Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Podsumowanie

Ilustrujemy zastosowanie osiowych pęset optycznych o stałej sile do badania właściwości mechanicznych krótkich cząsteczek DNA. Poprzez rozciąganie DNA wzdłuż osi minimalizujemy zawady steryczne oraz artefakty występujące w konwencjonalnej manipulacji bocznej, co pozwala nam badać cząsteczki DNA o długości nawet ~100 nm.

Streszczenie

Techniki pojedynczych cząsteczek służące do rozciągania DNA o długości konturowej mniejszej niż kilobaza wiążą się z licznymi trudnościami eksperymentalnymi. Jednak wiele interesujących zjawisk biologicznych, takich jak wiązanie histonów czy zapętlanie DNA pośredniczone przez białka^1,2, zachodzi w tej skali długości. W ostatnich latach wykazano, że właściwości mechaniczne DNA odgrywają istotną rolę w fundamentalnych procesach komórkowych, takich jak upakowanie DNA w kompaktowe nukleosomy i włókna chromatyny^3,4. Oczywiste jest zatem, że zrozumienie właściwości mechanicznych krótkich fragmentów DNA jest niezwykle ważne. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczny przewodnik po opracowanej przez nas technice optycznej pęsety pojedynczych cząsteczek, służącej do badania zachowania mechanicznego DNA o długościach konturowych wynoszących zaledwie kilka setek par zasad.

Główną przeszkodą w rozciąganiu krótkich fragmentów DNA jest fakt, że konwencjonalne pęsety optyczne są zazwyczaj zaprojektowane tak, aby przykładać siłę w kierunku bocznym względem stolika^5,6, (patrz Ryc. 1). W takiej geometrii kąt między kuleczką a szkiełkiem podstawowym, do którego przywiązane jest DNA, staje się bardzo stromy dla DNA o długości poniżej mikrona. Należy teraz uwzględnić pozycję osiową, co może stanowić wyzwanie, a ponieważ rozciąganie przybliża mikrosferę do szkiełka podstawowego, nasilają się efekty steryczne. Ponadto, w wyniku asymetrii mikrosfer, rozciąganie boczne będzie generować zmienne poziomy momentu obrotowego ze względu na rotację mikrosfery w pułapce optycznej, ponieważ kierunek siły reakcji zmienia się podczas rozciągania.

Alternatywne metody rozciągania submikronowego DNA napotykają własne, specyficzne przeszkody. Na przykład pułapka optyczna z dwoma wiązkami jest ograniczona do rozciągania DNA o długości około jednej długości fali, przy której efekty interferencji między dwiema pułapkami oraz rozpraszanie światła między mikrosferami zaczynają stanowić istotny problem. Zastąpienie jednej z pułapek mikropipetą najprawdopodobniej wiązałoby się z podobnymi trudnościami. Choć można by bezpośrednio wykorzystać potencjał osiowy do rozciągnięcia DNA, konieczne byłoby zastosowanie aktywnego układu sprzężenia zwrotnego w celu przyłożenia stałej siły, a pasmo przenoszenia takiego układu byłoby dość ograniczone, zwłaszcza przy niskich siłach.

Omijamy te fundamentalne problemy, bezpośrednio odciągając DNA od szkiełka podstawowego za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile^7,8. Osiąga się to poprzez uwięzienie kuleczki w liniowym obszarze potencjału optycznego, gdzie siła optyczna jest stała, a jej wartość można regulować poprzez dostosowanie mocy lasera. Pułapkowanie w obszarze liniowym służy również jako całkowicie optyczny zacisk siły (force-clamp) działający na DNA, który rozciąga się na blisko 350 nm w kierunku osiowym. Jednocześnie kompensujemy dryf termiczny i mechaniczny poprzez precyzyjne regulowanie pozycji stolika w taki sposób, aby mikrosfera referencyjna przyklejona do szkiełka podstawowego pozostawała w tej samej pozycji i ostrości, co pozwala na praktycznie nieograniczony czas obserwacji.

