Artykuł metodologiczny

Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

DOI:

10.3791/3452

⸱

6 stycznia 2012

 ,  , 
1Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 2Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodologię łączącą zautomatyzowaną hodowlę komórek z obrazowaniem wysokotreściowym w celu wizualizacji i kwantyfikacji wielu procesów oraz struktur komórkowych w sposób wysokoprzepustowy. Takie metody mogą wspomagać dalszą adnotację funkcjonalną genomów, a także identyfikację sieci genów związanych z chorobami i potencjalnych punktów uchwytu dla leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna adnotacja genomów, konstruowanie sieci molekularnych oraz identyfikacja nowych celów terapeutycznych to istotne wyzwania, które wymagają pilnego rozwiązania1-4. Różne komplementarne podejścia typu „omika” dostarczyły wskazówek dotyczących genetycznych czynników ryzyka i mechanizmów patogennych leżących u podstaw wielu chorób neurodegeneracyjnych, jednak większość tych odkryć wciąż wymaga walidacji funkcjonalnej5. Na przykład niedawne badanie asocjacyjne całego genomu w chorobie Parkinsona (PD) zidentyfikowało wiele nowych loci jako czynniki ryzyka zachorowania, lecz warianty sprawcze lub mechanizmy patogenne nie są znane6, 7. Ponieważ każdy powiązany region może zawierać kilka genów, funkcjonalna ocena każdego z nich pod kątem fenotypów związanych z chorobą przy użyciu tradycyjnych technik biologii komórki zajęłaby zbyt dużo czasu.

Istnieje również potrzeba zrozumienia sieci molekularnych, które łączą mutacje genetyczne z wywoływanymi przez nie fenotypami. Przewiduje się, że fenotypy chorób są wynikiem zaburzenia wielu interakcji. Rekonstrukcja tych sieci przy użyciu tradycyjnych metod molekularnych byłaby czasochłonna. Ponadto przewidywania sieciowe oparte na niezależnych badaniach poszczególnych komponentów, czyli podejście redukcjonistyczne, prawdopodobnie niedoszacują złożoności sieci8. To niedoszacowanie mogłoby częściowo wyjaśnić niski odsetek zatwierdzanych leków ze względu na niepożądane lub toksyczne skutki uboczne. Uzyskanie perspektywy sieciowej w odniesieniu do szlaków związanych z chorobami przy użyciu metod wysokoprzepustowego/wysokozawartościowego (HT/HC) przesiewu komórkowego oraz identyfikacja kluczowych węzłów w tych szlakach mogłyby doprowadzić do wyłonienia celów bardziej odpowiednich dla interwencji terapeutycznej.

Przesiewy wysokoprzepustowe (HTS) stanowią idealną metodologię do rozwiązania tych problemów9-12, jednak tradycyjne metody opierały się na jednowymiarowych analizach całych studzienek z komórkami, w których stosowano uproszczone odczyty dla złożonych procesów biologicznych. Nie pozwalały one na jednoczesne ilościowe określenie wielu fenotypów obserwowanych w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak deficyty transportu aksonalnego czy zmiany właściwości morfologicznych13, 14. Takiego podejścia nie można było wykorzystać do badania dynamicznego charakteru procesów komórkowych lub zdarzeń patogennych występujących w podgrupie komórek. Aby ilościowo określić takie cechy, należy przejść do fenotypów wielowymiarowych, określanych jako przesiewy wysokotreściowe (HCS)4, 15-17. HCS to komórkowa analiza ilościowa kilku procesów jednocześnie, która zapewnia bardziej szczegółowe przedstawienie odpowiedzi komórkowej na różne zaburzenia w porównaniu z HTS.

