Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Podsumowanie

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Streszczenie

Regulacja proliferacji komórek ma kluczowe znaczenie dla morfogenezy tkanek podczas rozwoju organizmów wielokomórkowych. Co więcej, utrata kontroli nad proliferacją komórek leży u podstaw patologii takich chorób jak nowotwory. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba możliwości badania proliferacji komórek i ilościowego określania proporcji komórek w każdej fazie cyklu komórkowego. Równie istotne jest jednoznaczne zidentyfikowanie komórek replikujących swoje DNA w obrębie większej populacji. Ponieważ komórka′Ponieważ decyzja o proliferacji zapada w fazie G1 bezpośrednio przed rozpoczęciem syntezy DNA i przejściem przez pozostałe etapy cyklu komórkowego, detekcja syntezy DNA na tym etapie pozwala na jednoznaczne określenie statusu regulacji wzrostu w eksperymentach z kulturami komórkowymi.

Zawartość DNA w komórkach można łatwo określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej komórek barwionych jodkiem propidyny, będącym fluorescencyjnym barwnikiem interkalującym DNA. Podobnie, aktywną syntezę DNA można określić ilościowo poprzez hodowlę komórek w obecności radioaktywnej tymidyny, zebranie komórek i pomiar wbudowania radioaktywności w frakcję nierozpuszczalną w kwasach. Posiadamy duże doświadczenie w analizie cyklu komórkowego i rekomendujemy inne podejście. Badamy proliferację komórek za pomocą barwienia bromodeoksyurydyną/fluorodeoksyurydyną (w skrócie BrdU), które wykrywa wbudowanie tych analogów tyminy w nowo zsyntetyzowane DNA. Znakowanie i barwienie komórek BrdU w połączeniu z barwieniem całkowitego DNA jodkiem propidyny oraz analizą za pomocą cytometrii przepływowej¹ zapewnia najdokładniejszy pomiar liczby komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Jest to nasza preferowana metoda, ponieważ łączy wykrywanie aktywnej syntezy DNA, poprzez barwienie BrdU z użyciem przeciwciał, z pomiarem całkowitej zawartości DNA za pomocą jodku propidyny. Pozwala to na wyraźne oddzielenie komórek w fazie G1 od wczesnej fazy S, lub późnej fazy S od fazy G2/M. Ponadto podejście to może być wykorzystane do badania wpływu wielu różnych bodźców komórkowych i czynników farmakologicznych na regulację progresji przez te różne fazy cyklu komórkowego.

W niniejszym raporcie opisujemy metody znakowania i barwienia hodowli komórkowych oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy również przykłady eksperymentalne pokazujące, w jaki sposób metoda ta może być wykorzystana do pomiaru efektów sygnałów hamujących wzrost pochodzących z cytokin, takich jak TGF-β1, oraz inhibitorów proliferacji, takich jak inhibitor kinazy zależnej od cyklin p27KIP1. Uwzględniliśmy także alternatywny protokół umożliwiający analizę pozycji w cyklu komórkowym subpopulacji komórek w obrębie większej hodowli⁵. W tym przypadku demonstrujemy, jak wykryć zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach transfekowanych genem retinoblastomy, nawet gdy stanowią one niewielką mniejszość w porównaniu do komórek nietransfekowanych w tej samej hodowli. Przykłady te ilustrują liczne sposoby wykorzystania i adaptacji barwienia DNA oraz cytometrii przepływowej do badania fundamentalnych kwestii kontroli cyklu komórkowego ssaków.