Protokół

1. Konfiguracja pęsety

1. Wiązka z lasera 1064 nm jest rozdzielana na dwie wiązki o ortogonalnej polaryzacji. Jedna służy do manipulowania biomolekułą, a druga do celów kalibracyjnych (patrz Rys. 2).
2. Intensywność wiązki manipulacyjnej jest kontrolowana przez akustooptyczny deflektor (AOD), natomiast pozycja i ogniskowa każdej wiązki są sterowane niezależnie, odpowiednio za pomocą luster sterujących wiązką i teleskopów optycznych.
3. Wiązki są następnie ponownie łączone za pomocą innego polaryzacyjnego dzielnika wiązki i dodatkowo korygowane przez końcowy zestaw optyki teleskopowej, aby lekko przepełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopu. Przepełnienie rzędu 50% dla wiązki kalibracyjnej prowadzi do powstania ciasnej pułapki optycznej, podczas gdy nieco mniejszy współczynnik dla wiązki manipulacyjnej, około 20%, zapewnia płytszą ogniskową, co przekłada się na większy obszar roboczy potencjału liniowego. Wiązki są silnie ogniskowane na komorze z próbką za pomocą obiektywu mikroskopu imersyjnego PlanApo 60x/1.4 w oleju.
4. Ten układ pęsety optycznej jest połączony z własnoręcznie zbudowanym mikroskopem w polu jasnym, który zapewnia oświetlenie z lampy halogenowej ogniskowanej na komorę z próbką przez kondensor. Obraz w polu jasnym jest oddzielany od światła lasera za pomocą lustra dichroicznego, a następnie obrazowany na dwóch kamerach CCD. Jedna kamera CCD służy jako główny środek pozyskiwania danych i jest wyzwalana programowo w celu uzyskania precyzyjnych częstotliwości próbkowania, natomiast druga kamera CCD służy do obrazowania pojedynczej, unieruchomionej mikrosfery referencyjnej, której pozycja służy jako system sterowania sprzężeniem zwrotnym w celu kompensacji dryftu mikroskopu.
5. Próbka jest wstępnie pozycjonowana względem obiektywu za pomocą stolika XY, a następnie może być precyzyjnie ustawiana za pomocą wbudowanego trójwymiarowego stolika piezoelektrycznego.
6. W przód rozproszone i transmitowane światło laserowe jest zbierane przez kondensor pola jasnego i ogniskowane na fotodetektorze. Wynikowy sygnał jest filtrowany przez filtr antyaliasingowy przy 100 kHz, wzmacniany i rejestrowany z częstotliwością 200 kHz przy użyciu karty DAQ.

2. Kalibracja pozornej wielkości koralika w funkcji pozycji osiowej

1. Napełnić komorę z próbką⁹ dyspersyjnym roztworem mikrosfer polistyrenowych o średnicy 800 nm rozcieńczonym w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Pozostawić na 10-15 minut, a następnie lekko przepłukać buforem, aby usunąć nadmiar mikrosfer.
2. Zlokalizować mikrosferę przypadkowo przywierającą do szkiełka podstawowego i dostosować wysokość komory z próbką tak, aby mikrosfera znajdowała się około 1 μm poniżej płaszczyzny ostrości w celu uzyskania obrazu nieostrego.
3. Aby zmierzyć pozorny rozmiar obrazu, należy najpierw wyznaczyć środek mikrosfery, korzystając z funkcji dopasowywania wzorców geometrycznych w programie LabView.
4. Następnie wygenerować radialny profil intensywności mikrosfery poprzez uśrednienie wartości w zakresie 360° wokół środka każdego przekroju poprzecznego. Profil radialny, który odpowiada białemu pierścieniowi na każdym z obrazów w polu jasnym, można dopasować do funkcji kwadratowej w celu znalezienia szczytu jasności. Odległość między tym szczytem a środkiem może służyć jako miara pozornego rozmiaru kuleczki.
5. Korzystając z skalibrowanego stolika piezoelektrycznego, stopniowo zwiększać pozycję osiową mikrosfery i rejestrować obraz dla każdej pozycji osiowej za pomocą kamery CCD.
6. Powtarzać analizę obrazu dla każdego kolejnego zdjęcia, aby powiązać pozorny rozmiar mikrosfery z jej położeniem osiowym (patrz Rys. 3). Rozdzielczość osiowa uzyskana tą metodą wynosi około 1.4 nm⁷.

