Izolowanie komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Cytometria przepływowa to potężne narzędzie pozwalające na izolację i badanie określonych populacji komórek. Protokół ten opisuje etapy izolowania komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ślimaka od nowonarodzonych myszy transgenicznych. Zdysocjowane komórki ślimaka znakowano za pomocą sprzężonych z fluorescencyjnymi substratami β-galaktozydazy przed rozdzieleniem za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Izolacja określonych typów komórek pozwala na analizę rzadkich populacji komórek, takich jak komórki macierzyste/progenitorowe. Takie podejście do badania tkanek ucha wewnętrznego stanowi wyjątkowe wyzwanie ze względu na niedostatek interesujących komórek i niewiele transgenicznych modeli myszy reporterowych. Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący sondy sprzężone z fluorescencją do selektywnego znakowania komórek LacZ-dodatnich ze ślimaka noworodka.

Najczęstszą patologią niedosłuchu odbiorczego jest nieodwracalne uszkodzenie i utrata komórek rzęsatych czuciowych ślimaka, które są niezbędne do przekształcania fal dźwiękowych w impulsy nerwowe. Najnowsze dowody sugerują, że mysie narządy słuchowe i przedsionkowe zawierają komórki macierzyste/progenitorowe, które mogą mieć potencjał regeneracyjny^1,2. Odkrycia te uzasadniają dalsze badania, w tym identyfikację określonych typów komórek o charakterystyce komórek macierzystych/progenitorowych. Wykazano, że szlak sygnałowy Wnt odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu populacji komórek macierzystych/progenitorowych w kilku układach narządów^3-7. Niedawno zidentyfikowaliśmy komórki reagujące na Wnt wyrażające Axin2 w ślimaku noworodka, ale ich funkcja jest w dużej mierze nieznana⁸.

Aby lepiej zrozumieć zachowanie tych komórek reagujących na Wnt in vitro, opracowaliśmy metodę izolowania komórek wyrażających ekspresję Axin2 od ślimaków myszy reporterowych Axin2-LacZ⁹. Używając cytometrii przepływowej do wyizolowania komórek Axin2-LacZ dodatnich ze ślimaka noworodka, mogliśmy z kolei przeprowadzić różne eksperymenty na żywych komórkach, aby zbadać ich zachowanie jako komórek macierzystych / progenitorowych. Tutaj szczegółowo opisujemy etapy mikrodysekcji ślimaka noworodka, dysocjacji tych tkanek, znakowania komórek LacZ-dodatnich za pomocą substratu fluorogenicznego i sortowania komórek. Techniki dysocjacji ślimaków na pojedyncze komórki i izolowania komórek ślimaka za pomocą cytometrii przepływowej zostały opisane^2,10-12. Dokonaliśmy modyfikacji tych technik, aby ustanowić nowy protokół izolowania komórek wykazujących ekspresję LacZ ze ślimaka noworodka.