Protokół

1. Znakowanie i fiksacja komórek

1. Na 1 godzinę przedy zbieraniem komórek dodać 1 μL odczynnika do znakowania proliferacji komórek (BrdU) na każdy mL pożywki hodowlanej (rozcieńczenie 1 do 1000). Czas znakowania może wymagać wydłużenia w przypadku wolniej rosnących komórek.
2. Aby zebrać komórki, odessać pożywkę hodowlaną i dokładnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Powtórzyć czynność, aby całkowicie usunąć pozostałości pożywki.
3. Przemyć hodowle szybko po raz trzeci za pomocą PBS zawierającego 3mM EDTA, a następnie dokładnie odessać roztwór.
4. Do każdej płytki dodać niewielką objętość PBS zawierającego 3mM EDTA (optymalnie 0,5 mL dla płytki o średnicy 6 cm). Inkubować w temperaturze 22°C przez około 5 minut w celu odlepienia komórek. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mL.
5. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 minut do czasu powstania osadu, usunąć nadsącz i dokładnie resuspendować w 100 μL PBS.
6. Utrwalić komórki, dodając po kroplach 5 mL 95% EtOH podczas mieszania na wortexie. Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc.

2. Denaturacja i barwienie BrdU oraz DNA

1. Odwiruj komórki przy 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy i usunąć 95% EtOH. Resuspenduj w 1 mL 2N HCl i 0,5% Tx-100, dodając roztwór kroplami podczas mieszania w wortexie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Odwiruj w ten sam sposób, co w sekcji 2.1, i ostrożnie odessij nadosad, ponieważ na tym etapie komórki tworzą bardzo luźny osad. Delikatnie resuspenduj w 1 mL 0,1M NaB₄O₇ (pH 8,5) i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Odwiruj komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i resuspenduj w 0,5 mL roztworu przeciwciał (PBS zawierający 1% BSA i 0,2% Tween-20) z przeciwciałami mysimi anty-BrdU w rozcieńczeniu 1 do 50. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Ponownie odwiruj komórki i resuspenduj w 50 mL roztworu przeciwciał zawierającego królicze przeciwciała wtórne anty-mysie sprzężone z FITC w rozcieńczeniu 1 do 25. Inkubuj przez 30 minut na blacie laboratoryjnym, chroniąc przed światłem.
5. Odwiruj komórki po raz ostatni i resuspenduj w 0,5 mL roztworu jodku propidyny i RNazy (roztwór PI-RNAse, PBS z 1% BSA, 10 mg/mL jodku propidyny, 0,25 mg/mL RNazy A) i inkubuj w ciemności w temperaturze 37°C przez 30 minut. Alternatywnie RNA można trawić przez noc w temperaturze 4°C w ciemności.
6. Przepuść roztwór przez sito do komórek, aby usunąć agregaty, i zbierz pojedyncze komórki do odpowiedniej probówki w celu analizy na cytometrze przepływowym. Próbki powinny być ponownie chronione przed bezpośrednią ekspozycją na światło.

