Artykuł metodologiczny

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

DOI:

10.3791/3457

⸱

14 listopada 2011

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, University of Oldenburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie właściwości fizjologicznych i połączeń synaptycznych konkretnych neuronów w nienaruszonym tkance jest wyzwaniem w przypadku komórek, które nie posiadają wyraźnych cech morfologicznych lub wykazują niską gęstość populacji. Dotyczy to w szczególności komórek amacryny siatkówki, wyjątkowo różnorodnej klasy interneuronów, która u ssaków obejmuje około 30 podtypów1. Mimo że stanowią one kluczowy element przetwarzania wizualnego poprzez kształtowanie sygnału wyjściowego siatkówki2, większość tych podtypów nie została dotychczas zbadana w kontekście funkcjonalnym, ponieważ dotarcie do tych komórek za pomocą elektrody rejestrującej jest zdarzeniem rzadkim.

W ostatnim czasie udostępniono liczne linie myszy transgenicznych wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), pod kontrolą promotorów receptorów błonowych lub enzymów specyficznych jedynie dla określonego podzbioru neuronów w danej tkance3,4. Te uprzednio znakowane komórki są zatem dostępne dla ukierunkowanego celowania mikroelektrodami pod kontrolą mikroskopową, co umożliwia systematyczne badanie ich właściwości fizjologicznych in situ. Jednak wzbudzanie markerów fluorescencyjnych wiąże się z ryzykiem fototoksyczności dla żywej tkanki. W przypadku siatkówki podejście to jest dodatkowo utrudnione przez fakt, że światło wzbudzające powoduje odpowiednią stymulację fotoreceptorów, co prowadzi do blaknięcia fotobarwników i wprowadza obwody siatkówkowe w stan adaptacji do światła. Wadom tym zaradza się, stosując wzbudzanie w podczerwieni dostarczane przez laser z blokadą modów w krótkich impulsach z zakresu femtosekundowego. Wzbudzanie dwufotonowe dostarcza energii wystarczającej do wzbudzenia fluoroforu, a jednocześnie ogranicza wzbudzenie do niewielkiej objętości tkanki, minimalizując ryzyko uszkodzeń fotochemicznych5. Ponadto sprawia ono, że siatkówka pozostaje responsywna na bodźce wzrokowe, ponieważ światło podczerwone (>850 nm) jest słabo absorbowane przez fotobarwniki6.

W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie siatkówki transgenicznej myszy do przeprowadzenia elektrofizjologicznych rejestracji in situ z komórek wykazujących ekspresję GFP, które są celowane wizualnie za pomocą wzbudzenia dwufotonowego. Siatkówka jest przygotowywana i utrzymywana w ciemności i może być poddawana bodźcom optycznym projektowanym przez kondensor mikroskopu (Rycina 1). Rejestracja odpowiedzi świetlnych metodą patch-clamp może być połączona z wypełnianiem barwnikiem w celu ujawnienia morfologii oraz sprawdzenia sprzężenia barwnika za pośrednictwem złączy szczelinowych z sąsiednimi komórkami, co pozwala na badanie komórki docelowej na różnych poziomach eksperymentalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy opis zakłada, że eksperymentator posiada podstawową wiedzę na temat struktury siatkówki, techniki patch-clamp oraz mikroskopii dwufotonowej. Przydatne informacje dotyczące konfiguracji i obsługi zestawu do rejestracji patch-clamp oraz systemu obrazowania dwufotonowego znajdują się w ref. [7-12].