3. Mapowanie potencjału optycznego wiązki manipulacyjnej

1. Rozpocznij od kolinearnego wyrównania wiązki manipulacyjnej i wiązki kalibracyjnej. Wiązka kalibracyjna powinna mieć moc około 50 mW w tylnej aperturze obiektywu, podczas gdy wiązka manipulacyjna powinna być znacznie słabsza, np. 10 mW.
2. Przy wyłączonej wiązce manipulacyjnej uwięź wolną mikrosferę w znacznie sztywniejszej pułapce wiązki kalibracyjnej.
3. Następnie włącz wiązkę manipulacyjną. Ponieważ wiązka manipulacyjna jest znacznie słabsza od wiązki kalibracyjnej, pozycja osiowa mikrosfery zostanie lekko zaburzona. Wynikową zmianę pozycji osiowej można zmierzyć na podstawie obrazów w jasnym polu z defokusem, jak opisano wcześniej.
4. Wyłącz wiązkę manipulacyjną i, gdy mikrosfera jest nadal uwięziona w wiązce kalibracyjnej, przesuń ostrzenie osiowe wiązki kalibracyjnej poprzez regulację soczewki teleskopowej. Włącz wiązkę manipulacyjną, zmierz następujące przesunięcie mikrosfery i powtórz czynność.
5. Przesunięcia ΔX można nanieść na wykres w funkcji pozycji osiowej ogniska wiązki kalibracyjnej. Pozycja osiowa odpowiadająca największemu przesunięciu mikrosfery wyznacza środek liniowego obszaru pułapki optycznej (patrz Rys. 4).
6. Ostatnim krokiem w celu uzyskania siły optycznej wiązki manipulacyjnej jako funkcji pozycji osiowej jest dokładny pomiar sztywności wiązki kalibracyjnej. Aby to osiągnąć, przesuń mikrosferę uwięzioną przez wiązkę kalibracyjną na wysokość około mikrometra nad powierzchnią, regulując soczewkę teleskopową przy wyłączonej wiązce manipulacyjnej.
7. Zarejestruj termiczny ruch osiowy mikrosfery, mierząc natężenie światła przechodzącego za pomocą fotodetektora.
8. Autokorelację sygnału można dopasować do funkcji pojedynczego wykładniczego zaniku, aby otrzymać stałą czasową fluktuacji, .τ_z
9. Współczynnik tarcia hydrodynamicznego ζ mikrosfery można skorygować o bliskość mikrosfery do powierzchni^5,10. Sztywność pułapki kalibracyjnej jest wówczas określona wzorem κ_z = ζ / τ_z (patrz Materiały Uzupełniające A i B).
10. Znajomość sztywności pułapki kalibracyjnej pozwala przekształcić wcześniej zmierzone przesunięcia osiowe w siłę ƒ_z =κ_z ΔX. Całkowanie tej krzywej daje mapowanie przestrzenne osiowego potencjału optycznego wiązki manipulacyjnej (patrz Rys. 4).