3. Analiza metodą cytometrii przepływowej

1. Komórki należy analizować za pomocą standardowego cytometru przepływowego, który umożliwia odróżnienie dubletów (dwóch komórek przechodzących przez celę przepływową jako jedna) i posiada odpowiednią zdolność detekcji jodku propidyny oraz FITC. Pojedyncze komórki w tej aplikacji cytometrii przepływowej można wykryć poprzez bramkowanie zdarzeń na podstawie populacji rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) oraz wykorzystując właściwości barwienia DNA jodkiem propidyny. Wygląd wykresu kropkowego służącego do dyskryminacji dubletów różni się w zależności od cytometru przepływowego i zależy od właściwości barwienia jodkiem propidyny; w celu konfiguracji dyskryminatora dubletów w analizie należy skonsultować się z lokalnym ośrodkiem cytometrii przepływowej. Zasadniczo, w asynchronicznie proliferującej populacji komórek, pojedyncze komórki stanowią zazwyczaj dwa najliczniejsze piki (DNA 2N i 4N) na wykresie dyskryminacji dubletów i wokół nich należy wyznaczyć bramkę. Pozwoli to na zaznaczenie zdarzeń pojedynczych komórek, które będą wykorzystywane we wszystkich poniższych analizach.
2. Pierwszą analizowaną próbką powinna być asynchronicznie proliferująca hodowla, służąca jako kontrola pozytywna dla barwienia i konfiguracji cytometru przepływowego. Należy dostosować czułość fotopowielaczy dla barwienia jodkiem propidyny w taki sposób, aby piki 2N i 4N dla pojedynczych komórek były wyśrodkowane na wartościach 200 i 400 (jednostki arbitralne) na osi X. Często barwimy dużą ilość takich komórek, aby upewnić się, że wszystkie parametry cytometru przepływowego zostały odpowiednio dostrojone bez zużycia całej tej próbki. Kontrola pozytywna jest również pomocna dla nowych użytkowników w zapoznaniu się z obsługą cytometru przepływowego.
3. Należy dostosować czułość fotopowielacza dla detekcji FITC tak, aby populacje G1 i G2/M znajdowały się powyżej poziomu tła. Komórki pozytywne pod kątem BrdU powinny być około 10 razy jaśniejsze, a oś Y powinna być wyświetlana w skali logarytmicznej. Czasami pomocne jest uwzględnienie kontroli negatywnej dla barwienia BrdU (poprzez zastąpienie przeciwciał anty-BrdU niespecyficznym IgG w kroku 2.3 powyżej), aby wyraźnie odróżnić komórki zabarwione pozytywnie.
4. Należy dostosować kompensację między jodkiem propidyny a FITC w taki sposób, aby pojedyncze zdarzenia zarejestrowane przez cytometr przepływowy tworzyły łuk w kształcie podkowy, od G1 w lewym dolnym rogu, przez fazę S, aż do prawego dolnego rogu dla G2/M. Zasady i zastosowanie cytometrii przepływowej oraz odniesienia do konkretnych aplikacji zostały szerzej omówione w następującej literaturze².

4. Analiza danych

1. Dla każdej próbki należy zebrać od 5 000 do 10 000 zdarzeń pojedynczych komórek w pożądanym zakresie zawartości DNA, aby mieć pewność, że populacja komórek w hodowli została dokładnie przebadana.
2. Po pomiarze zawartości jodu propidyniowego i BrdU komórki muszą zostać przypisane do faz G1, S lub G2/M. Należy to zrobić poprzez wyznaczenie bram wokół dwóch populacji negatywnych pod kątem BrdU, wycentrowanych na wartościach 200 i 400 (odpowiednio dla G1 i G2/M). Wszystko powyżej tych obszarów powinno zostać objęte jedną bramą mierzącą fazę S (Rys. 1A). Procent komórek w każdej bramie reprezentuje względną liczbę komórek w fazach G1, S i G2/M (Rys. 1B).

