Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interferencja RNA jest potężną metodą badania funkcji genów, szczególnie gdy jest prowadzona w skali całego genomu i w ujęciu ilościowym. W przypadku C. elegans funkcję genu można wyciszyć w prosty i wydajny sposób, podając nicieniom bakterie wykazujące ekspresję dsRNA odpowiadającego konkretnemu genowi 1. Choć stworzenie bibliotek klonów RNAi obejmujących większość genomu C. elegans 2,3 otworzyło drogę do prawdziwych badań nad genomiką funkcjonalną (patrz na przykład 4-7), większość ugruntowanych metod jest pracochłonna. Moy i współpracownicy opracowali półautomatyczne protokoły, które ułatwiają przesiewy w skali całego genomu 8. Podejście to opiera się na obrazowaniu mikroskopowym i analizie obrazu.
W niniejszym pracy opisujemy alternatywny protokół wysokoprzepustowego przesiewania całego genomu, opartego na robotycznym przetwarzaniu klonów bakteryjnych RNAi, analizie ilościowej z wykorzystaniem urządzenia COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) oraz zintegrowanym oprogramowaniu MBioLIMS (Laboratory Information Management System firmy Modul-Bio) – technologii zapewniającej zwiększoną przepustowość w zakresie zarządzania danymi i śledzenia próbek. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie przesiewania na płytkach z podłożem stałym. Jest to szczególnie istotne w niektórych badaniach, takich jak te dotyczące interakcji gospodarz-patogen w C. elegans, ponieważ niektóre mikroby nie infekują efektywnie nicieni w kulturach płynnych.
Przedstawiamy sposób wykorzystania tej metody do ilościowej oceny znaczenia genów w nieswoistej odporności przeciwgrzybiczej u C. elegans. W tym przypadku podejście opiera się na zastosowaniu szczepu transgenicznego niosącego epidermalny, indukowalny infekcją fluorescencyjny gen reporterowy, w którym GFP znajduje się pod kontrolą promotora genu peptydy przeciwgrzybiczego nlp 29, oraz czerwony fluorescencyjny reporter wyrażany konstytutywnie w naskórku. Ten drugi służy jako wewnętrzna kontrola funkcjonalnej integralności naskórka oraz nieswoistego wyciszania transgenu9. W przypadku zakażenia grzybem nicienie kontrolne wykazują zieloną fluorescencję. Wyciszenie za pomocą RNAi genu niezbędnego do ekspresji nlp 29 prowadzi do zmniejszenia fluorescencji po zakażeniu. Obecnie protokół ten pozwala na przetestowanie i analizę ponad 3000 klonów RNAi tygodniowo, co otwiera możliwość przesiewania całego genomu w czasie krótszym niż 2 miesiące.
Protokół
Protokół opisany poniżej jest podzielony na etapy realizowane w ciągu pięciu kolejnych dni (Ryc. 1). Jak zauważono, niektóre kroki mogą być wykonane w inne dni. Czas trwania każdego etapu, a także ilość wymaganego materiału (np. nicieni, bakterii, pożywek) będą zależeć od liczby płytek 96-dołkowych poddawanych badaniu podczas jednego eksperymentu.
Dzień 1
1. Przygotowanie płytek NGM RNAi z 96 dołkami
Poniższy protokół został opracowany na podstawie standardowej metody przygotowywania płytek do hodowli nicieni 10, która zawiera szczegółowe informacje na temat technik sterylizacji poszczególnych roztworów.
- Dla 10-12 płytek 96-dołkowych przygotować 100 mL pożywki do wzrostu nicieni (Nematode Growth Media, NGM) w zdejonizowanej wodzie H2O: 1,7 g BactoAgar, 0,29 g NaCl, 0,25 g peptonu, 100 μL cholesterolu (5 mg/mL w EtOH).
- Autoklawować NGM (5 min w 121°C dla 100 mL; 30 min w 121°C dla 4 L) i schłodzić do temperatury około 50°C (na tyle, aby można było utrzymać naczynie w dłoni). Ważne jest, aby NGM pozostała wystarczająco ciepła, by nie uległa zestaleniu.
- Do 100 mL dodać: 2,5 mL buforu fosforanowego pH6 (1M), 100 μL MgSO4 (1M), 100 μL CaCl2 (1M), 400 μL IPTG (1M), 100 μL ampicyliny (100 mg/mL), 100 μL tetracykliny (12,5 mg/mL w EtOH).
- Rozdzielić 75 μL NGM do każdego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej. Aby uniknąć zestalenia pożywki, należy ją dozować szybko; wygodne jest użycie dozownika wielokrotnego (np. Repeatman, Eppendorf). Należy upewnić się, że w dołkach nie ma pęcherzyków powietrza.
- Płytki natychmiast przechowywać w komorze wilgotnej (np. w pojemniku Tupperware z mokrymi ręcznikami papierowymi na dnie) w temperaturze 4°C.
Uwaga: płytki można przygotować z wyprzedzeniem do jednego tygodnia i przechowywać w temperaturze 4°C; może to ułatwić organizację kolejnych etapów.