Protokół

1. Mikrodysekcja ślimaka

1. Przygotuj mikroskop preparacyjny pod maską, przecierając powierzchnie 70% etanolem i układając bloki lodu.
2. Przygotuj 10-15 szalek Petriego o średnicy 35 mm w sterylnych warunkach i napełnij do połowy (~2 ml) sterylnym roztworem soli Hanka z wapniem (HBSS).
3. Przygotować dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm w sterylnych warunkach i napełnić do połowy (~2 ml) sterylnym roztworem buforowanym 1x fosforanem (PBS).
4. Sterylizuj mikrokleszcze w stożkowej tubie Falcon o pojemności 50 ml z 70% etanolem.
5. W pomieszczeniu oddzielonym od sterylnego kaptura użyj nożyczek do tęczówki, aby odciąć głowy 12-15 pourodzeniowym (P) 0-3-dniowym myszom reporterowym Axin2^LacZ/+ i umieść głowy na 60-milimetrowej szalce Petriego na bloku lodu.
6. Za pomocą kleszczy Dumont #5 i nożyczek do tęczówki wytnij żuchwę i język oraz przetnij podstawę czaszki na poziomie podniebienia.
7. Usuń leżącą na powierzchni skórę kalwarii i przeciąć podstawę czaszki, wkładając nożyczki w dolnej części otworu wielkiego do środka podniebienia.
8. Wykonaj kolejne nacięcie nożyczkami do tęczówki od przyciętej krawędzi podniebienia do górnej części kalwarii po obu stronach, uważając, aby nie uszkodzić torebki usznej.
9. Całkowita izolacja kości skroniowej poprzez wykonanie dwóch nacięć pod kątem 45 stopni, zaczynając od górnej części otworu wielkiego, rozciągając się do cięcia koronalnego na podniebieniu twardym.
10. Umieścić izolowane kości skroniowe na 35-milimetrowych szalkach Petriego zawierających HBSS na bloku lodu.
11. Zbierz kości skroniowe z około 12-15 zwierząt, które zostały złożone w ofierze, co daje w sumie 24-30 kości skroniowych.
12. Przenieść szalkę Petriego z wyizolowanymi kośćmi skroniowymi do uprzednio przygotowanego sterylnego kaptura preparacyjnego (1.1).
13. Przenieść cztery kości skroniowe na każdą wstępnie przygotowaną płytkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą HBSS (1.2) i umieścić na bloku lodu.
14. Rozpocznij mikrodysekcję za pomocą dwóch kleszczy #55, aby delikatnie usunąć korę, pień mózgu i móżdżek w kości skroniowej pokrywającej torebkę uszną.
15. Nie usuwając torebki usznej, należy odciąć część torebki ślimakowej, zaczynając od wejścia nerwu przedsionkowo-ślimakowego do torebki usznej.
16. Po odsłonięciu podstawy ślimaka delikatnie wyciągnij ślimak i otaczające go tkanki. Usuń pozostały zwój spiralny i rozstęp naczyniowy zaczynający się u podstawy.
17. Przenieść ślimak na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą PBS na bloku lodu.
18. Aby zapewnić optymalną żywotność tkanek, całkowity czas rozwarstwienia powinien być krótszy niż 60 minut.
19. Powtórz powyższe kroki dla 3-5 myszy typu dzikiego (WT) P0-P3 jako kontrolnych dla myszy Axin2-LacZ.