HCS posiada wiele zalet w porównaniu do HTS18, 19, jednak przeprowadzanie wysokoprzepustowego (HT) badania wysokotreściowego (HC) w modelach neuronalnych jest problematyczne ze względu na wysokie koszty, zmienność środowiskową i błędy ludzkie. Aby wykryć odpowiedzi komórkowe w skali „fenomiki” przy użyciu obrazowania HC, należy ograniczyć zmienność i błędy, zwiększając jednocześnie czułość i powtarzalność.

W niniejszej pracy opisujemy metodę dokładnego i wiarygodnego przeprowadzania przesiewów shRNA z wykorzystaniem zautomatyzowanej hodowli komórkowej20 oraz obrazowania HC w neuronalnych modelach komórkowych. Opisujemy, w jaki sposób zastosowaliśmy tę metodologię do zidentyfikowania modulatorów jednego konkretnego białka, DJ1, którego mutacja powoduje autosomalny recesywny parkinsonizm21.

Łącząc wszechstronność obrazowania HC z metodami HT, możliwe jest dokładne ilościowe określenie wielu fenotypów. Może to w konsekwencji przyczynić się do poszerzenia naszej wiedzy na temat genomu i szlaków zaangażowanych w patogenezę chorób, a także do zidentyfikowania potencjalnych celów terapeutycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zautomatyzowany proces hodowli komórek adhezyjnych (Rysunek 1)20

  1. Przygotować zautomatyzowany system hodowli komórkowych do wprowadzenia płytek hodowlanych. Za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI) załadować do systemu materiały eksploatacyjne (np. końcówki do pipet, płytki do hodowli komórkowej, płytki do testów). Upewnić się, że w systemie robotycznym znajduje się wystarczająca ilość pożywki do hodowli komórkowej, soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz trypsyny.
  2. Ręcznie zasiać dwie płytki omnitray, używając 2 x 106 komórek linii komórkowej neuroblastoma SH-SY5Y na płytkę. Hodować komórki w Opti-MEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wprowadzić płytki do robota do hodowli komórkowej za pomocą GUI. Komórki będą inkubowane w temperaturze 37°C i 5% CO2.
  3. Wybrać protokół hodowli komórkowej, który ma zostać uruchomiony20. Można wybrać proces hodowli komórek adherentnych22, hodowlę i ekspansję embrionalnych komórek macierzystych (ES) na komórkach karmicielskich myszy23 lub hodowlę komórek w zawiesinie22.
  4. Wybrać protokół hodowli komórek adherentnych (Rysunek 1) i upewnić się, że pliki parametrów specyficznych dla danej linii komórek adherentnych zostały dostosowane tak, aby próg konfluencji (obszar płytki omnitray zajęty przez komórki) był ustawiony na 70%. Ustawić całkowity czas trypsynizacji na dwie minuty.
  5. Polecić robotowi przygotowanie nowych płytek omnitray z liczbą zasiań wynoszącą 2 x 106 komórek na płytkę.
  6. Wprowadzić płytki omnitray do systemu hodowli komórkowej, korzystając z zautomatyzowanego protokołu hodowli komórek adherentnych (Rysunek 1). Protokół ten obejmuje następujące etapy: płytki są inkubowane i obrazowane do momentu osiągnięcia zdefiniowanego progu konfluencji. Jeśli komórki nie osiągną progu konfluencji w ciągu 5 odczytów, płytki są usuwane z systemu. Po osiągnięciu zdefiniowanego przez użytkownika progu konfluencji komórki są przemywane, trypsynizowane i zliczane. Zdefiniowana liczba komórek jest dodawana do nowych płytek omnitray, a jeśli liczba komórek jest wystarczająca, określona liczba płytek do testów jest transportowana na platformę, a do każdej studzienki dozowana jest określona liczba komórek. Płytki do testów mogą być obrazowane bezpośrednio za pomocą zintegrowanego mikroskopu lub wyprowadzane z systemu do dalszej obróbki.
  7. Polecić systemowi przygotowanie 4 płytek do testów na każdą płytkę omnitray, z całkowitą liczbą 5,000 komórek na studzienkę.