2. Zautomatyzowane przygotowanie płytek LB 96-DeepWell
- Przygotować i rozdzielić 1,5 mL LB zawierającego Ampcyklinę 100μg/mL i Tetracyklinę 12,5 μg/mL do każdej studni płytki 96-DeepWell o maksymalnej pojemności 2 mL/studnię. Rozdzielanie jest optymalizowane przy użyciu robotycznego systemu do obsługi cieczy (np. TECAN), ale w razie potrzeby można je przeprowadzić ręcznie.
- Nałożyć pokrywkę na każdą płytkę i przechowywać w temperaturze 4°C. W celu śledzenia każdej płytki 96-dołkowej, na tym etapie lub później, należy dodać unikalną etykietę lub kod kreskowy.
Uwaga: płytki można przygotować z wyprzedzeniem od 2 do 3 dni i przechowywać w temperaturze 4°C; może to ułatwić organizację kolejnych etapów.
3. Hodowla klonów bakteryjnych RNAi w 96-dołkowych płytkach głębokich z pożywką LB (kultura nocna)
- Aby ułatwić dalszą pracę, w przypadku gdy oryginalne klony biblioteki RNAi znajdują się w formacie 384-dołkowym, należy najpierw przenieść klony do opisanych lub zakodowanych kreskowo standardowych płytek 96-dołkowych zawierających pożywkę LB z dodatkiem 100 μg/mL Amp i 12,5 μg/mL Tet oraz glicerolu (stężenie końcowe 10%). W sytuacji, gdy oryginalne płytki 384-dołkowe nie zawierają klonów we wszystkich dołkach, co ma miejsce w przypadku najczęściej stosowanej biblioteki „Ahringer”, istnieje kilka opcji organizacji płytek potomnych. Klony można rozdzielić w taki sposób, aby w płytkach potomnych nie było pustych dołków, co zminimalizuje liczbę płytek do przesiewania. Idealnie jednak podczas replikacji w każdej płytce potomnej powinno pozostać kilka pustych dołków, które następnie zostaną wypełnione standardowymi klonami kontrolnymi (pozytywnymi i negatywnymi), co ułatwi porównania między płytkami. Tak przygotowane 96-dołkowe płytki potomne są następnie wykorzystywane do zaszczepienia płytek 96-DeepWell LB w celu hodowli przez noc (ON).
Wszystkie etapy dozowania cieczy najlepiej przeprowadzić za pomocą zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy (np. Tecan), ale można je również wykonać ręcznie, używając na przykład replikatora 96-pinowego. Jeśli klony biblioteki RNAi znajdują się już w formacie 96-dołkowym, należy przejść do kroku 3.5.
- Inkubować 96-dołkowe płyty potomne RNAi w temperaturze 37°C przy mieszaniu (200 rpm) przez 14-15 godzin.
- Zweryfikować prawidłowy wzrost bakterii i zidentyfikować klony, które nie urosły. Będą one wykluczone z późniejszych analiz. Idealnie byłoby zmierzyć OD600 w każdym dołku, jednak można to zrobić poprzez prostą inspekcję wizualną.
- Przechowywać 96-dołkowe płyty potomne RNAi w temperaturze -80°C do momentu użycia.
- Rozmrozić 96-dołkowe płyty zawierające klony RNAi w temperaturze pokojowej. Płyty można następnie przechowywać w 4°C do czasu użycia.
- Przenieść 3 μL każdego klonu bakteryjnego z 96-dołkowej płyty powtórzeniowej do 96 dołków odpowiednio oznakowanej/zakodowanej płyty 96-DeepWell LB zawierającej 1,5 mL LB z dodatkiem 100 μg/mL Amp i 12,5 μg/mL Tet. Klony bakteryjne do kontroli wydajności RNAi, takie jak klon gfp(RNAi) w niniejszym przykładzie, oraz kontrole negatywne można wprowadzić ręcznie do dowolnego wolnego dołka.
- Przykryć płyty 96-DeepWell folią przylepną (np. folią do kultur komórkowych AeraSeal firmy Dutscher). Używaną 96-dołkową płytę powtórzeniową odłożyć do -80°C.
- Oznakowane płyty 96-DeepWell inkubować w 37°C przy mieszaniu (200 rpm przez 14-15 godzin).
Dzień 2
4. Wysiewanie bakteryjnych klonów RNAi na 96-dołkowe płytki NGM RNAi
Ten krok należy wykonać rano, po nocnej inkubacji kultury.
- Wyjmij 96-dołkowe płytki NGM z temperatury 4°C i pozostaw je do ogrzania i wyschnięcia przez 5-15 min w sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Nie pozostawiaj płytek zbyt długo pod dygestorium (maksymalnie 30 min), ponieważ w przeciwnym razie podłoże NGM może później popękać. Przypisz odpowiednią etykietę/kod kreskowy do każdej płytki.
- Wyjmij 96-dołkowe płytki DeepWell z hodowlą ON z temperatury 37°C. Zapisz pozycje wszystkich pustych dołków (pusty dołek jest całkowicie przezroczysty); zostaną one wykluczone z późniejszych analiz.
