Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie właściwości fizjologicznych i połączeń synaptycznych konkretnych neuronów w nienaruszonym tkance jest wyzwaniem w przypadku komórek, które nie posiadają wyraźnych cech morfologicznych lub wykazują niską gęstość populacji. Dotyczy to w szczególności komórek amacryny siatkówki, wyjątkowo różnorodnej klasy interneuronów, która u ssaków obejmuje około 30 podtypów1. Mimo że stanowią one kluczowy element przetwarzania wizualnego poprzez kształtowanie sygnału wyjściowego siatkówki2, większość tych podtypów nie została dotychczas zbadana w kontekście funkcjonalnym, ponieważ dotarcie do tych komórek za pomocą elektrody rejestrującej jest zdarzeniem rzadkim.
W ostatnim czasie udostępniono liczne linie myszy transgenicznych wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), pod kontrolą promotorów receptorów błonowych lub enzymów specyficznych jedynie dla określonego podzbioru neuronów w danej tkance3,4. Te uprzednio znakowane komórki są zatem dostępne dla ukierunkowanego celowania mikroelektrodami pod kontrolą mikroskopową, co umożliwia systematyczne badanie ich właściwości fizjologicznych in situ. Jednak wzbudzanie markerów fluorescencyjnych wiąże się z ryzykiem fototoksyczności dla żywej tkanki. W przypadku siatkówki podejście to jest dodatkowo utrudnione przez fakt, że światło wzbudzające powoduje odpowiednią stymulację fotoreceptorów, co prowadzi do blaknięcia fotobarwników i wprowadza obwody siatkówkowe w stan adaptacji do światła. Wadom tym zaradza się, stosując wzbudzanie w podczerwieni dostarczane przez laser z blokadą modów w krótkich impulsach z zakresu femtosekundowego. Wzbudzanie dwufotonowe dostarcza energii wystarczającej do wzbudzenia fluoroforu, a jednocześnie ogranicza wzbudzenie do niewielkiej objętości tkanki, minimalizując ryzyko uszkodzeń fotochemicznych5. Ponadto sprawia ono, że siatkówka pozostaje responsywna na bodźce wzrokowe, ponieważ światło podczerwone (>850 nm) jest słabo absorbowane przez fotobarwniki6.
W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie siatkówki transgenicznej myszy do przeprowadzenia elektrofizjologicznych rejestracji in situ z komórek wykazujących ekspresję GFP, które są celowane wizualnie za pomocą wzbudzenia dwufotonowego. Siatkówka jest przygotowywana i utrzymywana w ciemności i może być poddawana bodźcom optycznym projektowanym przez kondensor mikroskopu (Rycina 1). Rejestracja odpowiedzi świetlnych metodą patch-clamp może być połączona z wypełnianiem barwnikiem w celu ujawnienia morfologii oraz sprawdzenia sprzężenia barwnika za pośrednictwem złączy szczelinowych z sąsiednimi komórkami, co pozwala na badanie komórki docelowej na różnych poziomach eksperymentalnych.
Protokół
Poniższy opis zakłada, że eksperymentator posiada podstawową wiedzę na temat struktury siatkówki, rejestracji metodą patch-clamp oraz mikroskopii dwufotonowej. Przydatne informacje dotyczące konfiguracji i obsługi układu patch-clamp oraz systemu obrazowania dwufotonowego znajdują się w Refs [7-12].
1. Przygotowanie zwierząt i tkanek
- Utrzymaj mysz w adaptacji do ciemności przez co najmniej 3 h. W tym czasie przygotuj 1-2 l roztworu zewnątrzkomórkowego składającego się z (w mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 1,6 MgCl2, 25 NaHCO3, 10 D-glukozy i zrównoważ jego pH do poziomu 7,4 poprzez napowietrzanie karbogenem (5% CO2 w O2) w temperaturze pokojowej.
- Uśmierć mysz w szczelnej komorze poprzez przedawkowanie CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjowe. Tę procedurę oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w ciemności. Aby umożliwić widoczność przy jednoczesnym zachowaniu adaptacji oczu zwierzęcia do ciemności (myszy mają słaby wzrok w czerwonej części widma światła), stosuj słabe oświetlenie o długiej fali (blokujemy krótkie fale z zimnego źródła światła za pomocą filtra długoprzechodniego 690 nm). Do pracy w całkowitej ciemności używaj oświetlenia podczerwienią (>800 nm) i noś gogle noktowizyjne.
