Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) w obecności maślanu sodu 1-3. Metodę tę zastosowaliśmy do przeprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych o późnym pasażu (>p10) pochodzących od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Coriell Repository). Podejście do przeprogramowania obejmuje wysoce wydajny protokół transdukcji z wykorzystaniem powtarzalnego wirowania fibroblastów w obecności pożywek zawierających wirusa. Przeprogramowane kolonie hiPSC zidentyfikowano za pomocą immunobarwienia żywych komórek na Tra-1-81, marker powierzchniowy komórek pluripotencjalnych, oddzielono od nieprzeprogramowanych fibroblastów i poddano ręcznemu pasażowaniu 4,5. Następnie hiPSC przeniesiono na płytki z Matrigel i hodowano w warunkach bez fibroblastów pokarmowych (feeder-free), bezpośrednio z płytki do przeprogramowania. Od pierwszego pasażu kolonie hiPSC wykazują charakterystyczną morfologię przypominającą ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hES). Stosując ten protokół, ponad 70% wybranych kolonii można pomyślnie rozwinąć i ustanowić jako linie komórkowe. Ustanowione linie hiPSC wykazywały charakterystyczne markery pluripotencji, w tym markery powierzchniowe TRA-1-60 i SSEA-4, a także markery jądrowe Oct3/4, Sox2 i Nanog. Przedstawiony tutaj protokół został opracowany i przetestowany z użyciem fibroblastów dorosłych pobranych od pacjentów z ataksją Friedreicha oraz osób z grupy kontrolnej 6, ludzkich fibroblastów noworodkowych, a także ludzkich keratynocytów.
Protokół
1. Produkcja i transdukcja wirusa
- Wysiać komórki Phoenix Ampho w gęstości ~7-8x106 na płytkę 10 cm w 10 ml pożywki DMEM (DMEM high glucose, 10% FBS inaktywowanego ciepłem, 2 mM L-glutaminy, bez antybiotyków). Umieścić w inkubatorze i hodować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO22.
- Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek Phoenix, używając 12 μg wektora kodującego gen Oct3/4, Sox2, Klf4, c-myc lub GFP (plazmidy Addgene 17217, 17218, 17219, 17220) oraz 35 μl Fugene 6. Przygotować mieszaninę do transfekcji w 500 μl pożywki DMEM (DMEM z wysoką zawartością glukozy, 2 mM L-glutaminy, bez FBS i antybiotyków). Inkubować przez 20 min. Delikatnie nanieść kompleksy DNA pipetą na płytki 10 cm zawierające komórki Phoenix o konfluencji 70-80%.
- Wymień medium 6–8 h po transfekcji na medium DMEM (DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS inaktywowanego termicznie, 2 mM L-glutaminy) zawierające penicylinę i streptomycynę.
- Następnie należy zebrać medium zawierające wirusa czterokrotnie w odstępach 12-godzinnych, połączyć wszystkie frakcje i przefiltrować za pomocą 0.45 μm przefiltrować w celu usunięcia oderwanych komórek i resztek komórkowych (pożywkę zawierającą cząsteczki wirusowe można przechowywać w lodówce przez 2 tygodnie bez utraty aktywności infekcyjnej, jednak mrożenie nie jest zalecane).
- W celu transdukcji retrowirusowej, 24 godziny przed ostatnim dniem pobierania pożywki z retrowirusami, wysiać ludzkie fibroblasty dorosłego człowieka (pasaż 10, Coriell Laboratories) z zamrożonego banku komórek. Komórki wysiać na płytki 6-dołkowe pokryte żelatyną z gęstością 1x105 liczba komórek na dołek w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, penicyliną, streptomycyną oraz nieistotnymi aminokwasami.
- Następnego dnia należy wymienić pożywkę DMEM na pożywkę zawierającą cząsteczki wirusowe otrzymane z komórek Phoenix. Należy dodać pożywkę z wirusem (po 1 ml pożywki dla każdego z czynników: Oct4, Sox2, Klf4 i c-myc, łącznie 4 ml), uzupełnioną o 6 μg/ml polybrene do każdego dołka płytki 6-dołkowej z kulturami fibroblastów i odwiruj przy 1600 g przez 1 h w temperaturze 20°COkoło 12 h po transdukcji należy wymienić pożywkę wirusową na pożywkę do hodowli fibroblastów. Infekcję wirusową oraz wirowanie należy przeprowadzić 3 razy w odstępach 24-godzinnych.
- hodować fibroblasty w medium DMEM przez 48 h po ostatniej infekcji. Sprawdzić wydajność infekcji poprzez równoległe transdukcje medium retrowirusowym wykazującym ekspresję GFP. Rycina 1 przedstawia wydajność wspomaganej odwirowaniem infekcji retrowirusowej fibroblastów ludzkich.