- Wirować płytki 96-DeepWell przez 5 min przy 4000 rpm.
- Usunąć naddatek przez gwałtowne odwrócenie płytki do góry dnem i szybko osuszyć krawędzie płytki ręcznikiem papierowym. Ponieważ hodowle zawierają bakterie rekombinowane, naddatek musi być utylizowany zgodnie z lokalnymi przepisami (np. autoklawowany).
- Resuspender osad bakteryjny w pozostałej cieczy (około 50 μL) za pomocą wortexowania, najlepiej używając dedykowanego mieszadła (np. Tecan), aby każda płytka została poddana dokładnie takiemu samemu traktowaniu. Możliwe jest zmierzenie OD600 każdego dołka w celu precyzyjnej standaryzacji inokulum bakteryjnego do następnego kroku, ale nie jest to niezbędne i nie przeprowadzamy takiej kontroli.
- Przenieść 5 μL resuspenderowanych bakterii na 96-dołkowe płytki NGM, używając 8- lub 12-kanałowej pipety wielokanałowej. Należy uważać, aby nie dotknąć ani nie przebić podłoża NGM. Krok ten jest wykonywany ręcznie, ale można go zoptymalizować, używając robota, takiego jak Liquidator96 (Rainin), który umożliwia rozdzielenie 96 klonów RNAi w jednym kroku.
- Pozostawić bakterie do wyschnięcia w sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, regularnie sprawdzając, czy podłoże NGM nie wyschło zbyt mocno. Krok ten powinien zająć około 2 godzin.
- Inkubować 96-dołkowe płytki RNAi-NGM przez noc (ON) w temperaturze 37°C w komorze wilgotnościowej.
5. Przygotowanie zsynchronizowanej populacji nicieni
W tym kroku wykorzystujemy nicienie transgeniczne niosące interesujące geny reporterowe (np. konstrukt pnlp-29::GFP indukowany infekcją oraz, jako kontrolę wewnętrzną, konstytutywny konstrukt transgenu pcol-12::dsRed). Ze względu na obserwowany spadek ekspresji transgenu w czasie, rozmrażamy świeże partie nicieni co 6 tygodni. Hodujemy nicienie przez co najmniej 2 pokolenia przed użyciem i upewniamy się, że zwierzęta nie przechodziły głodówki przed analizą. Jeśli drugi dzień protokołu przypada we wtorek, przygotowujemy nicienie w piątek, umieszczając 30 młodych dorosłych osobników na 9 cm płytce NGM z wysianymi bakteriami OP50 w temperaturze 20°C; będą one gotowe do poddania procesowi wybielania we wtorek (patrz Tabela 1).
- Przeprowadź odbarczanie robaków zgodnie ze standardowym protokołem 10.
- Pozostaw jaja do wyklucia w medium M9 w temperaturze 25°C przez noc z mieszaniem, aby uzyskać zsynchronizowaną populację larw L1.
Dzień 3
6. Rozdzielenie nicieni na 96-dołkowe płytki RNAi-NGM w celu karmienia i RNAi
Ten krok należy przeprowadzić rano. Zsynchronizowane nicienie w stadium L1 są rozdzielane na każdą kolonię bakterii w płytce 96-dołkowej w celu karmienia i przeprowadzenia RNAi.
- Wyjmij 96-dołkowe płytki RNAi-NGM z temperatury 37°C i pozostaw je w temperaturze pokojowej do ostygnięcia.
- Wyjmij wybielone nicienie z temperatury 25°C. Oszacuj liczbę nicieni w 2 μL i dostosuj objętość za pomocą M9, aby uzyskać około 100-120 nicieni na 2 μL (w przybliżeniu jedna kropla).
- Rozdziel ręcznie 2 μL nicieni w stadium L1 do każdego dołka, używając dozownika wielokrotnego. Sprawdź każdy dołek pod kątem obecności nicieni (powinny być widoczne nicienie pływające w cieczy).
- Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza (maksymalnie 1 godzina). Regularnie sprawdzaj płytki; nicienie muszą pełzać, a nie pływać. Należy zachować ostrożność, aby podłoże NGM nie wyschło zbyt mocno, gdyż w przeciwnym razie może popękać.
- Umieść płytki w temperaturze 25°C w komorze wilgotnościowej.
7. Testowanie zarodników Drechmeria coniospora pod kątem skutecznej infekcji
Ten krok jest specyficzny dla obecnego badania przesiewowego. Polega on na testowaniu różnych partii zarodników w celu wyselekcjonowania tych o wysokiej zakaźności. Dlatego należy go przeprowadzić jak najbliżej 4. dnia, czyli dnia infekcji. Konieczne jest wcześniejsze przygotowanie odpowiedniej liczby nicieni w stadium L3-L4 do tych testów (Tabela 1). Szczegółowe metody hodowli D. coniospora zostały opisane w innym opracowaniu 11.
- Zebrać zarodniki z próbki każdej kultury grzyba w niewielkiej objętości pożywki M9.
- Nanieść kroplę każdej zawiesiny zarodników na płytkę NGM o średnicy 35 mm wysianą szczepem OP50 i pozostawić do wyschnięcia.
