioluminescence - DLIT” kreatora obrazowania wybierz sondę reporterową [Firefly]. Emisja / wzbudzenie wybranego widma źródła firefly pojawi się wraz z sześcioma odpowiadającymi mu filtrami do rejestracji.
4. Pojawi się ostatni ekran z domyślnymi wyborami, które obejmują parametry akwizycji Auto exposure oraz Field of View C. Ustawienia domyślne sprawdzają się bardzo dobrze; można je jednak zmodyfikować w razie potrzeby.
5. Kliknij [Next], a okno edytora sekwencji zostanie wypełnione sekwencją sześciu regionów widmowych z filtrami o szerokości 20 nm (560 nm, 580 nm, 600 nm, 620 nm, 640 nm i 660 nm). Naciśnij [Acquire Sequence]. Pierwszy filtr (560 nm) będzie zawierał ustrukturyzowany wzór światła z wykorzystaniem galwanometru laserowego w celu ustalenia topografii powierzchni.
6. Wybierz kartę [Surface Topography] w Palecie Narzędzi (Tool Palette). Można zastosować wygładzanie powierzchni, aby zniwelować wszelkie ostre kąty powstałe podczas procesu rekonstrukcji. Zalecane jest domyślne niskie wygładzanie.
7. Kliknij [Create], a pojawi się okno analizy tomograficznej. Narysuj ramkę wycinania obejmującą całe zwierzę, a następnie kliknij [Next].
8. Narzędzie progowania pojawi się jako fioletowa maska nad wybranym regionem. Maska powinna zostać automatycznie ustawiona tak, aby pasowała do zdjęcia zwierzęcia. W razie potrzeby dostosuj próg maski, aby lepiej dopasować ją do obrysu zwierzęcia.
9. Kliknij [Finish], a pojawi się zrekonstruowana siatka. Rekonstrukcję można następnie zapisać w karcie wyników.
10. Po utworzeniu topografii powierzchni zwierzęcia przejdź do rozwijanego menu [DLIT 3D Reconstruction] w Palecie Narzędzi.
11. W karcie [Analyze] zaznacz wszystkie sześć długości fal, aby przeprowadzić rekonstrukcję. Odznacz obrazy, które spowodowały nasycenie pikseli lub w których liczba zliczeń była niższa niż 600. Pozostaw domyślne ustawienia w karcie [Parameters].
12. W karcie [Properties] jako domyślny wybór dla Właściwości Tkanki (Tissue Properties) powinno widnieć „Muscle”, a jako widmo źródłowe „Firefly”.
13. Kliknij [Reconstruct] w karcie Analyze, a powinna pojawić się rekonstrukcja 3D powierzchni zwierzęcia oraz odpowiadająca jej rekonstrukcja źródła sygnału [Rysunek 4].
14. Aby określić lokalizację i intensywność sygnału, wybierz przycisk Voxels w karcie 3D Tools Palety Narzędzi.
    1. Narysuj kwadrat wokół wszystkich wyświetlonych wokseli; całkowity pomiar strumienia zostanie wyświetlony na dole karty wolumenu.
    2. Kliknij [Center of Mass], aby zidentyfikować lokalizację sygnału wybranych wokseli. Pojawią się przekroje zwierzęcia w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej i poprzecznej, a za pomocą [Measurement Cursor Display] można zmierzyć odległość od powierzchni zwierzęcia do środka woksela.
15. Kolejne informacje na temat korejestracji atlasów organów i innych zaawansowanych funkcji można znaleźć w Instrukcji Obsługi Oprogramowania Living Image.

6. Analiza danych ³

1. Po wykonaniu i zapisaniu obrazu, dostęp do pliku programu uzyskujemy, klikając przycisk [Przeglądaj] i wybierając odpowiedni plik.
2. Informacje o obrazie znajdują się w menu [Widok] → [Informacje o obrazie].
3. Intensywność sygnału można określić ilościowo, wybierając przycisk obszaru zainteresowania (ROI) [Narzędzia ROI]. Należy upewnić się, że obraz jest analizowany w trybie [Photon], wybierając opcję „Photon” z listy rozwijanej w lewym górnym rogu panelu sterowania obrazem.
4. Z listy rozwijanej „Typ” należy wybrać przycisk [Pomiar ROI]. Następnie wybiera się interesujący kształt ROI; dostępne opcje to koło, kwadrat lub siatka. Należy objąć wszystkie obszary intensywności na uzyskanym obrazie.
5. Pozycję ROI ustawia się, przeciągając wybrany kształt ROI na obszar zawierający sygnał bioluminescencyjny.
6. Intensywność sygnału ROI oblicza się, klikając przycisk [Mierz]. Etykieta ROI wyświetla wartość intensywności. Obszary ROI można zarządzać i zapisywać za pomocą oprogramowania Living Image.