2. Produkcja wirusów shRNA i wysiew na płytki analityczne (Czas trwania: 6 dni)

  1. Namnóż nocnie szczepy bakterii w glicerolu zawierające wektory shRNA (Open Biosystems, TRC1) w 2ml pożywki Luria-Bertani z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny (Sigma-Aldrich).
  2. Wyizoluj plazmidy zgodnie z protokołem producenta (Promega Wizard MagneSil Tfx).
  3. Wyprodukuj wirusa zgodnie z protokołem RNAi Consortium High-Throughput Lentiviral Production (na płytce 96-dołkowej) 24. Praca z lentiwirusami jest stosunkowo bezpieczna, ponieważ cząsteczki wirusowe wykorzystywane do transdukcji są niewydolne replikacyjnie, a do ich produkcji stosuje się strategie pakowania genów rozdzielonych. Jednak podczas pracy z lentiwirusami niezbędne jest stosowanie dodatkowych procedur bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko dla siebie i innych 25. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa MLII lub BSL2. Wszystkie wyroby plastikowe (pipety, naczynia plastikowe, pożywki), które miały kontakt z cząsteczkami lentiwirusa, powinny być inkubowane z wybielaczem przez 24 godziny przed utylizacją.
  4. Oblicz wielokrotność infekcji (MOI) lentiwirusa, określając procent komórek pozytywnych pod kątem GFP przy użyciu plazmidu pLKO.1 GFP (Sigma-Aldrich).
  5. Nanieś lentiwirusa na płytki analityczne, stosując MOI wynoszące 3.

3. Transdukcja lentiwirusowa i różnicowanie neuronalne komórek SH-SY5Y (Czas trwania: 6 dni)

  1. Komórki nanosi się na płytki do analizy (patrz krok 1.7). Płytki zawierające lentiwirus shRNA należy wprowadzić do zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowej.
  2. Po 24 godzinach pożywkę na płytkach wymienia się na Opti-MEM zawierający 0.5% FBS i 0.1 μM kwasu retinowego, aby rozpocząć proces różnicowania. Różnicowanie komórek SH-SY5Y umożliwia wizualizację struktur neurytycznych i synchronizuje podziały komórkowe.
  3. Inkubację płytek w pożywce różnicującej kontynuuje się przez 5 dni. Zapewnia to maksymalny knockdown ekspresji genu docelowego.
  4. W 5. dniu do połowy płytek dodaje się 50 μM H2O2 na 24 godziny, aby stymulować translokację DJ1 do mitochondriów.
  5. W 6. dniu do komórek dodaje się Mitotracker CmxROS (Invitrogen) w końcowym stężeniu 200 nM na dołek i inkubuje w 37°C przez 30 minut.
  6. Można zaprogramować system tak, aby obrazował płytki bezpośrednio za pomocą imager-a HC, lub płytki można wyeksportować z systemu w celu dalszej obróbki.

4. Zautomatyzowane barwienie immunocytochemiczne płytek testowych (Czas trwania: 2 dni)

Jakość obrazowania ma kluczowe znaczenie dla przeprowadzenia czułego i wiarygodnego HCS. Uszkodzenia monowarstwy komórkowej spowodowane nieprecyzyjnym pipetowaniem mogą prowadzić do niskiej jakości obrazów i niepowtarzalnych wyników. Aby zminimalizować uszkodzenia warstwy komórkowej, barwienie immunocytochemiczne przeprowadzono przy użyciu stacji robotycznej. Procedura ta jest podobna do wcześniej opisanej26, lecz została zmodyfikowana w celu zwiększenia przepustowości oraz zmniejszenia zużycia materiałów eksploatacyjnych.