4. Rozciąganie próbki DNA

1. Zamontuj komorę⁹ zawierającą cząsteczki DNA przytwierdzone do powierzchni (< 1 kbp) i, obserwując obraz w polu jasnym, ustaw ostrość wiązki manipulacyjnej nieco powyżej nierozciągniętych mikrosfer, regulując teleskop. Następnie dostosuj pozycję stolika, aż jedna z mikrosfer zostanie uwięziona.
2. Wstępnie ustaw mikrosferę w centrum płaszczyzny XY pułapki optycznej. Wygeneruj w programie LabView serię fal prostokątnych i prześlij je do AOD, aby wielokrotnie włączać i wyłączać wiązkę lasera. Starannie kontroluj natężenie lasera oraz czas trwania stanu włączonego, aby zapobiec nagrzaniu komory z próbką. Zazwyczaj stosuje się moc lasera około 2 mW (mierzoną w tylnej aperturze obiektywu) i wysyła impulsy o czasie trwania 200 ms (włączony) oraz 500 ms (wyłączony). Amplituda fali prostokątnej wysyłanej do AOD powinna wynosić około 0,5 V.
3. Obserwuj mikrosferę podczas wielokrotnego włączania i wyłączania pułapki i sprawdź, czy laser nadaje ruchowi mikrosfery jakiś preferowany kierunek. Poprzez iteracyjną regulację pozycji mikrosfery w kierunkach X i Y za pomocą stolika piezoelektrycznego, ruchy losowe mikrosfery powinny stać się izotropowe w płaszczyźnie XY, choć zauważalnie ograniczone podczas włączonego lasera.
4. Następnie wyrównaj kuleczkę w kierunku Z. Ponownie włączaj i wyłączaj wiązkę lasera, mierząc tym razem jednocześnie przemieszczenie osiowe mikrosfery w czasie rzeczywistym. Ustaw stolik w centrum obszaru liniowego, czyli w punkcie, w którym przemieszczenie Z jest największe.
5. Po dokładnym wyrównaniu w kierunku Z konieczne jest sprawdzenie, czy pułapka jest nadal wyśrodkowana w płaszczyźnie XY. Jeśli wyrównanie XY uległo zmianie, należy powtórzyć wyrównanie zarówno w osiach XY, jak i Z, aż mikrosfera zostanie prawidłowo wyśrodkowana wzdłuż wszystkich trzech osi.
6. Aby rozciągnąć DNA, zwiększaj natężenie lasera, przesyłając sygnał napięciowy do AOD od 0 V do 0,5 V w krokach co 0,025 V. W każdym kroku zarejestruj 400 klatek przy 100 fps i wyciągnij z nich średnią, aby uzyskać przemieszczenie osiowe.
7. Można teraz wykreślić krzywe siła-rozciągnięcie i dopasować je do zmodyfikowanego modelu WLC¹¹ (patrz Materiały uzupełniające B).

5. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiamy krzywe siła-rozciągnięcie dla dwóch sekwencji DNA: sekwencji o długości 1298 bp oraz 247 bp, przy czym ta ostatnia jest najkrótszą sekwencją, którą udało nam się rozciągnąć w sposób powtarzalny. W przypadku krótkich fragmentów DNA konwencjonalny model łańcucha podobnego do robaka (Worm-Like Chain, WLC) nie wyjaśnia w pełni zależności między siłą a rozciągnięciem, ponieważ w tej skali długości należy uwzględnić efekty skończonego rozmiaru oraz rozciągnięcie przy zerowej sile wynikające z ograniczeń brzegowych. Pomiary siła-rozciągnięcie muszą zatem zostać dopasowane przy użyciu zmodyfikowanego modelu WLC, w którym parametrami dopasowania są efektywna długość uporczywości oraz rozciągnięcie przy zerowej sile, co zostało opisane szerzej w materiałach uzupełniających. Dla dużych długości konturowych dsDNA efektywna długość uporczywości jest po prostu nominalną długością uporczywości (˜50 nm), a rozciągnięcie przy zerowej sile można pominąć. Jednak w miarę skracania się długości konturowej efektywna długość uporczywości spada znacznie poniżej 50 nm, a DNA, nawet przy zerowej sile, wykazuje znaczne rozciągnięcie.