- Dodać 30-40 nicieni w stadium L3-L4 niosących interesujący gen reporterowy (np. pnlp-29::GFP).
- Umieścić zainfekowane płytki w temperaturze 25°C na noc.
- Następnego dnia sprawdzić indukcję GFP u nicieni i wybrać partię grzyba, która wykazuje najsilniejszą, najszerszą i najbardziej jednorodną indukcję zielonej fluorescencji.
Dzień 4
8. Zakażanie nicieni poddanych działaniu RNAi zarodnikami D. coniospora
Ten etap wykonuje się 30 godzin po podaniu RNAi, gdy nicienie osiągną stadium L3-L4.
- Wyznacz objętość zarodników niezbędną do rozprowadzenia 4 μL na każdą studzienkę.
- Zbierz świeże zarodniki D. coniospora z wybranej partii za pomocą buforu M9. Użyj 8-10 mL buforu M9 na jedną płytkę z zarodnikami o średnicy 9 cm.
- Rozprowadź 4 μL zarodników do każdej studzienki za pomocą dozownika wielokrotnego. Sprawdź obecność zarodników w każdej studzience (nicienie powinny być widoczne w cieczy).
- Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza (ok. 1 godziny). Regularnie sprawdzaj płytki, aż nicienie zaczną się poruszać. Należy uważać, aby podłoże NGM nie wyschło zbyt mocno, gdyż może doprowadzić to do jego pękania.
- Umieść zakażone płytki w temperaturze 25°C w komorze wilgotnościowej.
Dzień 5
9. Obserwacja i przechowywanie płytek przed zautomatyzowaną analizą ilościową
Ten etap rozpoczyna się 18 godzin po infekcji i jest przeprowadzany w piątym dniu. Przewiduje się, że nicienie będą w stadium młodych osobników dorosłych, rozpoczynających składanie jaj. Na tym etapie fenotyp jest oceniany wizualnie: nicienie albo fluorescują na zielono, co odpowiada normalnej sytuacji po infekcji, albo indukcja GFP w danej studzience jest zmieniona, co oznacza, że wyciszony gen zmienia odpowiedź na infekcję.
- Szybko obejrzyj płytki pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Jeśli na płytkach widoczna jest dobra ogólna indukcja GFP, przejdź do następnego kroku; w przeciwnym razie poczekaj do popołudnia na lepszą indukcję, o ile dla nicieni pozostało jeszcze pożywienie.
- Wizualnie oceń każdą płytkę i odnotuj każdą studzienkę z wyraźnym fenotypem (np. brak ekspresji GFP). Dzięki sprawdzeniu wyników uzyskanych dla kontrolnych klonów RNAi, które mogły zostać dodane, ta pierwsza wstępna analiza pozwala określić, czy eksperyment zakończył się sukcesem.
- Za pomocą pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów) przenieś nicienie wraz z 100 μL NaCl 50 mM-Triton 0.05% do nowej, odpowiednio oznakowanej lub okodowanej płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym. Zamroź płytki w temperaturze -80°C do czasu analizy.
- W dniu analizy rozmroź płytki w temperaturze pokojowej i przystąp do zautomatyzowanej analizy przy użyciu COPAS Biosort. Sorter analizuje jedną płytkę w czasie 22 minut. Płytek nie należy pozostawiać w temperaturze pokojowej przez więcej niż godzinę przed analizą i nie można ich ponownie zamrażać.
- Informacje uzyskane z COPAS Biosort zostają przeniesione do pliku Excel w celu pobieżnej weryfikacji jakości danych. Surowe dane z różnymi parametrami zmierzonymi przez COPAS Biosort (gęstość optyczna (ekstynkcja), długość osiowa (czas przelotu), emisje fluorescencji, mierzone jednocześnie przez trzy różne detektory) są następnie przechowywane w dedykowanym pakiecie LIMS (MBio LIMS, Modul-Bio) do późniejszych szczegółowych analiz ilościowych.
10. Reprezentatywne wyniki
Przy zastosowaniu podanych powyżej ilości nicieni i bakterii, pod koniec eksperymentu w większości studzienek wszystkie zwierzęta powinny osiągnąć wiek dorosły, a w każdej z nich wciąż powinno pozostać nieco pokarmu. W tych warunkach w większości studzienek powinny znajdować się również jaja. W każdej studzience powinna znajdować się wystarczająca liczba osobników dorosłych, aby uzyskać dane z systemu Biosort dla co najmniej 50 pojedynczych nicieni. Z drugiej strony, jeśli RNAi jest efektywne, znaczna liczba klonów RNAi wywoła widoczny fenotyp. Na przykład nicienie mogą być nieskoordynowane lub, co bardziej oczywiste, bezpłodne bądź zatrzymać się w rozwoju. Powinno to występować często, tak aby zazwyczaj co najmniej jedna studzienka na płytce 96-dołkowej zawierała nicienie z wyraźnym fenotypem RNAi. Gdy interesującym fenotypem jest ekspresja reporterowego genu GFP, studzience z klonem gfp(RNAi) zapewniają solidną kontrolę (Ryc. 2). Inne fenotypy, takie jak zmiana wielkości, mogą być łatwo zmierzone za pomocą systemu Biosort (Ryc. 3A). Zaobserwowaliśmy, że nicienie mogły migrować do sąsiednich studzienek z bardzo niską częstotliwością (<1%, BS, nieopublikowane wyniki), gdy w danej studzience zabrakło pokarmu.