1. Przygotowanie zwierząt i tkanek

  1. Utrzymać mysz w adaptacji do ciemności przez co najmniej 3 h. W międzyczasie przygotować 1-2 l roztworu zewnątrzkomórkowego składającego się z (w mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 1.6 MgCl2, 25 NaHCO3, 10 D-glukozy i zrównoważyć jego pH do poziomu 7.4 poprzez napowietrzanie karbogenem (5 % CO2 w O2) w temperaturze pokojowej.
  2. Uśmiercić mysz w szczelnej komorze poprzez przedawkowanie CO2, a następnie wykonać zwichnięcie szyi. Tę procedurę oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w ciemności. Do oświetlenia pomocniczego należy używać światła o długiej fali (blokujemy krótkie fale z zimnego źródła światła za pomocą filtra długoprzepustowego 690 nm), aby zachować adaptację oczu zwierzęcia do ciemności (myszy mają słaby wzrok w czerwonej części widma światła). Do pracy w całkowitej ciemności należy używać oświetlenia podczerwienią (>800 nm) i nosić gogle noktowizyjne.
  3. Enukleować oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek irydologicznych i przenieść je do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym umieszczonego pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Usunąć rogówkę i ciało rzęskowe, otwierając gałkę oczną wzdłuż ora serrata (granicy między siatkówką a ciałem rzęskowym) za pomocą nożyczek sprężynowych (najpierw używamy lancetu, aby wykonać punkt startowy cięcia). Wyjąć soczewkę i ostrożnie oddzielić siatkówkę od nabłonka pigmentowego. Jeśli orientacja siatkówki jest kluczowa dla badania, należy ją oznaczyć zgodnie z Ref [12]. Przeciąć nerw wzrokowy między siatkówką a nabłonkiem pigmentowym i wyjąć siatkówkę z oczodołu. Należy zwrócić uwagę na kierunek powierzchni siatkówki: wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych, a zewnętrzna to strona fotoreceptorów.
  5. Usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie odciągając je za pomocą drewnianego wykałaczką. W tym celu należy użyć małej objętości roztworu zewnątrzkomórkowego, która zaledwie pokrywa siatkówkę. Ciało szkliste przylega do wykałaczki i może być przesunięte odśrodkowo z siatkówki. Następnie wykonać krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.
  6. Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną fotoreceptorów do dołu, rozłożyć ją na szklanym dnie (używamy do tego cienkiego pędzla) i unieruchomić za pomocą ramy ze stali nierdzewnej z nylonowym naciągiem. Drugą siatkówkę przygotować w ten sam sposób i utrzymać w adaptacji do ciemności w natlenionym karbogenem roztworze zewnątrzkomórkowym do późniejszego użycia.