- Wyjąć gałki oczne za pomocą zakrzywionych nożyczek tęczówkowych i przenieść je do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym umieszczonego pod mikroskopem stereoskopowym.
- Usunąć rogówkę i ciało rzęskowe, otwierając gałkę oczną wzdłuż ora serrata (granicy między siatkówką a ciałem rzęskowym) za pomocą nożyczek sprężynowych (najpierw używamy lancetu, aby zrobić otwór początkowy do cięcia). Wyjąć soczewkę i ostrożnie oddzielić siatkówkę od nabłonka pigmentowego. Jeśli orientacja siatkówki jest kluczowa dla badania, zaznacz ją zgodnie z Ref [12]. Przeciąć nerw wzrokowy między siatkówką a nabłonkiem pigmentowym i wyjąć siatkówkę z oczodołu. Zwróć uwagę na kierunek powierzchni siatkówki: wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych, a zewnętrzna to strona fotoreceptorów.
- Usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie odciągając je za pomocą drewnianego wykałaczką. W tym celu użyj niewielkiej objętości roztworu zewnątrzkomórkowego, która zaledwie pokrywa siatkówkę. Ciało szkliste przylega do wykałaczki i może być przeciągane odśrodkowo od siatkówki. Następnie wykonaj krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.
- Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną fotoreceptorów do dołu, rozprostować ją na szklanym dnie (używając cienkiego pędzla) i unieruchomić za pomocą nylonowej ramki ze stali nierdzewnej. W ten sam sposób przygotuj drugą siatkówkę i utrzymuj ją w adaptacji do ciemności w napowietrzonym karbogenem roztworze zewnątrzkomórkowym do późniejszego użycia.
2. Nagrania
- Zainstaluj komorę rejestracyjną w ciemności pod odwróconym mikroskopem skanującym laserem i stale perfunduj preparat siatkówki (z prędkością nie mniejszą niż 5 ml/min) nasyconym karboksygenem roztworem zewnątrzkomórkowym podgrzanym do 35 °CMikroskop (wyposażony również w kamerę CCD czułą na podczerwień) znajduje się na amortyzowanym stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya służącej do ekranowania elektronicznego. Klatkę należy osłonić nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności. Światło z monitorów komputerowych ekranujemy dodatkowo czerwoną przezroczystą folią.
- Nastroić laser podczerwony na zakres 850–870 nm lub dłuższe fale, przełączyć go w tryb blokady modów (mode-locked) i zastosować dwufotonową wzbudzenie w celu wizualizacji komórek wykazujących ekspresję GFP. Osłabić moc wyjściową lasera za pomocą filtrów neutralnych sterowanych przez oprogramowanie do skanowania laserowego do stopnia, który jest wystarczający do wyraźnego rozpoznania fluorescencyjnych komórek.
- Do rejestracji metodą patch-clamp w trybie pomiaru prądu (current-clamp) należy użyć szklanych mikropipet (stosujemy rurki z borokrzemowego szkła o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i grubości ścianki 0,225 mm) wypełnionych roztworem wewnątrzkomórkowym składającym się z (w mM): 125 glukonianu K, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,4 za pomocą KOH (co daje oporność pipety wynoszącą około 5 MΩ). Należy pamiętać, że inne warunki eksperymentalne, takie jak rejestracja w trybie pomiaru napięcia (voltage-clamp), wymagają zastosowania innego roztworu. W przypadku chęci przeprowadzenia wstrzyknięć barwnika należy dodać sondę fluorescencyjną (stosujemy 10 mM Alexa Fluor 594) lub cząsteczkę znacznika (3% neurobiotyny). Wprowadzić mikropipetę do uchwytu i upewnić się, że elektroda odniesienia (chlorkowany drut srebrny) styka się z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.