2. Dysocjacja komórek (zmodyfikowana z wcześniej opisanych metod)^2,10

1. Umieścić 50 μl sterylnego PBS na środku studzienki w 6-dołkowym niepowlekanym naczyniu hodowlanym.
2. Przenieś do 20 ślimaków Axin2^LacZ/+ do każdej kropli 50 μl PBS. Nową kroplę PBS o wielkości 50 μl należy zastosować na więcej niż 20 ślimaków.
3. Podgrzej 50 μl porcji 0,125% trypsyny przez ~2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
4. Dodaj 50 μl wstępnie podgrzanej 0,125% trypsyny do PBS zawierającego ślimaki.
5. Umieść 6-dołkowe naczynie w temperaturze 37°C na 8 minut, uważając, aby nie wstrząsnąć naczyniem.
6. Aby zakończyć trypsynizację, dodaj 50 μl inhibitora trypsyny sojowej do każdych 100 μl kropli.
7. Dodać dodatkowe 50 μl pożywki Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicyliny w DMEM/F12)²
8. Używając końcówki pipety o pojemności 300 μl z pipetarem p200 ustawionym na 125 μl, delikatnie rozetrzyj komórki 80 razy, uważając, aby nie powstały pęcherzyki.
9. Po roztarciu każdej kropli dodać dodatkowe 200 μl FM do każdej studzienki.
10. Przepuść komórki przez niebieskie sitko Falcona o wielkości 40 μm do nowej studzienki.
11. Przenieś komórki do standardowych probówek Falcon FACS (około 300 μl pozostaje po rozcieraniu i filtracji).
    1. Podziel komórki ślimaka typu dzikiego na trzy probówki, rozcieńczając 100 μl z 300 μl FM w każdej probówce. Jedna probówka zostanie użyta jako ślepa próba kontrolna, druga zostanie wybarwiona tylko jodkiem propidyny (PI, 1 μg/ml) (nie dodawać na tym etapie), podczas gdy ostatnia zostanie wybarwiona 3-karboksyumbelliferylem β-D-galaktopyranozydem (CUG, patrz 2.15) w celu wykrycia fluorescencji tła.
    2. Umieść 400 μl zdysocjowanych komórek ślimaka Axin2-LacZ w każdej probówce FACS. Jako kontrolę tylko dla CUG, rozcieńczyć 10 μl komórek w 390 μl FM (patrz probówka F w kroku 2.15). Doprowadzić objętość pozostałych probówek do 400 μl.
12. Inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 37°C przez 10 minut.
13. Przygotuj roztwór CUG:
    1. Przygotuj 200 μl CUG dla każdej probówki FACS wymagającej barwienia.
    2. Rozcieńczyć CUG w FM 1:50 w ciemnym kapturze przy minimalnej ekspozycji na światło.
    3. Podgrzej rozcieńczony CUG w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.
14. Następnie dodaj 200 μl rozcieńczonego CUG do każdej odpowiedniej probówki FACS. W przypadku rur, które nie są przeznaczone do CUG, dodaj tylko FM (patrz 2.15).
15. W tym momencie powinno istnieć pięć kategorii probówek o następującej zawartości (nie dodawaj PI na tym etapie):
    1. Typ dziki - bez CUG lub PI (w celu uzyskania kompensacji, patrz krok 3.5-6)
    2. Wildtype - tylko z PI (za wynagrodzeniem)
    3. Typ dziki - z CUG i PI (do kontroli przeciwko komórkom Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - tylko z CUG (do kompensacji)
    5. Axin2-LacZ - z CUG i PI (do właściwego sortowania komórek)
    6. Axin2-LacZ - z CUG i PI (do analizy zdarzeń)
16. Chroń wszystkie probówki przed światłem i inkubuj je w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37°C przez 25 minut.
17. Przygotować świeży roztwór HEPES + płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zatrzymania reakcji po inkubacji:
    1. Rozcieńczyć 400 μl świeżo rozmrożonego FBS w 10 ml sterylnego 10 mM HEPES (w PBS) w 15 ml probówce Falcon.
    2. Umieść rurkę na lodzie do zakończenia 2.16.
18. Dodaj 1,8 ml lodowatego roztworu HEPES do każdej probówki FACS pod sterylnym kapturem przy wyłączonym świetle, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
19. Wirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut.
20. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl FM, zebrać wszystkie podwielokrotności dla próbki sortującej (Axin2-LacZ barwionej CUG i PI).
21. Dodaj PI do każdej probówki, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/ml.
22. Umieść komórki na lodzie i chroń przed światłem.

3. Cytometria przepływowa

1. Używamy samolotu BD Aria II wyposażonego w lasery 488-nm, 633-nm i 407-nm. Wykrywanie CUG przeprowadzono za pomocą fioletowego lasera 407 nm, a PI za pomocą niebieskiego lasera 488 nm w Stanford Shared FACS Facility.
2. Wymagany jest przeszkolony operator cytometru przepływowego. Przejdź do kolejnego kroku po rozgrzaniu laserów, skalibrowaniu detektorów cytometru zgodnie z instrukcjami producenta i ustawieniu optymalnych parametrów sortowania. Z naszego doświadczenia wynika, że użycie dyszy o średnicy 100 μm optymalizuje żywotność komórek w kolejnych eksperymentach.
3. Zastosowano następujące parametry: próg przy 5 000 zdarzeń, natężenie przepływu mniejsze niż 3 000 zdarzeń na sekundę, rozproszenie do przodu (FSC) przy 125 woltach i rozproszenie boczne (SSC) przy 250 woltach, kanał PE-Cy5 został użyty dla PI i Cascade Blue dla CUG.
4. Przepłukać komorę cytometru 70% etanolem i PBS dwa razy w tej kolejności.
5. Rozpocznij analizę od niebarwionych komórek typu dzikiego (rura A w kroku 2.15). Zbierz 1 000 zdarzeń, aby określić rozkład komórek na wykresie FSC i SSC. Jeśli rozproszenie nie jest pożądane, dostosuj parametry FSC i SSC.
6. Wykonaj kompensację za pomocą niebarwionych ogniw WT (rurka A), WT barwionych PI (probówka B) i komórek Axin2-LacZ (rurka D) barwionych CUG. Kompensacja pozwoli na dokładniejszą dyskryminację sygnału między różnymi długościami fal lasera.
7. Rozpocznij analizę od komórek wybarwionych PI i CUG typu dzikiego (probówka C) i ustaw parametry bramkowania dla:
   1. Wykluczenie gruzu na podstawie wykresu FSC i SSC.
   2. Wykluczenie dubletów i kęp przy użyciu wykresu wysokości FSC w porównaniu z wykresem obszaru FSC.
   3. Wykluczenie martwych komórek na podstawie powierzchni FSC w porównaniu z powierzchnią PE-Cy5.
   4. Ustaw wykres obszaru FSC w porównaniu z obszarem kaskadowym niebieskim z dowolnym umieszczeniem bramy.
8. Następnie przeanalizuj 10 000 zdarzeń z probówki z próbką sortowania, która zawiera komórki barwione Axin2-LacZ PI i CUG (probówka F).
   1. W tym miejscu należy zastosować wszystkie bramki ustawione przy użyciu komórek typu wildtype.
   2. Korzystając z wykresów dla komórek typu dzikiego, utwórz bramki dla komórek kaskadowych o wysokiej wysokości niebieskiej, które stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby zdarzeń.
   3. Te same bramki Cascade Blue-high obejmują teraz około 15-20% komórek w próbce Axin2-LacZ, tworząc te komórki o wysokości Axin2.
   4. Korzystając z wykresu analizy komórek Axin2-LacZ, utwórz bramkę dla najmniej fluorogenicznych 15-20% komórek, odtąd komórek o niskim poziomie Axin2-low.
9. Opierając się na wyżej wymienionej strategii bramkowania, posortuj komórki do probówek FACS zawierających 500 μl FM, jednej probówki dla komórek o wysokim poziomie Axin2, a drugiej dla komórek o niskiej zawartości Axin2. Upewnij się, że probówki zbiorcze znajdują się w komorze schłodzonej do 4°C podczas sortowania.
10. Rekordowa liczba komórek zliczonych za pomocą cytometru przepływowego dla każdej populacji.