  1. Utrwalone komórki za pomocą 100 μl 4% paraformaldehydu podgrzanego wcześniej do 37°C. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  3. Inkubować płytki testowe z 200 μl PBS zawierającego 0,1% Triton (PBST) przez 10 minut.
  4. Przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  5. Inkubować płytki testowe z 200 μl buforu blokującego (PBST z 5% FBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  7. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi:
    1. anty-DJ1 N20 kozie (Santa Cruz, 5 μg/ml)
    2. anty-β-III tubulin królicze (Sigma-Aldrich, 1 μg/ml)
  8. Następnego dnia przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  9. Inkubować płytki testowe z następującymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej:
    1. AlexaFluor 488 anty-kozie osiołkowe (Invitrogen, 2 μg/ml)
    2. AlexaFluor 647 anty-królicze kozie (Invitrogen, 2 μg/ml)
  10. Przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  11. Inkubować komórki z barwnikiem Hoechst (Invitrogen; 1 μg/ml) przez 10 minut.
  12. Przemyć komórki 200 μl PBS przez 5 minut, powtórzyć 3 razy.
  13. Przechowywać płytki w temperaturze 4°C do momentu wykonania obrazowania.

5. Pozyskiwanie obrazów wysokotreściowych i analiza obrazu (Czas trwania: 5 dni)

  1. Wykonaj obrazowanie łącznie 30 pól na studzienkę, używając obiektywu 20x. Wizualizuj DJ1 za pomocą zestawu filtrów FITC, mitochondria za pomocą zestawu filtrów TRITC, β-III tubulinę za pomocą zestawu filtrów Cy5 oraz jądra komórkowe przy użyciu zestawu filtrów UV (Rysunek 3).
  2. Przeanalizuj obrazy za pomocą bioaplikacji Compartmental Analysis (Cellomics, ThermoFisher), aby określić średnią intensywność sygnału Mitotracker w obrębie mitochondriów (Rysunek 4B, F).
  3. Aby określić średni współczynnik nakładania się sygnałów DJ1 i mitochondriów, przeanalizuj obrazy za pomocą bioaplikacji Cellomics Colocalisation (Cellomics, ThermoFisher). Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) w następujący sposób: ROI A – jądro (Rysunek 4A, E), ROI B – mitochondria (Rysunek 4B, F). Wyklucz ROI A z ROI B, aby zapewnić analizę wyłącznie cytoplazmy. Zdefiniuj mitochondria jako region docelowy I oraz DJ1 jako region docelowy II (Rysunek 4C, G).
  4. Przeanalizuj obrazy za pomocą bioaplikacji Neuronal Profiling (Cellomics, Thermofisher), aby wyznaczyć średnią długość neurytów na podstawie barwienia β-III tubuliny (Rysunek 4D, H).
  5. Wykonaj obrazowanie płytek przy użyciu automatycznego czytnika konfokalnego Opera LX (Perkin-Elmer). Obrazuj łącznie 30 pól na studzienkę, używając obiektywu 60x z immersją wodną. Wizualizuj mitochondria za pomocą lasera 561 nM, a jądra komórkowe za pomocą wzbudzenia UV.
  6. Przeanalizuj obrazy za pomocą algorytmu cech tekstury Spot-Edge-Ridge (SER). Filtr SER-Ridge przekazuje intensywność pikseli tworzących wzory przypominające grzbiety. Im bardziej pofragmentowane są mitochondria, tym wyższy jest wynik SER-Ridge (Rysunek 8).

6. Normalizacja i analiza danych

  1. Zaimportuj dane z oprogramowania do analizy obrazu do pakietu BioConductor CellHTS2 dla środowiska programistycznego R (R wersja 2.11.1, BioConductor wersja 2.6).
  2. Przed przeprowadzeniem normalizacji opartej na medianie dla każdej płytki, przekształć dane za pomocą logarytmu o podstawie 227, 28. Nie stosuj korekty wariancji dla poszczególnych płytek.
  3. W celu zidentyfikowania modyfikatorów fenotypu zastosuj dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) pomiędzy różnymi grupami badawczymi, t.j. zainfekowane komórki z kontrolą Scrambled niepoddane leczeniu vs. komórki z kontrolą scrambled poddane działaniu toksyny vs. komórki z genem docelowym niepoddane leczeniu vs. komórki z genem docelowym poddane leczeniu (Ryciny 5-7).