- Wywieraj nacisk za pomocą mikropipety i nakieruj ją na komórkę wykazującą ekspresję GFP (używamy obiektywu imersyjnego z wodą z powiększeniem 40x; NA 1,25). Ciała komórek amacrynych znajdują się w warstwie komórek zwojowych (bezpośrednio pod powierzchnią przy obecnej orientacji siatkówki) oraz w proksymalnej części wewnętrznej warstwy nuklearnej (około 55-75 μm (głęboko wewnątrz preparatu). Przed kontaktem mikropipety z docelową komórką należy przebić błonę ograniczającą wewnętrzną (osłonę zbudowaną z stóp końcowych komórek glejowych) na powierzchni siatkówki. Pomyślne przebicie rozpoznaje się po tym, że roztwór wewnątrzkomórkowy zostaje wypchnięty z końcówki mikropipety i oddziela błonę ograniczającą wewnętrzną od leżącej pod nią tkanki siatkówki, co można zaobserwować na obrazie transmisyjnym w podczerwieni zarejestrowanym przez kamerę IR-CCD.
- Należy zbliżyć się do pożądanej komórki, porównując położenie somy na obrazie dwufotonowym z obrazem z kamery IR-CCD, który pokazuje położenie mikropipety rejestrującej. Należy pamiętać, że ten etap nie jest łatwy do wykonania i wymaga wprawy, ponieważ komórka wykazująca ekspresję GFP musi zostać rozpoznana na obrazie transmisyjnym w podczerwieni, aby móc skierować ku niej mikropipetę. Prawidłowe celowanie zostaje osiągnięte, gdy końcówka mikropipety powoduje wgłębienie powierzchni komórki, widoczne na obrazie dwufotonowym. Alternatywnie do tej procedury można zastosować barwnik fluorescencyjny (np. Alexa Fluor 594, 100 μM) w roztworze wewnątrzkomórkowym, aby uwidocznić położenie mikropipety na obrazie dwufotonowym. Dwufotonowa ekscytacja podczerwienią zapewnia wystarczającą fluorescencję tego barwnika, by mikropipeta była dostrzegalna. W tym celu należy dostosować zakres detekcji w oprogramowaniu do skanowania laserowego tak, aby obejmował on również fluorescencję czerwoną.
- Zwolnij ciśnienie z mikropipety i uzyskaj konfigurację patch-clamp w trybie whole-cell (całej komórki) w trybie clampowania prądowego (current-clamp). Użyteczny pomiar powinien wykazać potencjał błonowy od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 min.
- Prezentuj bodźce wizualne stworzone za pomocą oprogramowania do stymulacji (używamy programu QDS autorstwa Thomasa Eulera z Uniwersytetu w Tübingen w Niemczech)11 na monitorze komputera. Dostosuj położenie przestrzenne stymulacji tak, aby znajdowała się ona w centrum rejestrowanej komórki: zaznacz pozycję komórki na monitorze wyświetlającym obraz transmisyjny z kamery IR-CCD i wycentruj na niej bodziec punktowy. Dostrój intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralne w tor wiązki. Kalibrację widma i intensywności monitora opisano w ref. [14]. Wybierz wydłużony odstęp międzybodźcowy (np. 15 s), aby uniknąć adaptacji. Umieść fotodiodę w torze wiązki, aby rejestrować czas trwania bodźca.
- Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi na światło (stosujemy częstotliwość próbkowania 10 kHz z filtrowaniem przy 5 kHz dla komórek niewytwarzających potencjałów czynnościowych; do rejestracji impulsów zaleca się wyższą częstotliwość próbkowania, np. 20 kHz). Użyj oprogramowania do stymulacji światłem w celu uruchomienia oprogramowania rejestrującego.
- W celu wypełnienia barwnikiem należy pozwolić na dyfuzję czynnika fluorescencyjnego do rejestrowanej komórki przez 30–45 min, a następnie ostrożnie wycofać mikropipetę z komórki. Należy uważać, aby nie wyciągnąć ciała komórki. Jeśli użyto niefluorescencyjnego znacznika Neurobiotyna, wymagana jest jego wizualizacja poprzez wiązanie z streptawidyną sprzężoną z fluorophorem (stosujemy streptawidynę-Cy3 w rozcieńczeniu 1:400 przez noc w 4 °C po 20-minutowej fiksacji siatkówki paraformaldehydem; w przypadku badań nad sprzęganiem barwników inkubację z streptawidyną można przedłużyć do 3 dni). Alternatywnie wtryskiwanie można również przeprowadzić za pomocą mikroelektrod (>100 MΩ), gdy barwnik jest wprowadzany do nakłutej komórki drogą jontoforezy (pulsy prostokątne: 0,25–1 nA, 100 ms, odstęp 100 ms, czas całkowity 3–6 min).
