Selekcja i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z dorosłych fibroblastów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół skutecznego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) za pomocą wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz identyfikacji poprawnie przeprogramowanego hiPSC poprzez barwienie na żywo przeciwciałem Tra-1-81.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy protokół przeprogramowania ludzkich dorosłych fibroblastów w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) za pomocą wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) w obecności maślanu sodu ^1-3. Użyliśmy tej metody do przeprogramowania opóźnionych pasaży (>p10) ludzkich dorosłych fibroblastów pochodzących od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Repozytorium Coriell). Podejście do przeprogramowania obejmuje wysoce wydajny protokół transdukcji wykorzystujący powtarzalne wirowanie fibroblastów w obecności pożywki zawierającej wirusa. Przeprogramowane kolonie hiPSC zidentyfikowano za pomocą barwienia immunologicznego na żywo dla Tra-1-81, markera powierzchniowego komórek pluripotencjalnych, oddzielonego od nieprzeprogramowanych fibroblastów i ręcznie pasażowanego ^4,5. Te hiPSC zostały następnie przeniesione na płytki Matrigel i wyhodowane w warunkach wolnych od podajnika, bezpośrednio z płytki przeprogramowującej. Począwszy od pierwszego pasażu, kolonie hiPSC wykazują charakterystyczną morfologię podobną do hES. Korzystając z tego protokołu, ponad 70% wybranych kolonii może być z powodzeniem rozrastanych i przekształcanych w linie komórkowe. Ustalone linie hiPSC wykazywały charakterystyczne markery pluripotencji, w tym markery powierzchniowe TRA-1-60 i SSEA-4, a także markery jądrowe Oct3/4, Sox2 i Nanog. Przedstawiony tutaj protokół został opracowany i przetestowany przy użyciu dorosłych fibroblastów uzyskanych od pacjentów z ataksją Friedreicha i osobników kontrolnych ⁶, ludzkich nowonarodzonych fibroblastów, a także ludzkich keratynocytów.

Protokół

1. Produkcja i transdukcja wirusa

1. Płytka komórek Phoenix Ampho o gęstości ~7-8x10⁶ na 10 cm płytki w 10 ml pożywki DMEM (DMEM o wysokiej glukozie, 10% FBS inaktywowany termicznie, 2 mM L-glutamina, bez antybiotyków). Umieścić w inkubatorze i hodować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .
2. Następnego dnia transfekuj komórki Phoenix za pomocą 12 μg wektora kodującego Oct3/4, Sox2, Klf4, c-myc lub gen GFP (plazmidy Addgene 17217, 17218, 17219, 17220) i 35 μl Fugene 6. Przygotuj mieszankę transfekcyjną w 500 μl pożywki DMEM (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 2 mM L-glutaminy, bez FBS i antybiotyków). Inkubować 20 min. Delikatnie pipetuj kompleksy DNA do 10-centymetrowych płytek zawierających 70-80% zlewających się komórek Phoenixa.
3. Zastąp pożywkę 6 - 8 godzin po transfekcji pożywką DMEM (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% FBS inaktywowany termicznie, 2 mM L-glutaminy) zawierającą penicylinę i streptomycynę.
4. Następnie należy zebrać pożywkę zawierającą wirusa 4 razy w odstępach 12 godzin, połączyć wszystkie porcje i przefiltrować za pomocą filtra 0,45 μm w celu usunięcia oderwanych komórek i zanieczyszczeń (pożywki zawierające cząsteczki wirusa można przechowywać w lodówce przez 2 tygodnie bez utraty aktywności zakaźnej, jednak zamrażanie nie jest zalecane).
5. W przypadku transdukcji retrowirusowej należy posączyć dorosłe fibroblasty ludzkie (pasaż 10, Coriell Laboratories) z zamrożonego zapasu 24 godziny przed ostatnim dniem pobierania pożywek retrowirusowych. Wysiewaj komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 1x10⁵ komórek na dołek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, penicyliny, streptomycyny i aminokwasów endogennych.
6. Następnego dnia zastąp pożywkę DMEM pożywką zawierającą cząstki wirusa uzyskane z komórek Phoenix. Dodać pożywkę wirusową (po 1 ml każdej pożywki Oct4, Sox2, Klf4 i c-myc, łącznie 4 ml) uzupełnioną 6 μg/ml polibrenu do każdej studzienki 6-dołkowej płytki kultur fibroblastów i odwirować przy 1600 g przez 1 godzinę w temperaturze 20°C. Około 12 godzin po transdukcji zastąpić pożywkę wirusową pożywką do hodowli fibroblastów. Wykonaj infekcję wirusową i odwirowanie 3 razy w odstępach 24-godzinnych.
7. Hodowla fibroblastów w pożywce DMEM przez 48 godzin po ostatnim zakażeniu. Sprawdź skuteczność infekcji poprzez równoległe transdukcje z pożywką retrowirusową wykazującą ekspresję GFP. Rycina 1 ilustruje skuteczność infekcji retrowirusowej ludzkiego fibroblastu wspomaganej przez wirowanie.