Wyciszanie funkcji różnych klas genów może wpływać na ekspresję transgenów u C. elegans. Niektóre z nich są wymagane w sposób niespecyficzny dla ekspresji transgenów 12. Inne, takie jak tkankowo specyficzne czynniki transkrypcyjne, na przykład epidermalny czynnik GATA ELT-3 13, będą wymagane w konkretnych podgrupach komórek. Jest to jeden z powodów włączenia do szczepu wykorzystywanego w niniejszym protokole niezależnej i konstytutywnej konstrukcji reporterowej transgenu komórek epidermalnych (pcol-12::dsRed). Pozwala to odróżnić takie geny od tych specyficznie zaangażowanych w badany proces regulacji genów (Ryc. 3B i C). Transgen ten jest ekspresowany we wszystkich stadiach larwalnych. Jeśli badanie obejmuje wykrywanie ekspresji genów w embrionach, wymagany byłby inny kontrolny gen reporterowy.
Jedną z innowacji niniejszego protokołu jest zastosowanie mrożenia płytek w celu odroczenia ich analizy. Mrożenie pozwala na przechowywanie płytek do dwóch tygodni bez istotnej zmiany wyników. Choć bezwzględne wartości mierzonej fluorescencji mogą ulec zmianie, ich stosunki względne pozostają zbliżone (Ryc. 4). Z drugiej strony, RNAi jest z natury zmienną procedurą eksperymentalną 14. Aby uzyskać wiarygodne wyniki i wyeliminować liczne potencjalne wyniki fałszywie dodatnie, przesiewy RNAi muszą zostać powtórzone co najmniej raz. Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, powinna istnieć rozsądna korelacja między wynikami z jednej płytki testowanej w różne dni. W szczególności geny wykazujące silny efekt powinny być wyraźnie możliwe do zidentyfikowania, nawet jeśli ich dokładny efekt ilościowy nie jest identyczny pomiędzy powtórzeniami płytek (Ryc. 5).
Rycina 1. Ogólny schemat typowego eksperymentu.
Rysunek 2. Kontrolne RNAi z użyciem klonu celującego w ekspresję GFP. Transgeniczne nicienie konstytutywnie wykazujące ekspresję reportera pcol-12::dsRed oraz indukowanego reportera pnlp 29::GFP na podłożu stałym w płytce 96-dołkowej, wizualizowane za pomocą mikroskopu stereotypowego GFP z zestawem filtrów umożliwiającym jednoczesną obserwację fluorescencji czerwonej i zielonej. Nicienie były eksponowane na kontrolę (panele górne) lub klon RNAi GFP (panele dolne) przez 48 h. Panele po lewej stronie przedstawiają nicienie niezainfekowane, a po prawej nicienie 18 godzin po infekcji D. coniospora. Pasek skali wynosi 1 mm.
Rycina 3. Analiza ilościowa płytki 96-dołkowej. System COPAS Biosort generuje dane liczbowe dla każdego analizowanego nicienia. Wykresy przedstawiają średnią i odchylenie standardowe dla czasu przelotu (TOF; A), który odpowiada wielkości nicieni 15, fluorescencji czerwonej (B) oraz stosunku (X100) fluorescencji zielonej do TOF (C) u nicieni transgenicznych konstytutywnie wykazujących ekspresję reportera pcol-12::dsRed i indukowanego reportera pnlp 29::GFP, które były hodowane na podłożu stałym w płytce 96-dołkowej z różnymi klonami RNAi przez 48 h, 18 godzin po infekcji D. coniospora. Niektóre klony, takie jak ten zaznaczony strzałką w (A), wywołują wady wzrostu i/lub wpływają na ekspresję pcol-12::dsRed. Inne specyficznie wpływają na ekspresję GFP, co zaznaczono strzałką w (C). Ten konkretny klon celuje w gen nsy 1, o którym wcześniej wykazano, że jest ważny dla regulacji nlp 29 13. Fluorescencję zieloną, czerwoną oraz TOF mierzono w jednostkach arbitralnych, lecz stałych.
Rycina 4. Porównanie danych uzyskanych z próbek żywych i zamrożonych w tym samym eksperymencie. Płytki z nicieniami L4 niosącymi transgeny pnlp-29::GFP i pcol-12::dsRed zostały zainfekowane D. coniospora lub nie. Po 18h każda płytka została podzielona w przybliżeniu na dwie części; połowa została przeanalizowana natychmiast, a druga połowa zamrożona w temperaturze -80°C przez 24h, a następnie rozmrożona i przeanalizowana. Dla każdej próbki obliczono wartości średniego TOF (rozmiar nicieni), EXT (gęstość optyczna) oraz fluorescencji Green i Red. Wykres przedstawia stosunek średniej dla próbek zainfekowanych do niezinfekowanych, odpowiednio dla próbek zamrożonych i żywych (n= 7638 i 5096 oraz 8634 i 3850 nicieni).