2. Nagrania

  1. Zainstaluj komorę rejestracyjną w ciemności pod odwróconym mikroskopem laserowym skanującym i stale perfunduj preparat siatkówki (nie mniej niż 5 ml/min) nasyconym karboksygenem roztworem zewnątrzkomórkowym podgrzanym do 35 °C. Mikroskop (wyposażony również w kamerę CCD czułą na podczerwień) umieszczony jest na amortyzowanym stole optycznym wewnątrz klatki Faradaya w celu ekranowania elektronicznego. Przykryj klatkę nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności. Światło z monitorów komputerowych ekranujemy czerwoną przezroczystą folią.
  2. Dostrój laser podczerwony do 850-870 nm lub dłuższych fal, przełącz go w tryb blokowania mod (mode-locked) i wykorzystaj wzbudzenie dwufotonowe do wizualizacji komórek wykazujących ekspresję GFP. Osłab moc wyjściową lasera za pomocą filtrów neutralnych, sterowanych przez oprogramowanie do skanowania laserowego, do poziomu wystarczającego do wyraźnego rozpoznania fluorescencyjnej komórki.
  3. Do rejestracji metodą patch-clamp w trybie clamp prądowy (current-clamp) używaj szklanych mikropipet (stosujemy rurki z borokrzemianu o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i grubości ścianki 0,225 mm) wypełnionych roztworem wewnątrzkomórkowym składającym się z (w mM): 125 K-glukonianu, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,4 za pomocą KOH (co daje oporność pipety około 5 MΩ). Należy pamiętać, że inne warunki eksperymentalne, takie jak rejestracja w trybie clamp napięciowy (voltage-clamp), wymagają innego roztworu. Jeśli planowane są iniekcje barwnika, dodaj sondę fluorescencyjną (stosujemy 10 mM Alexa Fluor 594) lub cząsteczkę znacznika (3 % Neurobiotyny). Włóż mikropipetę do uchwytu i upewnij się, że elektroda odniesienia (drut srebrowy chlorowany) styka się z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.
  4. Przyłoż nacisk do mikropipety i wyceluj w komórkę wykazującą ekspresję GFP (stosujemy 40-krotny obiektyw imersyjny wodny; NA 1,25). Ciała komórek amakrynowych znajdują się w warstwie komórek zwojowych (bezpośrednio pod powierzchnią przy obecnej orientacji siatkówki) oraz w proksymalnej części wewnętrznej warstwy jądrowej (około 55-75 μm głęboko w preparacie). Przed kontaktem mikropipety z wybraną komórką należy przebić wewnętrzną błonę ograniczającą (osłonę zbudowaną z stopek końcowych gleju) na powierzchni siatkówki. Prawidłowe przebicie rozpoznaje się po wypłynięciu roztworu wewnątrzkomórkowego z końcówki mikropipety, co powoduje oddzielenie wewnętrznej błony ograniczającej od leżącej pod nią tkanki siatkówki, co można zaobserwować na obrazie transmisyjnym w podczerwieni zarejestrowanym przez kamerę IR-CCD.
  5. Zbliż się do wybranej komórki, porównując pozycję somy z obrazu dwufotonowego z obrazem z kamery IR-CCD pokazującym pozycję mikropipety rejestracyjnej. Należy zauważyć, że ten etap nie jest łatwy do wykonania i wymaga praktyki, ponieważ komórka wykazująca ekspresję GFP musi zostać rozpoznana na obrazie transmisyjnym w podczerwieni, aby móc skierować w jej stronę mikropipetę. Prawidłowe celowanie osiąga się, gdy końcówka mikropipety powoduje wgłębienie powierzchni komórki widoczne na obrazie dwufotonowym. Alternatywnie do tej procedury, użyj barwnika fluorescencyjnego (np. Alexa Fluor 594, 100 μM) w roztworze wewnątrzkomórkowym, aby ujawnić pozycję mikropipety na obrazie dwufotonowym. Podczerwone wzbudzenie dwufotonowe zapewnia wystarczającą fluorescencję tego barwnika, aby mikropipeta była widoczna. W tym celu dostosuj zakres detekcji w oprogramowaniu do skanowania laserowego tak, aby obejmował również fluorescencję czerwoną.
  6. Zwolnij nacisk z mikropipety i uzyskaj konfigurację patch-clamp całokomórkową (whole-cell) w trybie clamp prądowy. Użyteczna rejestracja powinna wykazać potencjał błonowy od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 min.
  7. Prezentuj bodźce wzrokowe stworzone przez oprogramowanie do stymulacji (stosujemy QDS autorstwa Thomasa Eulera z Uniwersytetu w Tübingen w Niemczech)11 na monitorze komputerowym. Dostosuj przestrzenną pozycję stymulacji tak, aby była wycentrowana na rejestrowanej komórce: zaznacz pozycję komórki na monitorze wyświetlającym obraz transmisyjny z kamery IR-CCD i wycentruj na niej bodziec punktowy. Dostrój intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralne do drogi wiązki. W celu kalibracji widma i intensywności monitora zapoznaj się z ref. [14]. Wybierz wydłużony odstęp międzybodźcowy (np. 15 s), aby uniknąć adaptacji. Umieść fotodiodę w drodze wiązki, aby rejestrować czas trwania bodźca.
  8. Rozpocznij protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi świetlne (stosujemy częstotliwość próbkowania 10 kHz z filtrowaniem przy 5 kHz dla komórek niegenerujących potencjałów czynnościowych; do rejestracji potencjałów czynnościowych zaleca się wyższą częstotliwość próbkowania, np. 20 kHz). Użyj oprogramowania do stymulacji świetlnej w celu wyzwolenia oprogramowania rejestrującego.
  9. W przypadku wypełniania barwnikiem pozwól odczynnikowi fluorescencyjnemu dyfundować do rejestrowanej komórki przez 30-45 min przed ostrożnym wycofaniem mikropipety z komórki. Należy uważać, aby nie wyciągnąć ciała komórki. Jeśli użyto niefluorescencyjnego znacznika Neurobiotyny, wymaga on wizualizacji poprzez wiązanie ze streptawidyną sprzężoną z fluorophorem (stosujemy streptawidynę-Cy3, 1:400 przez noc w 4 °C po 20-minutowej fiksacji siatkówki paraformaldehydem; w badaniach nad sprzęganiem barwnika inkubację ze streptawidyną można przedłużyć do 3 dni). Alternatywnie, iniekcje można przeprowadzać za pomocą ostrych elektrod (>100 MΩ), wprowadzając barwnik jontoforetycznie do nakłutej komórki (impulsy prostokątne: 0,25-1 nA, 100 ms, odstęp 100 ms, czas całkowity 3-6 min).