Dane oraz odpowiadające im dopasowania krzywych siła-wydłużenie dla obu sekwencji przedstawiono na rys. 5. Na podstawie zmodyfikowanych dopasowań modelu WLC określono efektywne długości uporczywości, które wyniosły 35 nm dla DNA o długości 1298 bp oraz 25 nm dla DNA o długości 247 bp. W celach ilustracyjnych zaprezentowano pojedyncze pomiary krzywych siła-wydłużenie dla każdej sekwencji. W praktyce pomiary należy powtórzyć wielokrotnie, aby uzyskać wyniki średnie wraz z błędami standardowymi. Należy również zauważyć, że po uzyskaniu każdej krzywej konieczne jest upewnienie się, że mikrosfera pozostaje uwięziona i prawidłowo ustawiona w obszarze liniowym; w przeciwnym razie mikrosferę należy ponownie wyrównać zgodnie z opisem zawartym wcześniej w protokole.

Rysunek 1 Zasada działania osiowych pęset optycznych. (Po lewej) Konwencjonalne pęsety optyczne chwytają obiekt w pobliżu ogniska. Następnie kuleczka jest przesuwana bocznie względem szkiełka podstawowego w celu wywarcia naprężenia. (Po prawej) W osiowych pęsetach optycznych mikrosfera jest chwytana poza ogniskiem, w liniowym obszarze potencjału optycznego. W tej konfiguracji polimer jest utrzymywany pod stałym naprężeniem w zakresie różnych wydłużeń. Ponadto zwiększenie intensywności lasera przesuwa mikrosferę w kierunku osiowym.

Rysunek 2 Schematyczny przedstawienie osiowych pęset optycznych. Światło laserowe (1064nm Nd:YvO₄) jest rozdzielane na dwie wiązki poprzez przejście przez polaryzacyjny dzielnik wiązki (PBS). Wiązka manipulacyjna przechodzi przez akustyczno-optyczny deflektor (AOD), natomiast wiązka kalibracyjna może być regulowana niezależnie za pomocą soczewek teleskopowych. Obie wiązki są następnie łączone przy użyciu drugiego PBS i ogniskowane na próbce przez obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (N.A.). Jednocześnie oświetlenie w polu jasnym, wykorzystywane do śledzenia mikrosfery, przechodzi przez próbkę, jest filtrowane z podczerwieni (IR), a następnie obrazowane przez dwie kamery CCD, z których jedna wykonuje pomiary, a druga pełni funkcję elementu systemu sterowania sprzężeniem zwrotnym.

Rycina 3 Kalibracja pozycji osiowej. Aby skalibrować pozycję osiową, pozyskujemy obrazy nieostre kuleczki przytwierdzonej do szkiełka przedmiotowego komory przy różnych pozycjach osiowych stolika. Rozmiar mikrosfery jest określany przez odległość między jej centrum a pozycją maksymalnej intensywności jasnego pierścienia utworzonego wokół obrazu mikrosfery. Wstawka przedstawia radialny rozkład intensywności, który pozwala wyznaczyć rozmiar kuleczki.

Rysunek 4 Zasada mapowania potencjału optycznego. W celu zmapowania siły optycznej wiązki manipulacyjnej pomierzone zostaje przesunięcie osiowe, jakie wywołuje ona w mikrosferze uwięzionej w znacznie silniejszej wiązce kalibracyjnej. Wyznacza się środek obszaru liniowego, w którym przesunięcie to jest maksymalne. Krzywą zależności siły optycznej od pozycji osiowej można zintegrować, aby wyznaczyć potencjał optyczny.