3. Reprezentatywne wyniki:
Poniższe wyniki pochodzą z badania na myszy wykazującej ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod promotorem tyrozynowej hydroksylazy13,14, enzymu katalizującego etap ograniczający szybkość syntezy katecholamin (mysz TH::GFP). Na podstawie jasności sygnału GFP można wyróżnić dwie odrębne populacje komórek (Rysunek 2A). Komórki wykazujące wyższy poziom GFP posiadają ciała komórkowe zlokalizowane w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL, Rysunek 2A) lub przesunięte do warstwy komórek zwojowych (GCL, Rysunek 2B) i rozwarstwiają się w środkowej części wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL, Rysunek 2C). Zidentyfikowano je jako komórki typu 214-16, które można było systematycznie badać pod kątem morfologii (Rysunek 3) i aktywności elektrycznej (Rysunek 4), mimo że gęstość ich populacji wynosi zaledwie 250 komórek/mm2.
Rysunek 1. Schematyczny opis układu eksperymentalnego. Pobudzenie dwufotonowe (czerwona przerywana ścieżka światła) komórek wykazujących ekspresję fluoroforu w nienaruszonej siatkówce umożliwia wizualne celowanie za pomocą mikropipety (zielona ścieżka emisji światła). Siatkówka jest poddawana bodźcom optycznym projektowanym przez kondensator mikroskopu (żółta ścieżka światła), a następnie rejestrowane są komórkowe odpowiedzi świetlne.
Rysunek 2. Komórki wykazujące ekspresję GFP w preparacie płaskim siatkówki myszy TH::GFP. Można wyróżnić dwie populacje na podstawie intensywności sygnału GFP: komórki typu 1 (komórki DA) zlokalizowane w INL wykazujące słabą fluorescencję (A, patrz groty strzałek) oraz intensywnie znakowane komórki typu 2 z ciałami komórkowymi znajdującymi się albo w INL (A, patrz strzałki), albo przemieszczonymi do GCL (B) oraz z dendrytyczną stratyfikacją w warstwie S3 IPL (C). Paski skali, 50 μm.
Rycina 3. Morfologia komórki typu 2 wstrzykniętej znacznikiem Neurobiotin. Znacznik został następnie zwizualizowany za pomocą wiązania streptawidyny-Cy3 (magenta). Mikrografia, przedstawiająca również sygnał GFP (zielony), jest projekcją stosów obrazów obejmujących GCL i IPL. Pasek skali, 50 μm.
Rycina 4. Reakcje świetlne komórki typu 2 zlokalizowanej w GCL. Wzorzec odpowiedzi na pełnowpólne oświetlenie białym światłem o zwiększającym się natężeniu w zakresie skotopowym. Natężenie bodźca podano w liczbie fotoizomeryzacji na pręcik na sekundę (Rh*/rod/s). W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia bodźca (odpowiedź ON) i jego zakończenia (odpowiedź OFF) zastosowano przedłużony bodziec trwający 3 s.
Dyskusja
Metoda ta umożliwia badanie właściwości elektrycznych konkretnych neuronów w nienaruszonej siatkówce pod kontrolą wizualną, bez wpływania na stan adaptacyjny siatkówki. Jest ona szczególnie odpowiednia do charakterystyki komórek, które są obecnie słabo zbadane ze względu na niską gęstość populacji, takich jak większość populacji komórek amakrynowych. Wzbudzenie dwufotonowe pozwala na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście nawet z głębszych części tkanki17, co jest warunkiem niezbędnym do dokładnego celowania i udanego patch-clampowania komórek, szczególnie w warstwie INL o wysokiej gęstości ciał komórkowych.