3. Reprezentatywne wyniki:

Poniższe wyniki pochodzą z badania przeprowadzonego na myszy wykazującej ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod promotorem hydroksylazy tyrozynowej13,14, enzymu katalizującego etap ograniczający szybkość syntezy katecholamin (mysz TH::GFP). Na podstawie jasności sygnału GFP można wyróżnić dwie odrębne populacje komórek (Rycina 2A). Komórki wykazujące wyższy poziom GFP posiadają ciała komórkowe zlokalizowane w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL, Rycina 2A) lub przemieszczone do warstwy komórek zwojowych (GCL, Rycina 2B) i warstwują się w środkowej części wewnętrznej warstwy splotowej (IPL, Rycina 2C). Zostały one zidentyfikowane jako komórki typu 214-16 i mogły być systematycznie badane pod kątem morfologii (Rycina 3) oraz aktywności elektrycznej (Rycina 4), mimo że gęstość ich populacji wynosi zaledwie 250 cells/mm2.

Schemat spektroskopii fotostymulacyjnej z laserem podczerwonym, PMT i przetwarzaniem danych dla badań optycznych.
Rycina 1. Schematyczny przedstawienie układu eksperymentalnego. Wzbudzenie dwufotonowe (czerwona przerywana ścieżka światła) komórek wykazujących ekspresję fluoroforu w nienaruszonej siatkówce umożliwia celowanie wizualne za pomocą mikropipety (zielona ścieżka światła emisji). Siatkówka jest poddawana bodźcom optycznym rzutowanym przez kondensor mikroskopu (żółta ścieżka światła), a następnie rejestrowane są komórkowe odpowiedzi świetlne.

Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca rozkład komórek, klastry komórek i sieć cytoszkieletu.
Rysunek 2. Komórki ekspresyjne GFP w preparacie płaskim siatkówki myszy TH::GFP. Na podstawie jasności sygnału GFP można wyróżnić dwie populacje: komórki typu 1 (komórki DA) zlokalizowane w INL, wykazujące słabą fluorescencję (A, patrz groty strzałek) oraz intensywnie znakowane komórki typu 2 z ciałami komórkowymi znajdującymi się w INL (A, patrz strzałki) lub przesuniętymi do GCL (B) oraz stratyfikacją dendrytów w warstwie S3 IPL (C). Paski skali, 50 μm.

Schemat sieci neuronalnej, etykiety EGFP i neurobiotyny, mikroskopia fluorescencyjna, wizualizacja komórek.
Rysunek 3. Morfologia komórki typu 2 po wstrzyknięciu znacznika neurobiotyny. Znacznik został następnie zwizualizowany poprzez wiązanie streptawidyny-Cy3 (magenta). Mikrofotografia, przedstawiająca również sygnał GFP (zieleń), jest projekcją stosów obrazów obejmujących GCL i IPL. Pasek skali, 50 μm.

Wykres aktywacji rodopsyny; natężenie światła względem czasu; odpowiedź elektrofizjologiczna przy -51 mV.
Rycina 4. Odpowiedzi świetlne komórki typu 2 zlokalizowanej w GCL. Wzorzec odpowiedzi na pełnopolową iluminację białym światłem o rosnącym natężeniu w zakresie skotopowym. Natężenie bodźca podano w liczbie fotoizomeryzacji na pręcik na sekundę (Rh*/rod/s). W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia bodźca (odpowiedź ON) i jego zakończenia (odpowiedź OFF) zastosowano przedłużony bodziec trwający 3 s.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta umożliwia badanie właściwości elektrycznych konkretnych neuronów w nienaruszonej siatkówce pod kontrolą wizualną, bez wpływania na stan adaptacyjny siatkówki. Jest ona szczególnie odpowiednia do charakterystyki komórek, które są obecnie słabo zbadane ze względu na niską gęstość populacji, takich jak większość populacji komórek amakrynowych. Wzbudzenie dwufotonowe pozwala na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście nawet z głębszych części tkanki17, co jest warunkiem niezbędnym do dokładnego celowania i udanego patch-clampowania komórek, szczególnie w warstwie INL o wysokiej gęstości ciał komórkowych.

Wyizolowana siatkówka mysia pozostaje żywotna przez 3-4 h w warunkach eksperymentalnych. Jeśli druga siatkówka jest przechowywana w całkowitej ciemności przy ciągłym przepływie karbogenu, zachowuje fioletowy kolor niewybielonego fotopigmentu i może zostać wykorzystana po zakończeniu eksperymentów z pierwszą siatkówką. Na początku celowanie mikropipetą w wybraną komórkę w preparacie siatkówki całego preparatu (wholemount) jest nieco trudne i wymaga wprawy, szczególnie podczas pracy w ciemności. Dodanie barwnika fluorescencyjnego do mikropipety może uprościć procedurę, ponieważ komórka i mikropipeta są jednocześnie widoczne przy wzbudzeniu dwufotonowym. Jednak dodawanie składników do roztworu wewnątrzkomórkowego może utrudnić utworzenie gigaseala lub pogorszyć jakość rejestracji. Po pomyślnym uzyskaniu, dobra rejestracja może trwać około 1 h.