7. Reprezentatywne wyniki

Mutacje w obrębie DJ1 prowadzą do wczesnego, recesywnego parkinsonizmu21, jednak nie jest jasne, w jaki sposób utrata DJ1 powoduje wystąpienie fenotypu choroby. Znane jest to, że komórki z niedoborem DJ1 są bardziej podatne na śmierć komórkową indukowaną stresem oksydacyjnym, a w odpowiedzi na stres oksydacyjny DJ1 przemieszcza się z cytoplazmy do mitochondriów 29, 30. Poprzez opracowanie testów HC do monitorowania tych fenotypów, możemy zidentyfikować geny, które regulują lub wpływają na fenotypy związane z DJ1. Takie podejście może pomóc w rozszyfrowaniu szlaków, w których funkcjonuje DJ1 i które mogą być zaangażowane w patogenezę choroby.

Przykład interakcji epistatycznej z DJ1 (Rycina 5): Wyciszenie DJ1 w komórkach eksponowanych na toksynę skutkuje większą utratą żywotności komórek (BAR-B: obraz-B) w porównaniu do komórek zainfekowanych kontrolowanym lentiwirusem (scrambled lentivirus) (BAR-A: obraz-A). Wyciszenie genu docelowego A wywołuje efekt podobny do tego zaobserwowanego w komórkach z wyciszonym DJ1 (BAR-C: obraz-C). Wyciszenie zarówno DJ1, jak i genu docelowego A prowadzi do znacznie większej utraty żywotności komórek niż utrata każdego z tych genów z osobna (BAR-D: obraz-D). Sugeruje to występowanie interakcji epistatycznej między DJ1 a genem docelowym A.

Przykład genu regulującego translokację DJ1 (Rysunek 6): Gdy komórki są narażone na działanie toksyny, DJ1 przemieszcza się z cytoplazmy do mitochondriów, co objawia się wyższym współczynnikiem pokrycia między DJ1 a mitochondriami (BAR-A: obraz A względem BAR-C: obraz C). W komórkach, w których gen docelowy B został wyciszony, mniej DJ1 przemieszcza się do mitochondriów po narażeniu komórek na toksynę. Sugeruje to, że gen docelowy B bierze udział w transporcie DJ1 do mitochondriów. (BAR-B: obraz B oraz BAR-D: obraz D)

Przykład genu zaangażowanego w wypustkowanie neuronalne (Rysunek 7): Wyciszenie genu docelowego C w komórkach SH-SY5Y typu dzikiego prowadzi do istotnego zwiększenia długości neurytów (BAR-B: obraz-B) w porównaniu z komórkami zainfekowanymi lentiwirusem wykazującym ekspresję shRNA typu scrambled (BAR-A: obraz A). Efekt ten zanika w komórkach inkubowanych z toksyną (BAR-C i D).