4. Reprezentatywne wyniki (patrz Rysunek 2):

Za pomocą powyższego protokołu, zazwyczaj odzyskujemy 40-45% komórek wolnych od zanieczyszczeń zarówno ze ślimaków typu dzikiego, jak i Axin2^LacZ/+ (Rysunki 2A i B), przy czym około 70% z nich jest wolnych od dubletów (patrz Rysunki 2A' i B'). Większość posortowanych komórek jest żywotna i nie pobiera PI (~95%) (ryc. 2A'' i B''). Średnio górne ~ 20% komórek CUG-dodatnich uważa się za komórki Axin2-LacZ-dodatnie (ryc. 2B ''') i korelują z około 15 000 komórek o wysokim poziomie Axin2-LacZ na 10-12 zwierząt.

Analiza ponownego sortowania komórek o wysokiej zawartości Axin2 wykazała czystość większą niż 93% w kanale Cascade Blue. Aby dodatkowo potwierdzić tożsamość tych komórek, przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne po sortowaniu zarówno komórek Axin2-high, jak i Axin2-low przy użyciu przeciwciał anty-β-galaktozydazy i stwierdziliśmy, że komórki Axin2-high zawierały ~ 93,4% komórek β-galaktozydazo-dodatnich (więcej niż 1,500 analizowanych komórek) i że komórki Axin2-low zawierały ~ 4,8% komórek β-galaktozydazo-dodatnich.

Rysunki i tabele:

Rysunek 1.Paradygmat eksperymentalny. Powyższy rysunek przedstawia ogólną strategię i techniki eksperymentalne opisane w sekcji protokołu. Ślimaki od myszy typu dzikiego i^{Axin2 LacZ / +} są zbierane i dysocjowane na pojedyncze komórki, które następnie traktowano CUG, fluorescencyjnym substratem dla β-galaktozydazy. Komórki Axin2-LacZ-high i -low zostały następnie oddzielone za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć pełnowymiarową wersję tego obrazu.