Podczas gdy podczerwone światło wzbudzenia jest słabo pochłaniane przez fotoreceptory siatkówki, wzbudzone komórki wykazujące ekspresję GFP emitują światło w widzialnej części widma. Jednak fluorofory są wzbudzane jedynie w niewielkiej objętości ogniskowej, co prawdopodobnie nie zmieni stanu adaptacyjnego siatkówki. Co więcej, wzbudzenie jest wymagane jedynie do celowania i może zostać wyłączone podczas rejestracji odpowiedzi świetlnych.

Użyteczność tego podejścia została już wykazana w badaniach nad konkretnymi populacjami komórek amacrinowych14,18, z których rejestracje elektrofizjologiczne byłyby w przeciwnym razie możliwe jedynie przypadkowo12. Wreszcie, tę potężną technikę można dodatkowo rozszerzyć o podejście farmakologiczne14, obrazowanie Ca2+19 lub wykorzystanie wstrzykniętych komórek do badań immunocytochemicznych bądź mikroskopii elektronowej. W ten sposób można odsłonić funkcjonalną pozycję danego typu komórek w obwodach siatkówki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy obsługiwano i uśmiercano zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz przepisami dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach wydanymi przez rząd niemiecki.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1/2 dla K.D. i R.W.). Jesteśmy wdzięczni Thomasowi Eulerowi (Töbingen, Niemcy) za oprogramowanie do stymulacji światłem QDS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gogle noktowizyjneGutzeit GmbH, Warthausen, NiemcyXtron F1zawierają źródło światła 800 nm
Filtr optycznySchott AGRG9filtr długoprzepustowy z odcięciem przy 690 nm
Nożyczki do tęczówkiFine Science Tools14061-09zakrzywione z ostrzem 22 mm
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-00proste z ostrzem 3 mm
Komora rejestracyjnaLuigs & Neumann200-100 500 0180 typ A(TC)komora teflonowa z zamontowanym od spodu szkiełkiem przedmiotowym (ok. 0.15 mm; nr 200-100 500 0182)
Podgrzewacz przepływowyMulti Channel System MCS GmbHPH01, TC01podgrzewana kaniula perfuzyjna z czujnikiem temperatury i kontrolerem temperatury
Skaningowy mikroskop laserowyLeica MicrosystemsDM LFSsterowany oprogramowaniem Leica Confocal Software
Stół optyczny pneumatycznyNewport Corp.VH 3036W-OPT
LaserNewport Corp.Laser tytano-szafirowy z blokadą modów Tsunami
Kamera CCDpco AG, Kelheim, NiemcyPixelFly QEłącznie z oprogramowaniem sterującym
Szklane kapilary do mikropipetHilgenberg, Malsfeld, Niemcy1408411
Wytwornica mikropipetSutter Instrument Co.P-97
Alexa Fluor 594InvitrogenA-20004barwnik fluorescencyjny
NeurobiotynaAxxoraVC-SP-1120-M050tracery niefluorescencyjny
Streptawidyna-Cy3Dianova016-160-084
MikromanipulatorLuigs & Neumann210-100 000 0010zmotoryzowana jednostka manipulatora Mini25 z wyświetlaczem SM-5
Wzmacniacz patch-clampnpi electronicSEC-05LX npi
DigitaryzatorNational InstrumentsBNC-2090
Oprogramowanie do akwizycji danych WinWCPJohn Dempster, University of Scotland, Glasgow, UKhttp://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm
Generator bodźców wzrokowych QDSThomas Euler, University of Tübingen, Niemcymusi być obsługiwany na osobnym komputerze sterującym 2 monitorami (interfejs użytkownika, monitor bodźców)
Filtry neutralneITOS, Mainz, Niemcy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).
  2. Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
  3. Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
  4. Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
  5. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  6. Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
  8. Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
  9. Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
  10. Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
  11. Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
  12. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
  13. Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
  14. Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
  15. Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
  16. Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
  17. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  18. Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
  19. Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki wykazuj ce ekspresj GFPdwufotonowe wzbudzenierejestracja patch clamppreparat siatk wkimikroskopia konfokalnawype nianie barwnikiemrejestracja odpowiedzi na wiat owzbudzenie laserem podczerwonymkonfiguracja whole cellprotok stymulacji wzrokowej

Powiązane artykuły