2. Reprogramowanie
- Przygotować płytki 6-dołkowe z warstwami pożywkowymi MEF naświetlonych promieniami γ, wysiewając komórki MEF w gęstości ~2x105 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej potraktowanej żelatyną, w pożywce do wzrostu fibroblastów. Następnego dnia rozdzielić zainfekowane ludzkie fibroblasty przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA i wysiać je w gęstości ~1,2x104 na dołek w pożywce do wzrostu fibroblastów.
- Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę hES (DMEM/F12, 20% Knockout Serum Replacement, aminokwasy nieessentialne, penicylina/streptomycyna, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), uzupełnioną o 0,5 mM maślanu sodu przez pierwsze 7 dni reprogramowania). Pożywkę wymieniać codziennie.
- Codziennie monitorować zmiany morfologiczne w transdukowanych komórkach. Kolonie komórek typu hiPS zaczną pojawiać się mniej więcej 5–10 dni po przeniesieniu transdukowanych fibroblastów na komórki pożywkowe. Kolonie hiPSC są gotowe do izolacji około 14–28 dni po wysianiu ich na warstwę pożywkową MEF.
3. Izolacja kolonii hiPSC
- Na dzień przed pobraniem kolonii hiPSC przygotuj płytki 24-dołkowe z naświetlanymi γ-promieniowaniem komórkami żYWnymi MEF (~4x104 komórek na dołek) w pożywce do wzrostu fibroblastów. Na tym etapie kolonie hiPSC można również przenieść do hodowli bez warstwy karmnej, wykorzystując Matrigel oraz pożywkę mTeSR1.
- Przed izolacją kolonii hiPSC przygotuj płytki z MEF, usuwając pożywkę do wzrostu fibroblastów i płucząc MEF w PBS w celu usunięcia śladów FBS. Następnie do każdego dołka dodaj 0,5 ml pożywki hES (lub pożywki mTeSR1 w przypadku dołków pokrytych Matrigelem) z dodatkiem 10 μM inhibitora ROCK Y27632 7,8.
- W razie potrzeby usuń fibroblasty otaczające kolonie hiPSC za pomocą igły 21G pod mikroskopem zamontowanym w komorze z laminarnym przepływem powietrza (Rysunek 2A - C). Przepłucz płytki PBS i dodaj świeżą pożywkę hES zawierającą swoiste przeciwciało StainAlive przeciwko Tra-1-81 (1:200, Stemgent). Po 30 min. zastąp pożywkę z przeciwciałem świeżą pożywką hES uzupełnioną o 10 μM inhibitora ROCK. Obejrzyj płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym i zaznacz kolonie pozytywne pod kątem Tra-1-81 za pomocą markera zewnętrznego (Rysunek 2D).
- Pod mikroskopem w komorze laminarnej podziel pozytywne pod kątem Tra-1-81 kolonie hiPSC na kilka małych fragmentów, używając igły 21G, jak pokazano na Rysunkach 2E i F.
- Za pomocą pipety automatycznej (P200) przenieś fragmenty kolonii hiPSC do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej z MEF lub Matrigelem. Unikaj przenoszenia komórek innych niż hiPS. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2, pozwalając koloniom hiPSC przytwierdzić się przez 24-36 h.
- Codziennie wymieniaj pożywkę hES lub mTeSR1 (dla kolonii hodowanych na Matrigelu). Kolonie hiPSC o prawidłowej morfologii przypominającej hES będą widoczne 48 h po pierwotnym przeniesieniu na płytkę 24-dołkową.
- Ręcznie pasażuj kolonie hiPSC co 6-8 dni na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową.
- Po ekspansji klonalnej i ustanowieniu linii hiPSC przeanalizuj ekspresję markerów pluripotencji TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2 i Nanog za pomocą immunocytochemii, jak pokazano na Rysunku 3. Oceń integralność genomową i potencjał różnicowania uzyskanych linii za pomocą analiz kariotypu i tworzenia teratoma 6,9.
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajna transdukcja przy użyciu mediów zawierających retrowirusy jest kluczowa dla pomyślnego przeprogramowania. Zaleca się przeprowadzanie całej procedury transfekcji/infekcji z użyciem wirusa wykazującego ekspresję GFP podczas każdego pojedynczego eksperymentu z przeprogramowaniem, aby monitorować wydajność, jak pokazano na Rysunku 1. Miano wirusa wykazującego ekspresję GFP, wyznaczone zgodnie z opisem w 10 poprzez transdukcję ludzkich fibroblastów przy użyciu niekoncentrowanych mediów wirusowych, mieściło się zazwyczaj w zakresie 0,5 - 5 x 107 cząsteczek wirusowych na ml (vp/ml).