7. Reprezentatywne wyniki:

Pomyślna implantacja komórek jest widoczna, gdy zaimplantowane komórki są wykrywalne za pomocą obrazowania IVIS w dniu operacji. Zarówno komórki GL261-luc, jak i GL261-luc2 są wykrywalne, jednak gen luc2 zapewni wyższy poziom bioluminescencji [Rysunek 5]. Obrazy wykonane wkrótce po implantacji mogą wykazywać niespecyficzny sygnał na łapach i nosie zwierzęcia, który należy zignorować jako tło. Sygnał zlokalizowany w miejscu implantacji jest rzeczywisty i będzie zwiększać się z czasem [Rysunek 6]. Spadek intensywności sygnału w 6. dniu jest powtarzalny i najprawdopodobniej wynika z utraty uchwytu nowotworu przez niektóre z zaimplantowanych komórek. Ilościowe pomiary obciążenia nowotworowego są powtarzalne w tym sensie, że powinny stale rosnąć, aż zwierzę ostatecznie padnie ofiarą choroby. Jednakże krzywe wzrostu będą w dużej mierze zależeć od stanu zaimplantowanych komórek oraz/lub nieuniknionej niewielkiej zmienności w procedurze implantacji. W naszym laboratorium zdecydowano się na obrazowanie zaimplantowanych zwierząt co trzy dni.

Rysunek 1. Po odpowiednim znieczuleniu mysz zostaje umieszczona w ramie stereotaktycznej. Głowa myszy jest stabilizowana za pomocą zacisku do pyska.

Rycina 2. Po rozcięciu skóry identyfikuje się główne punkty anatomiczne, w tym bregmę oraz szwy czołowe i strzałkowe. Otwór trepanacyjny wykonuje się 2,3mm na prawo od bregmy, powoli obracając igłę 16 G o długości 1½ cala z niewielkim naciskiem, aż do przebicia czaszki i odsłonięcia mózgu.

Rysunek 3. Przeprowadzono porównanie kinetyki po podaniu lucyferyny podskórnie () względem podania dosytnieniowego (), aby wykazać użyteczność podania lucyferyny podskórnie oraz określić optymalny czas obrazowania po podaniu lucyferyny. Trzy minuty po wstrzyknięciu lucyferyny mysz została poddana sedacji, umieszczona w urządzeniu IVIS Spectrum i obrazowana co 3 minuty przez godzinę, a następnie co 6 minut, w celu wygenerowania krzywej kinetycznej bioluminescencji. Wykazano, że w naszych warunkach droga podania lucyferyny podskórnie była lepsza niż wstrzyknięcie dosytnieniowe oraz że optymalny czas obrazowania zwierząt przy zastosowaniu komórek GL261-luc wynosił około 25 minut po podaniu lucyferyny.

Rysunek 4. Wiele widoków trójwymiarowej rekonstrukcji wewnątrzczasowej implantacji komórek GL261-luc2 zarejestrowanych wspólnie ze szkieletem i mózgiem myszy.

Rysunek 5. Liczba fotonów uzyskana z guzów powstałych z komórek GL261-luc w porównaniu z komórkami GL261-luc2. Wyniki stanowią średnią z 5 zwierząt.

Rysunek 6. Wykres wzrostu komórek nowotworu GL261-luc u albinotycznej myszy C57BL/6. Bioluminescencję mierzono co 3 dni i przedstawiono jako liczbę fotonów in vivo w funkcji dni po implantacji. Zdjęcia przedstawiają bioluminescencję w różnych punktach czasowych. Kolorystyka wskazuje na bioluminescencję (intensywność pikseli), która jest proporcjonalna do liczby komórek nowotworowych (skala kolorów widoczna po prawej stronie). Po śmierci zwierzęcia z powodu choroby wycięto mózg i miejscowo dodano lucyferynę, aby uzyskać obraz ex vivo przedstawiony we wstawce na rysunku.