Przykład genu zaangażowanego w morfologię mitochondriów (Rycina 8): Infekcja komórek SH-SY5Y typu dzikiego shRNA celującym w gen D prowadzi do spadku wartości segmentacji mitochondrialnej SER-Ridge (Rycina 8, Obrazy C i D) w porównaniu z komórkami zainfekowanymi zrandomizowanym lentiwirusem (Rycina 8, Obrazy A i B).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat zautomatyzowanego protokołu hodowli komórkowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schematyczny przegląd procesu przesiewowego, analizy obrazów i metod statystycznych wykorzystanych podczas procesu przesiewowego: i) Komórki są hodowane do momentu uzyskania konfluencji, a następnie wysiewane na płytki do testów zawierające lentiwirus shRNA. Komórki są różnicowane przez 5 dni, po czym do płytek dodaje się toksynę na 24 godziny. Płytki testowe są wyjmowane z systemu i poddawane immunobarwieniu. Czas trwania każdego z procesów jest wskazany w nawiasach. ii) Dane są pozyskiwane przy użyciu imageru wysokoprzepustowego (żywotność komórek, translokacja białek i wypustki neuronalne) oraz zautomatyzowanego imageru konfokalnego (morfologia mitochondriów). Dane są eksportowane do pakietu CellHTS2 w środowisku R, poddawane logarytmicznej transformacji o podstawie 2 (log2) i normalizacji. Do identyfikacji istotnych interakcji między różnymi zmiennymi wykorzystuje się dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Obrazy kompozytowe komórek uzyskane za pomocą obrazowania HC. A) Komórki nieleczone, B) Komórki poddane działaniu H2O2. DJ1 jest oznakowany na zielono, mitochondria na czerwono, a jądra komórkowe na niebiesko. Barwienie neurytów nie zostało wyróżnione.

figure-protocol-4
Rycina 4. Ilościowe określenie kilku cech komórkowych uzyskanych za pomocą HCS. A-D) Niepoddane działaniu czynników komórki SH-SY5Y. E-H) Komórki SH-SY5Y poddane działaniu H2O2. A, E) Segmentacja jąder komórkowych i definicja ROI A; B, F) Identyfikacja i ilościowe określenie mitochondriów, ROI B; C, G) Identyfikacja DJ1, kanał docelowy II; D, G) Identyfikacja i obliczenie średniej długości neurytów. Komórki znajdujące się blisko krawędzi obrazu są wykluczane z analizy. Obrazy wstawkowe przedstawiają stan przed analizą.

figure-protocol-5
Rycina 5. Identyfikacja genu wykazującego epistazę z DJ1 (litery na słupkach odpowiadają oznaczeniom na obrazach). Obrazy od A do D przedstawiają komórki SH-SY5Y znakowane Mitotracker CMXRos (czerwony), który został użyty do ilościowego określenia stanu zdrowia komórek.

figure-protocol-6
Rysunek 6. Identyfikacja genu regulującego translokację DJ1 (litery na słupkach odpowiadają oznaczeniom na obrazach). Obrazy od A do D przedstawiają komórki SH-SY5Y z oznakowaniem DJ1 (zielony), mitochondriów (czerwony) oraz jąder komórkowych (niebieski), które wykorzystano do ilościowego pomiaru translokacji DJ1 do mitochondriów.

figure-protocol-7
Rycina 7. Identyfikacja genu zaangażowanego w wzrost neuronów (litery na słupkach odpowiadają oznaczeniom na obrazach). Obrazy od A do D przedstawiają komórki SH-SY5Y z oznakowaniem β-III tubuliny (zielony) oraz jąder komórkowych (niebieski), które posłużyły do ilościowego oznaczenia długości neurytów.