Rysunek 5. Analiza porównawcza powtórzonych płytek 96-dołkowychZnormalizowany stosunek fluorescencji (średni stosunek fluorescencji (tutaj: 100*zielona/TOF) dla każdej studzienki podzielony przez przycięty (25th do 75th percentyl) średnia dla każdej płytki) dla każdej studzienki z analiz powtórzonych dla reprezentatywnej płytki 96-dołkowej.
| Materiał | Harmonogram eksperymentu |
| Czwartek
|
Tabela 1. Przykład eksperymentu jednocyklowego z 30 płytkami.
Przedstawiono materiały niezbędne do przeprowadzenia jednego cyklu eksperymentalnego z wykorzystaniem 30 płytek oraz harmonogram eksperymentu od kroku 1 do kroku 12, rozłożony na 9 dni.
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM), 100 mL:
| 0,3 g | NaCl |
| 0,25 g | BactoPeptone |
| 2 g | BactoAgar |
| 100 μL | 5 mg/mL cholesterolu w EtOH |
| Dopełnić wodą dejonizowaną do 100 ml | |
| Autoklawować przez 5 minut w temperaturze 121°C i pozostawić do ochłonięcia, a następnie dodać: | |
| 100 μL | 1 M MgSO₄4 |
| 100 μL | 1 M CaCl22 |
| 2,5 ml | 1 M $\text{K}_2\text{PO}_4$4 pH 6,0 |
Podłoże NGM do traktowania RNAi w płytce 96-dołkowej, 100 mL:
| 0,29 g | NaCl |
| 0,25 g | Baktopepton |
| 1,7 g | BactoAgar |
| 100 μL | 5 mg/mL cholesterolu w EtOH |
| Dopełnić wodą dejonizowaną do 100 ml | |
| Autoklawować przez 5 minut w temperaturze 121 °C i pozostawić do ostygnięcia, a następnie dodać: | |
| 100 μL | 1 M MgSO44 |
| 100 μL | 1 M CaCl22 |
| 2,5 ml | 1 M KPO4 pH 6,0 |
| 400 μL | 1 M IPTG |
| 100 μL | Ampicylina 100 mg/ml |
| 100 μL | 12,5 mg/ml tetracykliny |
Roztwór wybielacza, 5mL:
2,5 mL H2O
2,3 mL wybielacza
0,2 mL NaOH 50%
NaOH 50%, 100 mL:
50 g NaOH
Dopełnić do 100 mL wodą dejonizowaną
NaCl 50mM-Triton 0,05%, 400 mL:
4 mL NaCl 5 M
1 mL Triton 20%
Dopełnić wodą dejonizowaną do 400 mL
Triton 20%, 10 mL:
2 mL Triton X-100
8 mL wody dejonizowanej
Bufor M9, 1L
6 g Na2HPO4 (MW : 178)
3 g KH2PO4 (MW : 136)
5 g NaCl
Dopełnić wodą dejonizowaną do 1 L
Autoklawować
Dodać 1 mL MgSO4 1 M
Pożywka Luria Broth (LB), 1L:
10 g BactoTryptone
20 g ekstraktu drożdżowego
10 g NaCl
Dopełnić do 1 L wodą dejonizowaną
Autoklawować
1 M MgSO4, 300 mL:
73,95 g MgSO4
Dopełnić wodą dejonizowaną do 300 mL
Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej
Cholesterol 5 mg/mL, 200 mL:
1 g cholesterolu
Dodać 100% EtOH do 200 mL
Przefiltrować w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze pokojowej
1 M CaCl2, 500 mL:
27,75 g CaCl2
Dodać wodę dejonizowaną do objętości 500 mL
Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze pokojowej
1 M KPO4 pH 6.0, 4 L:
517 g KH2PO4 (MW : 136)
207 g K2HPO4 (MW : 174)
Dopełnić wodą dejonizowaną do 4 L
Ampicylina (Amp), 100 mg/mL, 10 mL:
1 g Ampicyliny
Dopełnić wodą dejonizowaną do 10 mL
Przechowywać w temperaturze -20 °C
1 M izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG), 10 mL:
2,38 g IPTG
Dodać wodę dejonizowaną do objętości 10 mL
Przechowywać w temperaturze -20 °C
Tetracyklina 12,5 mg/mL, 100 mL
1,25 g Tetracykliny
Dodać 100% EtOH do 100 mL
Tabela 2. Roztwory.
Dyskusja
Niniejszy protokół umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych badań przesiewowych RNAi u C. elegans na podłożach stałych, wykorzystując poziom ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego jako odczyt. Został on zoptymalizowany z wykorzystaniem narzędzi automatycznych w celu ułatwienia analiz wysokoprzepustowych, co pozwala na łatwą i szybką obsługę dużej liczby próbek w sposób wydajny, niezawodny i powtarzalny. Opisano również inne metody, które w mniejszym stopniu opierają się na zautomatyzowanym dozowaniu próbek ciekłych 8.