Wyizolowana siatkówka mysia pozostaje żywotna przez 3-4 h w warunkach eksperymentalnych. Jeśli druga siatkówka jest przechowywana w całkowitej ciemności przy ciągłym przepływie karbogenu, zachowuje fioletowy kolor niewybielonego fotopigmentu i może zostać wykorzystana po zakończeniu eksperymentów z pierwszą siatkówką. Na początku celowanie mikropipetą w wybraną komórkę w preparacie siatkówki całego preparatu (wholemount) jest nieco trudne i wymaga wprawy, szczególnie podczas pracy w ciemności. Dodanie barwnika fluorescencyjnego do mikropipety może uprościć procedurę, ponieważ komórka i mikropipeta są jednocześnie widoczne przy wzbudzeniu dwufotonowym. Jednak dodawanie składników do roztworu wewnątrzkomórkowego może utrudnić utworzenie gigaseala lub pogorszyć jakość rejestracji. Po pomyślnym uzyskaniu, dobra rejestracja może trwać około 1 h.
Podczas gdy podczerwone światło wzbudzenia jest słabo pochłaniane przez fotoreceptory siatkówki, wzbudzone komórki wykazujące ekspresję GFP emitują światło w widzialnej części widma. Jednak fluorofory są wzbudzane jedynie w niewielkiej objętości ogniskowej, co prawdopodobnie nie zmieni stanu adaptacyjnego siatkówki. Co więcej, wzbudzenie jest wymagane jedynie do celowania i może zostać wyłączone podczas rejestracji odpowiedzi świetlnych.
Użyteczność tego podejścia została już wykazana w badaniach nad konkretnymi populacjami komórek amacrinowych14,18, z których rejestracje elektrofizjologiczne byłyby w przeciwnym razie możliwe jedynie przypadkowo12. Wreszcie, tę potężną technikę można dodatkowo rozszerzyć o podejście farmakologiczne14, obrazowanie Ca2+19 lub wykorzystanie wstrzykniętych komórek do badań immunocytochemicznych bądź mikroskopii elektronowej. W ten sposób można odsłonić funkcjonalną pozycję danego typu komórek w obwodach siatkówki.
Oświadczenia
Myszy obsługiwano i uśmiercano zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz przepisami dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach wydanymi przez rząd niemiecki.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1/2 dla K.D. i R.W.). Jesteśmy wdzięczni Thomasowi Eulerowi (Töbingen, Niemcy) za oprogramowanie do stymulacji światłem QDS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gogle noktowizyjne | Gutzeit GmbH, Warthausen, Niemcy | Xtron F1 | zawierają źródło światła 800 nm |
| Filtr optyczny | Schott AG | RG9 | filtr długoprzepustowy z odcięciem przy 690 nm |
| Nożyczki do tęczówki | Fine Science Tools | 14061-09 | zakrzywione z ostrzem 22 mm |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15000-00 | proste z ostrzem 3 mm |
| Komora rejestracyjna | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 typ A(TC) | komora teflonowa z zamontowanym od spodu szkiełkiem przedmiotowym (ok. 0.15 mm; nr 200-100 500 0182) |
| Podgrzewacz przepływowy | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | podgrzewana kaniula perfuzyjna z czujnikiem temperatury i kontrolerem temperatury |
| Skaningowy mikroskop laserowy | Leica Microsystems | DM LFS | sterowany oprogramowaniem Leica Confocal Software |
| Stół optyczny pneumatyczny | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Laser tytano-szafirowy z blokadą modów Tsunami | |
| Kamera CCD | pco AG, Kelheim, Niemcy | PixelFly QE | łącznie z oprogramowaniem sterującym |
| Szklane kapilary do mikropipet | Hilgenberg, Malsfeld, Niemcy | 1408411 | |
| Wytwornica mikropipet | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | barwnik fluorescencyjny |
| Neurobiotyna | Axxora | VC-SP-1120-M050 | tracery niefluorescencyjny |
| Streptawidyna-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Mikromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | zmotoryzowana jednostka manipulatora Mini25 z wyświetlaczem SM-5 |
| Wzmacniacz patch-clamp | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitaryzator | National Instruments | BNC-2090 | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Generator bodźców wzrokowych QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Niemcy | musi być obsługiwany na osobnym komputerze sterującym 2 monitorami (interfejs użytkownika, monitor bodźców) | |
| Filtry neutralne | ITOS, Mainz, Niemcy |
Bibliografia
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
Przedruki i uprawnienia