Fibroblasty zmieniają morfologię już 2 dni po ostatniej infekcji. Trypsynizowane ludzkie fibroblasty należy starannie policzyć przed wysianiem ich na warstwę komórek dokarmiających MEF. Zaleca się wysiewanie komórek w 3 różnych gęstościach (6x103, 1,2x104, 2,5x104 na pojedynczą studzienkę płytki 6-dołkowej), ponieważ każda linia komórkowa wykazuje inną charakterystykę wzrostu, a gęstość wysiewu jest krytyczna dla wydajności reprogramowania. Maślan sodu stosowany przez pierwsze 7 – 14 dni reprogramowania zwiększa wydajność tworzenia hiPSC około 5-krotnie. Często, zwłaszcza gdy zainfekowane fibroblasty zostały wysiane w wyższej gęstości, komórki fibroblastopodobne mogą nadmiernie rozrosnąć się w naczyniu hodowlanym i przykryć kolonie hiPSC, jak pokazano na Rysunku 2A. W takim przypadku warstwę fibroblastów można ostrożnie zdjąć i usunąć, aby odsłonić kolonie hiPSC (Rysunek 2B). Następnie kolonie hiPSC należy przepłukać medium hES i zabarwić przeciwciałem Tra-1-81. W zależności od komórek fibroblastów, około 20 – 40% kolonii wykazujących morfologię typu iPSC nie barwi się przeciwciałem Tra-1-81. Zidentyfikowane kolonie hiPSC można przenieść z płytki w ciągu kolejnych 12 – 24 h. Przedłużona inkubacja doprowadzi do szybkiej różnicowania hiPSC. Kolonie można pasażować ręcznie na komórki dokarmiające MEF lub płytki powlekane Matrigelem. Po ekspansji ustalone klony hiPSC powinny zostać przebadane za pomocą immunocytochemii (ICC) pod kątem ekspresji markerów pluripotencji, jak przedstawiono na Rysunku 3. Dodatkowo szczegółowa charakterystyka molekularna wygenerowanych linii komórek iPSC powinna obejmować: analizy ekspresji genów pluripotencji za pomocą RT-PCR, wykazanie demetylacji DNA w promotorach genów pluripotencji oraz analizy wyciszania transgenów 9.
Rysunek 1. Efektywność transdukcji wirusowej określona przy użyciu retrowirusa wykazującego ekspresję GFP. (A, B) Ludzkie fibroblasty dorosłych pochodzące od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Coriell Repository) zobrazowano po dwóch następujących po sobie infekcjach medium retrowirusowym GFP. (C, D) Ludzkie fibroblasty zainfekowano tą samą partią medium retrowirusowego GFP, a następnie poddano wirowaniu komórek bezpośrednio na płytkach 6-dołkowych przez 1h przy 1600g. Obrazy zarejestrowano 48h po infekcji.
Rycina 2. Identyfikacja i izolacja kolonii hiPSC. (A) Obraz w kontraście fazowym płytki zawierającej hiPSC otoczone fibroblastami. Komórki były hodowane przez 21 dni na pożywce hES. (B, C) Ta sama kolonia hiPSC po usunięciu otaczającej warstwy fibroblastów. (D) Prawidłowo przeprogramowane kolonie hiPSC są identyfikowane za pomocą barwienia żywych komórek przeciwciałem do markera powierzchniowego Tra-1-81, wycinane za pomocą sterylnej igły (E, F) i przenoszone do oddzielnych studni płytki 24-dołkowej.
Rysunek 3. Ekspresję markerów specyficznych dla pluripotencji Oct3/4, Nanog, Sox2, SSEA4 oraz Tra-1-60 w hiPSC określono za pomocą immunocytochemii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie chorób ludzkich, zwłaszcza neurologicznych i neurodegeneracyjnych, było szczególnie trudne ze względu na brak dostępu do odpowiednich ludzkich modeli komórkowych. Możliwość przeprogramowania łatwo dostępnych komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste oraz potencjał do ich różnicowania w różnorodne typy komórek otworzyły możliwość tworzenia modeli komórkowych chorób genetycznych. Ponadto iPSC niosą ze sobą wielką obietnicę dla przyszłości medycyny regeneracyjnej. Dlatego kluczowe jest o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Friedreich’s Ataxia Research Alliance oraz grant pilotażowy od Arnold Family Foundation i The Center for Stem Cells and Developmental Biology w M.D. Anderson Cancer Center.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Niezbędne aminokwasy | Invitrogen | 11140 | |
| Maślan sodu | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Przeciwciało Tra-1-81 | Stemgent | 09-0069 | |
| Przeciwciało Oct3/4 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Przeciwciało Nanog | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Przeciwciało Tra-1-60 | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Przeciwciało Sox2 | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Marker obiektywu | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-merkapto–etanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Marker obiektu | Nikon Instruments | MBW10010 |
Bibliografia
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