Rysunek 2.Strategie bramkowania. Rysunek ten ilustruje zastosowane strategie bramkowania cytometrii przepływowej. A) Zdysocjowane komórki typu dzikiego, które zostały poddane takiemu samemu traktowaniu jak komórki Axin2-LacZ, są tutaj analizowane przy użyciu łącznie 10 000 zdarzeń. Pierwszy panel przedstawia obszar rozproszenia bocznego (SSC-A) w porównaniu z obszarem rozproszenia przedniego (FSC-A). W tym przypadku wyraźna grupa zdarzeń ma znacznie większy rozmiar niż zdarzenia znajdujące się bliżej osi y. Zdarzenia te są oznaczone jako "Debris Negative". Następna bramka, A', analizuje komórki "Debris Negative" z panelu A, co stanowi 43,8% całkowitej liczby zdarzeń (patrz tabela poniżej). W tym panelu wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) w stosunku do FSC-A jest używana do wykluczania dubletów. Zdarzenia odbiegające od oczekiwanego linearnego charakteru fabuły są wykluczone. To przygotowanie zwykle daje ~70% zdarzeń w wyznaczonej bramce, a pozostałe komórki są wykluczane. W panelu A'' jodek propidyny (PI) wykrywany przez kanał PE-Cy5 jest używany do znakowania martwych komórek (5,3%). W następnym panelu (A''') niebieski kanał kaskadowy jest używany do wykrywania substratu fluorescencyjnego CUG. W tym przypadku bramki o wysokości LacZ obejmują mniej niż 1% wszystkich zdarzeń. B) Zdysocjowane komórki myszy Axin2-LacZ leczonych CUG i PI są tutaj analizowane przy użyciu łącznie 10 000 zdarzeń. Stosowane są tutaj identyczne bramki z panelu A. B' pokazuje, że 29,5% komórek jest wykluczonych jako dublety, podczas gdy B'' pokazuje, że 5,4% nie jest zdolnych do życia. Początkowe bramki dla komórek LacZ-high i -low są rysowane za pomocą panelu B''' z LacZ-high początkowo ustawionym na 19,7% i LacZ-low na 20,4%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić pełnowymiarową wersję tego obrazu.

    Numer zdarzenia procent ZA Analiza typu dzikiego 10 000 szt.   A' Gruz ujemny 4 381 szt. 43,80% A'' Dublet Negatyw 3 116 osób 71,10% A''' PI Ujemny 2 951 osób 94,70%   LacZ-wysoki 16 0.54%   LacZ-low 2 790 szt. 94,50% W Analiza Axin2-LacZ 10 000 szt.   B' Gruz ujemny 4 218 osób 42,2 proc. B'' Dublet Negatyw 2 973 TGL 70,50% B''' PI Ujemny 2 813 osób 94,6%   LacZ-wysoki Okręg wyborczy 553 TGL 19,70%   LacZ-low Okręg wyborczy 573 TGL 20,40%

Tabela 1. Analizy ilościowe strategii bramkowania na rysunku 2.

Dyskusja

Niezależne badania naukowe wykazały ograniczoną zdolność regeneracyjną w ślimakach noworodków^2,10,12,13. Korzystając z myszy reporterowych GFP i cytometrii przepływowej, White i współpracownicy wyizolowali specyficzne komórki podporowe ślimaka i stwierdzili, że mają one cechy komórek progenitorowych¹².

Wykazano, że kanoniczny szlak Wnt oznacza populacje komórek macierzystych / progenitorowych w wielu układach narządów, w tym w mózgu, gruczole sutkowym, układzie krwiotwórc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Petriego, polistyren, sterylna Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Sitka do komórek Falcona, sterylne, BD Biosciences, niebieskie, 40 μ m VWR	international	21008-949
Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS). Roztwór z wapniem, magnezem i bez czerwieni fenolowej, sterylne	VWR international	45000-456
probówki wirówkowe Cellstar, polipropylen, sterylne, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Probówki wirówkowe Cellstar, polipropylen, sterylne, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 Suplement bez serum (50x), płynny	Suplement Invitrogen	17504-044
N-2 (100x), płynny	Invitrogen	17502-048
bFGF, czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy ludzki	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, insulinopodobny czynnik wzrostu-1 z myszy	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, naskórkowy czynnik wzrostu ludzki	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 50/50 Mix: 1X, z L-glutaminą i 15 mM HEPES VWR	international	45000-350
BD Rurki okrągłodenne Falcon, jednorazowe, polistyren, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsyna, 0,25% (1X) z EDTA 4Na, płyn	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Inhibitor trypsyny, soja, oczyszczona	Worthington Biochemical	LS003570
	BD Biosciences	21008-949
Płytki wielodołkowe, polistyren, Greiner Bio-One, płytki niepoddane obróbce, 6 dołków VWR	international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ Zestaw do wykrywania beta-galaktozydazy	Marker Gene Technologies	M0255