Rysunek 5 Krzywa rozciągania-siły. Przedstawiono dane dla losowego fragmentu dsDNA o długości 1298 bp oraz 247 bp (wstawka), rozciągniętego za pomocą osiowych pęset optycznych. Punkty danych dopasowano do zmodyfikowanego modelu WLC zgodnie z równaniem 3 (linie ciągłe), co pozwoliło wyznaczyć efektywne długości persistencji wynoszące odpowiednio 34 nm dla fragmentu 1298 bp i 25 nm dla fragmentu 247 bp.

Dyskusja

Konwencjonalne pęsety optyczne opierają się na analogowym lub sterowanym komputerowo sprzężeniu zwrotnym w celu przyłożenia stałej siły do obiektu refrakcyjnego. Systemy aktywnego sprzężenia zwrotnego mają trudności z działaniem w warunkach, w których występują gwałtowne zmiany wydłużenia próbki, na przykład w wyniku wiązania białka z DNA lub szybkiego przesuwania się motoru molekularnego wzdłuż filamentu. Ostatnio opracowano różne pasywne metody przyłożenia stałych sił. Jedna z nich, wykorzystana do rozdzielenia kroków ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki/Sprzęt	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
laser Nd:YVO4	Spectra Physics	T40-Z-106C
Deflektor akustyczno-optyczny	IntraAction	DTD-274HA6
Obiektyw mikroskopu	Olympus	PlanApo	60X, NA 1,4
Stolik piezoelektryczny	Mad City Labs	Nano-LP100	stół XYZ
kamera CCD	PixeLink	PL-A741
Fotodetektor	Technologia elektrooptyczna	ET-3020
Kuleczki polistyrenowe	Spherotech	SVP-08-10	800 nm, powlekane streptawidyną
przeciwciało anty-digoksygeninowe	Roche	11333089001	Z owcy
Startery	operon MWG	Oligonukleotydy na zamówienie	Jeden starter: biotyna Inny: digoksigenina
Odczynniki do PCR	New England Biolabs	polimeraza Taq, dNTP
Kryształy szkiełce podstawowej	Fisher Scientific
Inne odczynniki chemiczne do buforu	Fisher Scientific
Materiały uzupełniające
A. Hydrodynamiczny współczynnik tarcia C–wydajny
Do wyznaczenia tarcia hydrodynamicznego c–Współczynnika mikrosfery w pobliżu powierzchni można użyć następującego rozwinięcia5,10:
gdzie wprowadzono następujące skróty:
Tarcie c–Współczynnik jest definiowany w odniesieniu do lepkości cieczy η oraz promień mikrosfery, przy czym środek mikrosfery znajduje się w odległości η powyżej powierzchni. Suma zbiega w stopniu zadowalającym przy rozwinięciu do około dziesięciu wyrazów.
B. Wpływ pozycji osiowej na kalibrację sztywności
Kalibracja sztywności pułapki wiąże się z kompromisem między dokładnością kalibracji, która wzrasta wraz ze zwiększeniem odległości od powierzchni, a rzeczywistą pozycją osiową, w której pułapka jest wykorzystywana eksperymentalnie. Generalnie kalibrację pułapki przeprowadza się w odległości około 800–1000 nm od powierzchni, co stanowi wartość większą niż w rzeczywistych warunkach eksperymentalnych.
C. Zmodyfikowany model łańcucha przypominającego robaka (WLC)
Krzywe siła-rozciągnięcie można dopasować do zmodyfikowanego modelu WLC, który uwzględnia efekty wykluczania objętościowego przy zerowej sile optycznej, w następujący sposób:
gdzie Foptymalizacja siłą optyczną, Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.o jest parametrem dopasowania dla rozciągnięcia przy zerowej sile,Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.optymalizacja czy rozciąganie odbywa się pod wpływem siły, l jest długością konturową DNA, a l*p jest drugim parametrem dopasowania dla "skuteczny" długość persystencyjna Fwlc jest określony przez standardowy model WLC11 gdzie ε jest relatywną elongacją DNA.