2. Przeprogramowanie

1. Przygotować 6-dołkowe płytki z napromieniowanymi γ warstwami podajnika MEF, wysiewając komórki MEF o gęstości ~ 2x10⁵ komórek na dołek 6-dołkowej płytki poddanej działaniu żelatyny w pożywce wzrostowej fibroblastów. Następnego dnia rozszczepić zakażone ludzkie fibroblasty za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA i wysiać je w gęstości ~1,2x10⁴ na dołek w pożywce wzrostowej fibroblastów.
2. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką hES (DMEM/F12, 20% Knockout Serum Replacement Replacement, aminokwasy endogenne, penicylina/streptomycyna, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 20 ng/ml bazalnego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), uzupełniony 0,5 mM maślanu sodu przez pierwsze 7 dni przeprogramowania. Zmieniaj media codziennie.
3. Codziennie monitoruj zmiany morfologiczne w transdukowanych komórkach. Kolonie komórek podobnych do hiPS zaczną pojawiać się około 5 - 10 dni po przeniesieniu transdukowanych fibroblastów na komórki zasilające. Kolonie hiPSC są gotowe do wyizolowania po około 14 - 28 dniach od posiewu na komórkach zasilających MEF.

3. Izolacja kolonii hiPSC

1. Dzień przed pobraniem kolonii hiPSC należy przygotować 24-dołkowe płytki z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi MEF (~4x10;⁴ komórki na dołek) w pożywce wzrostowej fibroblastów. Na tym etapie kolonie hiPSC mogą być również przenoszone do hodowli bezpaszowej za pomocą Matrigel i pożywki mTeSR1.
2. Przed izolacją kolonii hiPSC należy przygotować płytki MEF, usuwając pożywkę wzrostową fibroblastów i przepłukując MEF-y PBS w celu usunięcia śladów FBS. Następnie dodać 0,5 ml pożywki hES (lub pożywki mTeSR1 w przypadku studzienek pokrytych Matrigelem) z 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 do każdej studzienki ^7,8.
3. W razie potrzeby usuń fibroblasty otaczające kolonie hiPSC za pomocą igły o rozmiarze 21 pod mikroskopem zamontowanym w kapturze z przepływem laminarnym (ryc. 2A - C). Przepłukać płytki PBS i dodać świeże pożywki hES zawierające przeciwciało specyficzne dla Tra-1-81 StainAlive (1:200, Stemgent). Po 30 minutach należy zastąpić pożywkę zawierającą przeciwciało świeżą pożywką hES uzupełnioną 10 μM inhibitorem ROCK. Zbadaj płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym i oznacz dodatnie kolonie Tra-1-81 za pomocą markera obiektywu (ryc. 2D).
4. Pociąć kolonie Tra-1-81 dodatnie hiPSC pod mikroskopem w kapturze laminarnym, na kilka małych kawałków za pomocą igły o rozmiarze 21, jak pokazano na rysunku 2E i F.
5. Za pomocą automatycznej pipety (P200) przenieś fragmenty kolonii hiPSC do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki z MEF lub Matrigel. Unikaj przenoszenia komórek innych niż hiPS. Umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO₂ i pozwól koloniom hiPSC przyczepić się przez 24-36 godzin.
6. Codziennie zmieniaj pożywkę hES lub mTeSR1 (dla kolonii hodowanych na Matrigel). Kolonie hiPSC o prawidłowej morfologii podobnej do hES będą widoczne po 48 godzinach od początkowego przeniesienia na płytkę 24-dołkową.
7. Ręcznie przechodź kolonie hiPSC co 6 - 8 dni na 12-dołkową, a następnie na 6-dołkową płytkę.
8. Po ekspansji klonalnej i ustaleniu linii hiPSC przeanalizuj ekspresję markerów pluripotencji TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2 i Nanog za pomocą immunocytochemii, jak pokazano na rysunku 3. Ocena integralności genomowej i potencjału różnicowania otrzymanych linii za pomocą analiz tworzenia kariotypu i potworniaka ^6,9.

4. Reprezentatywne wyniki

Efektywna transdukcja za pomocą nośników zawierających retrowirusy jest kluczowa dla udanego przeprogramowania. Zaleca się przeprowadzenie całej procedury transfekcji/infekcji przy użyciu wirusa eksprymującego GFP przy każdym pojedynczym eksperymencie przeprogramowania w celu monitorowania skuteczności, jak pokazano na rysunku 1. Miano wirusa wykazującego ekspresję GFP oznaczone, jak opisano w ^{punkcie 10}, poprzez transdukcję ludzkich fibroblastów przy użyciu nieskoncentrowanych pożywek wirusowych, mieściło się zwykle w zakresie 0,5 - 5 x 10⁷ cząstek wirusa na ml (vp/ml).