figure-protocol-8
Rysunek 8. Identyfikacja genu uczestniczącego w regulacji morfologii mitochondriów. Obrazy A i C są obrazami kompozytowymi komórek SH-SY5Y zainfekowanych odpowiednio kontrolowanym (scrambled) shRNA lub shRNA celującym w gen D. Mitochondria są zabarwione na czerwono, natomiast jądra komórkowe na niebiesko. Obrazy B i D przedstawiają wizualizacje ilościowego pomiaru SER-Ridge.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz ze spadkiem kosztów systemów przesiewowych komórkowych HT/HC (wysokoprzepustowych/wysokiej zawartości), w połączeniu z dostępnością potężnych narzędzi genomowych do modyfikacji funkcji genów, badania przesiewowe HT/HC stają się powszechne w środowisku akademickim. Podejście to zostało już z powodzeniem zastosowane w różnych obszarach badań, takich jak identyfikacja celów terapeutycznych w nowotworach 9, 31-33 i rozwoju embrionalnym 34-36, a nawet wykazuje potencjał w odtwarzaniu szlaków zaangażowanych w zaburzenia neuropsychiatryczne 37,38. Jednak wdrożenie takiego systemu wymaga znacznych nakładów czasu i wysiłku, a optymalizacja procesów często zajmuje minimum 6 miesięcy. Wszystkie etapy, takie jak czas trypsynizacji, prędkości pipetowania i gęstość zasiewu, muszą zostać dostosowane, aby zapewnić zdrowy i spójny wzrost komórek. Zapobieganie kontaminacji bakteryjnej jest jednym z najtrudniejszych wyzwań w zautomatyzowanej hodowli komórkowej, gdzie konieczne są cotygodniowe protokoły czyszczenia w połączeniu z ciągłym płukaniem wszystkich linii prowadzących ciecze 70% ethanol, aby uzyskać hodowle wolne od zanieczyszczeń. Konieczna będzie również udoskonalenie robotyki, aby możliwe było zintegrowanie dodatkowych instrumentów, takich jak mikroskopy konfokalne dla uzyskania wyższej rozdzielczości oraz zamrażarki -80°C do przechowywania związków.

Istnieją również ograniczenia, które należy rozwiązać, aby poprawić czułość, szybkość i użyteczność tej metody w badaniu sieci genowych oraz identyfikacji genów zaangażowanych w patogenne szlaki molekularne.

Aby przeprowadzić przesiew HT/HC i zapewnić gromadzenie wiarygodnych danych, należy zoptymalizować kilka aspektów. Po pierwsze, kluczowa jest niezawodność pomiaru, która zależy od powtarzalności i czułości testu. Na przykład testy opisane powyżej nadają się do mniejszych paneli przesiewowych, ale są trudne do wdrożenia w skali całego genomu ze względu na liczbę etapów przetwarzania wymaganych przed akwizycją obrazu. Zatem należałoby stworzyć stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję genu reporterowego, co umożliwiłoby bezpośrednie obrazowanie i doprowadziło do zmniejszenia zmienności dzięki zredukowanej liczbie etapów przetwarzania. Obecnie zaprojektowanie testu, który dokładnie obrazuje i wiarygodnie kwantyfikuje interesujący fenotyp, stanowi główny wąskie gardło w procesie przesiewowym HC.

Wiele przesiewów w komórkach ssaków przeprowadza się z wykorzystaniem różnych bibliotek RNAi, z których każda charakteryzuje się efektami off-target, ograniczoną wydajnością wyciszania genów oraz niepełnym pokryciem genomu. W związku z tym konieczne jest stworzenie bibliotek o większej specyficzności, sile działania i lepszym pokryciu. Trwają prace nad opracowaniem takich bibliotek (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information.html) i istnieje nadzieja, że takie działania poprawią powtarzalność wyników przesiewów HT/HC.

Ograniczeniem wielu wielkoskalowych przesiewów komórkowych jest fakt, że są one przeprowadzane na komórkach neuroblastoma, ponieważ można je z łatwością modyfikować genetycznie i hodować w dużych ilościach. Jednakże istotność „trafień” zidentyfikowanych w modelach hodowli komórkowej ex vivo w odniesieniu do funkcji in vivo jest dyskusyjna, zwłaszcza że mózg składa się z wysoce wyspecjalizowanych typów komórek, które tworzą gęstą i złożoną sieć połączeń synaptycznych, aby funkcjonować jako wysoce zintegrowana jednostka. W konsekwencji powszechną praktyką jest walidacja trafień zidentyfikowanych za pomocą opisanego powyżej podejścia przesiewowego w przesiewach wtórnych, z wykorzystaniem dodatkowych technik i w modelach bardziej relewantnych fizjologicznie 39. Aby poprawić translację trafień zidentyfikowanych podczas HCS, należy opracować i dostosować do podejść HT/HC bardziej reprezentatywne i zaawansowane modele, takie jak komórki pierwotne, zróżnicowane komórki macierzyste lub systemy kokultury.