Kluczowym aspektem organizacyjnym protokołu było opracowanie niezawodnej metody śledzenia próbek poprzez adaptację komercyjnego oprogramowania MBioLIMS do procedury przesiewowej RNAi, we współpracy z firmą ModulBio. Na każdym etapie procedury płytki są obecnie identyfikowane za pomocą kodów kreskowych generowanych w systemie LIMS. Ponieważ LIMS rejestruje również tożsamość klonów w każdej studzince na każdej płytce, przejście od studzinki do potencjalnego genu jest proste. Co więcej, LIMS łączy się z bazą danych społeczności WormBase, umożliwiając bezpośredni dostęp do danych molekularnych i funkcjonalnych dla dowolnego genu. LIMS ułatwia również przeprowadzanie analiz na poziomie płytki, a nawet chromosomu i całego genomu. W przypadku tych analiz dane są przechowywane w sposób w pełni kompatybilny z wcześniej opisanymi narzędziami, takimi jak COPAmulti 16.
Kluczowym punktem eksperymentalnym w tej metodzie jest dostosowanie ilości pożywki do liczby nicieni. W wielu analizach niezbędne jest, aby nicienie nie głodowały pod koniec eksperymentu, jednak równie ważne jest, aby na początku nie było zbyt dużo pożywki. Zaobserwowaliśmy, że wysoka gęstość pożywki zmniejsza indukcję fluorescencji w protokole z wykorzystaniem nicieni niosących reporter pnlp-29::GFP. Może to odzwierciedlać obniżoną wydajność infekcji w przypadku hodowli nicieni w zbyt dużej ilości bakterii (BS, wyniki nieopublikowane). Jednocześnie istotne są warunki hodowli bakterii RNAi, ponieważ determinują one, czy dsRNA jest produkowane na optymalnym poziomie. Niektóre protokoły dla RNAi na dużą skalę wymagają hodowli klonów RNAi na płytkach agarowych przed zaszczepieniem kultur płynnych 8. Uzyskaliśmy skuteczne wyciszanie genów, pomijając ten krok. Zdecydowaliśmy się na hodowlę nadmiarowej ilości każdej kultury, aby zapewnić jednorodne wyniki. Opisany protokół w rzeczywistości dostarcza wystarczającego materiału do przeprowadzenia 2 lub 3 przesiewów równolegle. Jednak w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych wyników preferujemy przeprowadzanie przesiewów w dubletach, wykorzystując niezależne kultury nicieni, bakterii RNAi oraz zarodników grzybów.
Kolejnym krytycznym krokiem jest zastosowanie podłoża, które nie jest ani zbyt wilgotne, ani zbyt suche. Jeśli płytki nie są wystarczająco suche, bakterie RNAi nie wysychają prawidłowo i nicienie będą pływać podczas testu. Może to powodować problemy. Na przykład nicienie nie są efektywnie infekowane przez D. coniospora w cieczy (C. Couillault, nieopublikowane wyniki). Z drugiej strony, na suchych płytkach zwiększa się osmolarność pożywki hodowlanej. Ma to bezpośredni wpływ na fizjologię nicieni 17, w tym na indukcję niektórych genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak nlp 29 18. Objętość używana do nakładania nicieni i zarodników jest kluczowa dla zapewnienia skutecznego i szybkiego wyschnięcia. Jeśli do świeżych płytek doda się więcej niż 10 μL cieczy, do wyschnięcia studni może być potrzebnych wiele godzin. Może to utrudniać stosowanie metod robotycznych do nakładania nicieni na płytki. Na przykład urządzenie Biosort dozuje każdego nicienia w około 1 μL cieczy. Obecnie rozdzielamy nicienie ręcznie, co pozwala nam również przezwyciężyć tendencję nicieni w roztworze do sedymentacji.
Wcześniej zgłosiliśmy modyfikację urządzenia Biosort, która pozwoliła na analizę jednej płytki 96-dołkowej w ciągu 36 minut 19. Producent urządzenia, firma UBI, oferuje obecnie modyfikację Biosort pozwalającą na dalsze skrócenie czasu analizy. W systemie „FastReFlex” próbki są kierowane bezpośrednio przez celę przepływową w celu analizy, z pominięciem filtra pułapki pęcherzykowej. Skutkuje to znacznym skróceniem czasu akwizycji danych; całą płytkę można przeanalizować w 22 min, co pozwala na opracowanie około 20 płytek dziennie. Gdyby jednak płytek nie zamrożono, między pierwszą a ostatnią wystąpiłby 8-godzinny odstęp. Biorąc pod uwagę stosunkowo krótki czas trwania eksperymentu, przy infekcji trwającej zaledwie 18 godzin, wprowadziłoby to niedopuszczalną zmienną między płytkami. Zamrażanie płytek przed analizą nie tylko rozwiązuje ten problem, ale jest również niezbędne w kontekście analiz wysokoprzepustowych, ponieważ przy obecnym protokole i standardowych robotach do obsługi cieczy 2 osoby mogą z łatwością przetworzyć do 50 płytek tygodniowo. Obecnie rutynowo przesiewamy 30 płytek tygodniowo, co pozwala na przeprowadzenie przesiewu całego genomu w czasie krótszym niż 2 miesiące.