Fibroblasty zmieniają morfologię już po 2 dniach od ostatniej infekcji. Trypsynizowane ludzkie fibroblasty należy dokładnie policzyć przed wysiewem ich na komórki zasilające MEF. Zaleca się wysiewanie komórek o 3 różnych gęstościach (6x10³, 1,2x10⁴, 2,5x10⁴ na pojedynczy dołek płytki 6-dołkowej), ponieważ każda linia komórkowa wykazuje inną charakterystykę wzrostu, a gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie dla skuteczności przeprogramowania. Maślan sodu stosowany przez początkowe 7 - 14 dni przeprogramowania zwiększa efektywność tworzenia hiPSC około 5-krotnie. Często, zwłaszcza gdy zakażone fibroblasty zostały wysiane w większej gęstości, komórki podobne do fibroblastów mogą przerastać szalkę hodowlaną i pokrywać kolonie hiPSC, jak pokazano na rysunku 2A. W takim przypadku warstwę fibroblastów można ostrożnie podnieść i usunąć, aby odsłonić kolonie hiPSC (ryc. 2B). Następnie kolonie hiPSC należy przepłukać pożywką hES i wybarwić przeciwciałem Tra-1-81. W zależności od komórek fibroblastów, około 20 - 40% kolonii wykazujących morfologię podobną do iPSC nie barwi się przeciwciałem Tra-1-81. Zidentyfikowane kolonie hiPSC mogą być przenoszone z płytki w ciągu najbliższych 12 - 24 godzin. Długotrwała inkubacja spowoduje szybkie różnicowanie hiPSC. Kolonie mogą być ręcznie przenoszone na komórki zasilające MEF lub płytki pokryte Matrigelem. Po ekspansji ustalone klony hiPSC należy przebadać przy użyciu immunocytochemii (ICC) pod kątem ekspresji markerów pluripotencji, jak pokazano na rycinie 3. Dodatkowo szczegółowa charakterystyka molekularna wygenerowanych linii komórkowych iPS powinna obejmować: analizy ekspresji genu pluripotencji za pomocą RT-PCR, wykazanie demetylacji DNA na promotorach genów pluripotencji oraz analizy wyciszenia transgenów ⁹.

Rysunek 1. Skuteczność transdukcji wirusa określona za pomocą GFP eksprymującego retrowirusa. (A, B) Ludzkie dorosłe fibroblasty pochodzące od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Coriell Repository) zostały uwidocznione po dwóch kolejnych infekcjach pożywką retrowirusową GFP. (C, D) Ludzkie fibroblasty zostały zakażone tą samą partią pożywki retrowirusowej GFP, a następnie odwirowano komórki bezpośrednio na płytkach 6-dołkowych przez 1 godzinę w dawce 1600 g. Zdjęcia zostały wykonane 48 godzin po zakażeniu.

Rysunek 2. Identyfikacja i izolacja kolonii hiPSC. (A) Obraz z kontrastem fazowym płytki zawierającej hiPSC otoczonej fibroblastami. Komórki hodowano przez 21 dni na pożywkach hES. (B, C) Ta sama kolonia hiPSC po usunięciu otaczającej warstwy fibroblastów. (D) Prawidłowo przeprogramowane kolonie hiPSC identyfikuje się przez barwienie na żywo przeciwciałem markerowym Tra-1-81, przecina się je za pomocą sterylnej igły (E, F) i przenosi do oddzielnych studzienek na płytce 24-dołkowej.

Rysunek 3. Ekspresję markerów specyficznych dla pluripotencji Oct3/4, Nanog, Sox2, SSEA4 i Tra-1-60 w hiPSC określono za pomocą immunocytochemii.

Dyskusja

Badanie chorób człowieka, zwłaszcza neurologicznych i neurodegeneracyjnych, było szczególnie trudne ze względu na brak dostępu do odpowiednich modeli komórkowych człowieka. Możliwość przeprogramowania łatwo dostępnych komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste oraz możliwość różnicowania ich w różne typy komórek otworzyły możliwość tworzenia komórkowych modeli chorób genetycznych. Ponadto iPSC są bardzo obiecujące w przyszłości medycyny regeneracyjnej. Dlatego tak ważne jest opracowanie i opty...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	11965
DMEM/F12	Invitrogen	11330
KSR	Invitrogen	10828
Aminokwasy endogenne	Invitrogen	11140
Maślan sodu	Sigma-Aldrich	B5887
Y27632	Stemgent	04-0012
bFGF	Przeciwciało Stemgent	03-0002
Tra-1-81	Przeciwciało Stemgent	09-0069
Oct3/4	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-8628
Technologia sygnalizacji komórkowej	przeciwciała Nanog	4903S Przeciwciało
Tra-1-60	EMD Millipore	MAB4360
Technologia sygnalizacji komórkowej	przeciwciała Sox2	3579S
SSEA4	EMD Milipore	MAB4304
CF1 MEFs	Globalstem	GSC-6201G
Marker celu	Nikon Instruments	MBW10010
Matrigel	BD Biosciences	354277
mTeSR1	Stem Cell Technologies	05850
β-mercapt– tanol	Sigma-Aldrich	M7522
Fugene 6	Roche Group	11814443001
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Marker obiektu	Nikon Instruments	MBW10010