Dzięki połączeniu zautomatyzowanej hodowli komórkowej z obrazowaniem wysokotreściowym (HC) można szybko uzyskać nową wiedzę na temat funkcjonowania neuronów i określić, które szlaki są istotne dla rozwoju chorób. Połączenie danych HCS/HTS z informacjami uzyskanymi z innych podejść typu „omika” pozwoli na stworzenie systemowego przeglądu biologicznego chorób mózgu, co w konsekwencji ułatwi opracowywanie terapii.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy programistom i specjalistom firmy Hamilton za stałe wsparcie oraz Evie Blaas za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z dwóch grantów inwestycyjnych NWO (911-07-031 oraz 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 oraz Neuroscience Campus Amsterdam; wsparcie dla S.J. zapewniła firma Ti-Pharma: T5-207.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AI.CELLHOSTHamilton Cohttp://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI-MEMInvitrogen31985-054
KWAŚ PRZEKŁADNIOWY (RETINOIC ACID)Sigma-AldrichR2625
PŁYTKI OMNITRAYNalge Nunc international465219
PŁYTKI KULTUROWE 96-SKROTKOWEGreiner Bio-One655086
PRZECIW CIAŁA DJ1 N20Santa Cruz Biotechnology, Inc.SC27004
PRZECIW CIAŁA PRZECIW BETA-III TUBULINIESigma-AldrichT3952
MITOTRACKER CMXROSInvitrogenM-7512
H–CHST-33342InvitrogenH1399
NADTLENEK WODORUSigma-Aldrich216763-100ML
TRYPSYNAInvitrogen25050014
KOSZYLOWY BUFOR SALINOWY DULBECCO’S (DPBS)Invitrogen14190086
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFXPromega Corp.A2380
KLONY shRNAOpen Biosystemshttp://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/
CELLOMICS BIOAPPLICATIONSThermo Fisher Scientific, Inc.http://www.thermo.com/hcs

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461, 908-915 (2009).
  2. Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology. Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).
  3. Zhu, H., Snyder, M. 'Omic' approaches for unraveling signaling networks. Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).
  4. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68, 207-217 (2010).
  5. Manolio, T. A. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 461, 747-753 (2009).
  6. Nalls, M. A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377, 641-649 (2011).
  7. Simon-Sanchez, J. Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch. Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).
  8. Van Regenmortel, M. H. Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism. EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).
  9. Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health. Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).
  10. An, W. F., Tolliday, N. J. Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).
  11. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).
  12. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).
  13. Conrad, C., Gerlich, D. W. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).
  14. Thomas, N. High-content screening: a decade of evolution. J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).
  15. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).
  16. Dragunow, M. High-content analysis in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).
  17. Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).
  18. Durr, O. Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay. J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).
  19. Miller, J. Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis. J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).
  20. Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. The Complete Automation of Cell Culture. Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).
  21. Bonifati, V. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. 299, 256-259 (2003).
  22. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).
  23. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  24. Moffat, J. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283-1298 (2006).
  25. Volksgezondheid, M. V. Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde. Organismen. , (2004).
  26. Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).
  27. Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme. J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).
  28. Canet-Aviles, R. M. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).
  29. Blackinton, J. Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1. J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).
  30. Gupta, P. B. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138, 645-659 (2009).
  31. Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137, 835-848 (2009).
  32. Mouchet, E. H., Simpson, P. B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges. IDrugs. 11, 422-427 (2008).
  33. Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).
  34. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  35. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).
  36. Ross, P. J., Ellis, J. Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells. F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).
  37. Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).
  38. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zautomatyzowana hodowla kom rekskrining shRNAtransdukcja lentiwirusowar nicowanie neuronalnefunkcja mitochondri wwzrost neuryt wanaliza kolokalizacjicechy tekstury SER

Powiązane artykuły