Dyskusja

Inokulum komórek wstrzyknięto na głębokość 2,6 mm od powierzchni mózgu po utworzeniu kieszeni o szerokości 0,4 mm. Aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i głębokość wprowadzenia igły, można wykonać zdjęcie rentgenowskie przy użyciu ramienia C (C-Arm) lub podobnego urządzenia do wzmacniania obrazu rentgenowskiego; jest to jednak opcjonalne. Powikłania chirurgiczne mogą wystąpić, jeśli zwierzę nie zostanie odpowiednio zsedowane, co może prowadzić do jego ruchu podczas infuzji komórek. Może to spowodować wyciek mieszaniny komórek lub krwawienie z kanału wprowadzenia igły. Wyciek komórek prowadzi do ektopowego wzrostu komórek nowotworowych. Ważne jest również, aby nie przebić komory mózgu, co może się zdarzyć, jeśli otwór trepanacyjny zostanie wykonany przyśrodkowo od opisanych w protokole 2,3 mm ⁴. Prawidłowe umieszczenie igły oraz rozprzestrzenianie się komórek sprawdzono poprzez wstrzyknięcie myszy 2 µl błękitu metylenowego, a następnie wypreparowanie tkanki mózgowej w celu weryfikacji lokalizacji wstrzykniętego barwnika.

W niniejszym protokole zastosowano system obrazowania in vivo IVIS Spectrum oraz oprogramowanie Living Image (v 4.0) przeznaczone do pracy z tym urządzeniem (Caliper Life Sciences). Do uzyskania podobnych wyników można użyć każdego porównywalnego systemu obrazowania in vivo oraz narzędzi do analizy obrazu. Systemy te zapewniają pewne korzyści w porównaniu z tradycyjnym obrazowaniem rezonansem magnetycznym (MRI) w monitorowaniu wzrostu eksperymentalnego guza wewnątrzczaszkowego. Najbardziej oczywistą jest względna cena obu urządzeń – aparaty MRI do zwierząt są znacznie droższe i zazwyczaj wymagają usług wykwalifikowanego technika MRI. Obrazowanie in vivo, takie jak opisane tutaj, może być wykonywane przez użytkownika końcowego. Dane z bioluminescencji są ilościowe, podczas gdy kwantyfikacja danych MRI jest czasochłonna i w pewnym stopniu niedokładna. Ponadto obrazy MRI wykazują obrzęk i stan zapalny obok komórek nowotworowych, co może utrudniać oddzielenie guza od efektów leczenia. Z tych powodów uzyskanie dokładnych pomiarów objętościowych rosnącego guza może być wyzwaniem. Bioluminescencja wymaga ATP, zatem tylko żywe komórki nowotworowe przyczyniają się do danych o wielkości guza. Mimo to, MRI ma pewne zalety, jeśli urządzenie jest dostępne. Komórki nie muszą być znakowane markerem bioluminescencyjnym, aby były widoczne w MRI. Możliwość wizualizacji obrzęku okołoguźowego może być zaletą w niektórych protokołach eksperymentalnych. Atutem obu technologii jest to, że zastosowanie jednej nie wyklucza drugiej, dzięki czemu – przy dostępności obu technologii – badacz może uzyskać dane dotyczące zarówno wzrostu guza, jak i obecności obrzęku okołoguźowego oraz stanu zapalnego u tego samego zwierzęcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
GL261-luc2 Bioware Ultra	Caliper Life Sciences	GL261-luc2
podłoże DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Invitrogen	10313039
Geneticyna (G418)	GIBCO, by Life Technologies	11811-023
płodowa surowica bydlęca (FCS)	Invitrogen	26140079
bufor fosforanowy (PBS)	Invitrogen	70011044
myszy C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr	National Cancer Institute
maść okulistyczna nawilżająca AKWA Tears	Akorn Inc	17478-062-35
Ketaset (chlorowodorek ketaminy)	Wyeth Animal Health	11570775
Sedazine (chlorowodorek ksylazyny)	Wyeth Animal Health	10031894
stereotaktyczny instrument dla małych zwierząt	Kopf Instruments	900
UltraMicroPump z kontrolerem SYS-Micro4	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	W przypadku braku dostępności możliwe jest podawanie ręczne
strzykawka 10μl z igłą ściętą 26G	World Precision Instruments, Inc.	SGE010RNS
pinceta Adisona	World Precision Instruments, Inc.	500092
dyssektor Penfielda	Codman	65-1015
igła Precision Glide 16g 1½	BD Biosciences	305198
uchwyt do skalpela chirurgicznego	BD Biosciences	371030
główka skalpela nr 15	BD Biosciences	371315
szew Vicryl 4-0	Ethicon Inc.	VCP496G
wosk kostny	Medline Industries	DYNJBW25
gaziki nasączone jodopowidonomem	Medline Industries	MD93901
sól potasowa D-lucyferyny	Caliper Life Sciences	122796
Forane (izofluran)	Baxter Internationl Inc.	1001936060
mikroskop OPMI Pentero	Carl Zeiss, Inc.		Wystarczy dowolny mikroskop chirurgiczny
Xenogen IVIS Spectrum z opcjonalnym systemem anestezji	Caliper Life Sciences