Interesującą cechą tego protokołu jest fakt, że wykorzystuje on stały agar, co umożliwia przeprowadzanie testów, których nie można wykonać w hodowli ciekłej. Ponieważ fizjologia nicieni różni się w zależności od warunków hodowli 20,21, możliwość przeprowadzania analiz na podłożu stałym może stanowić uzupełnienie standardowych przesiewów w środowisku ciekłym. W przypadku niektórych fenotypów (np. ruchu) analizę można przeprowadzać bezpośrednio na 96-dołkowych płytkach z podłożem stałym. Jednak w obecnym przesiewie, ponieważ urządzenie Biosort nie może pobierać próbek z stałych podłoży, nicienie są najpierw przenoszone do cieczy przed zamrożeniem. Z drugiej strony, COPAS Biosort umożliwia wieloparametryczną analizę ilościową kompatybilną z pomiarem wielu różnych fenotypów. Prawdopodobnie w przypadku dowolnego przesiewu nie wszystkie mierzone parametry będą stanowiły główny odczyt. Niemniej jednak pomiary te mogą być przydatne z kilku powodów. Pozwalają one ustalić, czy test przebiegł prawidłowo. Na przykład można sprawdzić liczbę i wielkość nicieni w każdej studzience. Odchylenie od wartości oczekiwanych powinno występować tylko wtedy, gdy klon RNAi blokuje wzrost lub rozmnażanie. Studzienki zawierające mniej niż 20 nicieni lub/i zwierzęta o 30% mniejsze (TOF) w porównaniu ze standardową kontrolą niemającą wpływu na wzrost (np. gfp(RNAi)) mogą zostać wykluczone z późniejszych analiz. Funkcję tych klonów można zbadać za pomocą alternatywnego protokołu, w którym nicienie są eksponowane na bakterie RNAi po zaawansowaniu ich rozwoju 15. Różne parametry mogą być również wykorzystane do doprecyzowania wyboru genów kandydackich (hitów), na przykład poprzez ograniczenie hitów tylko do tych, które wpływają na fluorescencję zieloną, ale nie czerwoną. Dokładna metoda wyboru hitów będzie zależeć od rodzaju przesiewu i jego konkretnego odczytu. Ze względu na złożoność danych generowanych podczas ilościowego przesiewu całego genomu konieczna może być współpraca ze statystykiem.
Opisany przez nas protokół można z łatwością dostosować do innych rodzajów testów. Na przykład, na etapie infekcji *D. coniospora* może zostać zastąpiony dowolnym innym patogenem zdolnym do infekcji na podłożach stałych. Może to być szczególnie użyteczne, ponieważ ustalono, że wiele czynników wirulencji istotnych dla infekcji Serratia marcescens w hodowli płynnej nie odgrywa roli podczas infekcji na podłożu stałym (E. Pradel, komunikacja osobista). Protokół ten jest również w pełni kompatybilny z testowaniem związków chemicznych 22-24lub do identyfikacji związków o aktywności biologicznej z wykorzystaniem różnych bibliotek bakterii 25zatem powinno znaleźć ogólne zastosowanie w C. elegans społeczność badawcza.
Oświadczenia
Laboratorium Ewbanka współpracuje z Union Biometrica oraz Modul-Bio.
Podziękowania
Dziękujemy D. Braendle, C. L. Kurz i F. Montañana-Sanchis za ich wkład. Projekt ten był wspierany przez granty z ANR oraz Conseil Regional PACA, a także finansowanie instytucjonalne z INSERM i CNRS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BactoAgar | BD Biosciences | 214010 | |
| Ampicylina | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| BactoPeptone | BD Biosciences | 211677 | |
| CaCl2 | Dowolny dostawca | ||
| Przylepna folia AeraSeal | Dutscher | 760214 | |
| Izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | AB-0481 | |
| K2HPO4 | Dowolny dostawca | ||
| KH2PO4 | Dowolny dostawca | ||
| MgSO4 | Dowolny dostawca | ||
| NaCl | Dowolny dostawca | ||
| Na2HPO4 | Dowolny dostawca | ||
| NaOH | Dowolny dostawca | ||
| Głęboka płytka 96-dołkowa | Thermo Fisher Scientific, Inc. | AB-0932 | |
| Płaska płytka 96-dołkowa | Falcon BD | 353072 | |
| Okrągła płytka 96-dołkowa | Falcon BD | 353077 | |
| Tetracyklina | Sigma-Aldrich | T8032 | |
| Triton X-100 | Dowolny dostawca | ||
| Robot TECAN | Tecan Group Ltd. | ||
| Liquidator96TM | Rainin | ||
| COPAS Biosort | Union Biometrica | ||
| LIMS | Modul-Bio |
Bibliografia
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
- Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
- Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
- Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
- O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
- Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
- Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1551-8507 (2006).
- Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
- Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
- Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
- Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
- Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
- Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
- Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
- Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
- Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
- Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
- Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
- Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
- Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
- Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
Przedruki i uprawnienia