5. Alternatywny protokół analizy cyklu komórkowego w mieszanej populacji komórek

1. Ten alternatywny protokół jest najbardziej przydatny w sytuacjach, gdy transfekcja wektorów ekspresyjnych rutynowo skutkuje niskim odsetkiem komórek wykazujących ekspresję interesującego produktu genu lub gdy selekcja czystej populacji komórek za pomocą leków jest niepraktyczna. Prowadzi to do sytuacji, w której stosunkowo niewielka proporcja interesujących komórek jest zanieczyszczona dużą populacją komórek nietransdukowanych. W takim przypadku należy przeprowadzić ko-transfekcję plazmidów ekspresujących interesujący gen lub shRNA wraz z plazmidem ekspresującym marker do wykrywania komórek transfekowanych za pomocą cytometrii przepływowej, taki jak zakotwiczony w błonie GFP³ lub obcy marker powierzchni komórkowej, np. CD19⁴ lub CD20⁵.
2. Na potrzeby niniejszego protokołu jako przykład posłuży barwienie CD20, jednak barwienie CD19 przebiega w sposób niemal identyczny. W przypadku transfekcji CD20 nie ma potrzeby znakowania BrdU; należy po prostu zebrać komórki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.5 powyżej i zabarwić je, dodając 20 μL przeciwciał anty-CD20 koniugowanych z FITC do komórek w temperaturze 4°C przez 20 minut w ciemności. Komórki należy utrwalić zgodnie z opisem w kroku 1.6. Komórki można ponownie przechowywać przez co najmniej miesiąc w temperaturze 4°C w ciemności. W przypadku wykrywania GFP należy pominąć etap barwienia przeciwciałami, a następnie utrwalić i przechowywać komórki zgodnie z opisem.
3. Rehydratyzować komórki poprzez wirowanie w wirówce przy 500 x g przez 5 minut i ponowne zawieszenie w 5 mL PBS zawierającego 1% BSA.
4. Ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut i zawiesić je w 0,5 mL roztworu jodku propidyny i RNazy, zgodnie z opisem w sekcji 2.5 powyżej.
5. Następnie postępować zgodnie z instrukcjami przygotowania komórek w punkcie 2.6 oraz instrukcjami analizy w punktach 3.1 i 3.2.
6. Dostosować czułość fotopowielacza dla detekcji FITC w taki sposób, aby niezabarwione komórki znajdowały się powyżej tła. Idealnie komórki CD20-FITC dodatnie powinny być od 10X do 100X intensywniej zabarwione niż tło, a oś Y tego wykresu powinna być przedstawiona w skali logarytmicznej (Rys. 2A). Do wyświetlenia na histogramie jodku propidyny względem liczby komórek, jak pokazano na Rys. 2C, należy wybrać komórki CD20 dodatnie, które są 10X jaśniejsze od tła (i mają barwienie jodkiem propidyny między 200 a 400). Dla linii komórkowych eksponujących markery, które łatwo barwią się intensywnie (tj. 10X do 100X powyżej tła), próg odcięcia dla CD20 dodatnich należy ustawić na poziomie 10X tła. Włączenie słabiej zabarwionych komórek zwiększa zmienność w tych eksperymentach, prawdopodobnie dlatego, że interesujący gen jest w tych komórkach również słabo ekspresowany. Dla linii komórkowych, które dają jedynie słabo zabarwione komórki CD20 dodatnie (tj. mniej niż 10X tła), wyznaczenie progu odcięcia należy przeprowadzić z wykorzystaniem kontroli negatywnej składającej się z zabarwionych na CD20, nietransfekowanych komórek.
7. Dla każdej próbki należy zebrać co najmniej 1000 zdarzeń CD20 dodatnich. Eksperymenty z liczbą zdarzeń mniejszą niż 1000 będą wykazywać wysoką zmienność. Pakiety oprogramowania takie jak ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems) oraz Flow Jo (Tree Star) wykorzystują matematyczne oszacowania populacji G1, S i G2/M, które wpływają na kształt krzywej na histogramach, takich jak te przedstawione na Rys. 2B i C.

6. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiamy trzy przykłady eksperymentalnych analiz cyklu komórkowego z wykorzystaniem naszych metod. Pierwszy z nich wykorzystuje retrowirusową ekspresję inhibitora kinazy zależnej od cyklin p27KIP1 w zarodkowych fibroblastach mysich. Dwadzieścia cztery godziny po zakończeniu selekcji lekiem w celu wyłonienia zainfekowanych wirusem komórek, komórki poddano pulsowemu znakowaniu BrdU przez jedną godzinę. W tym eksperymencie ektopowa ekspresja inhibitora służy do zatrzymania proliferacji komórek (Ryc. 3A i B). Jak pokazano na Ryc. 3B, w odpowiedzi na p27 w bramce fazy S widoczna jest niewielka liczba zdarzeń BrdU-dodatnich. Podobnie, procent komórek w fazie S dla komórek wykazujących ekspresję p27 jest bardzo niski, co przedstawiono na Ryc. 3C. Ten rodzaj analizy okazał się bardzo skuteczny w charakteryzowaniu defektów kontroli cyklu komórkowego w komórkach pochodzących z różnych szczepów myszy z celowanym nokautem genów^{6, 7, 8}.

W drugim eksperymencie nietransformowane komórki nabłonka gruczołu mlekowego (MCF10A) poddano działaniu cytokiny hamującej wzrost, czynnika wzrostu TGF-beta 1 (TGF-β1), przez 24 godziny. Bezpośrednio przed zebraniem komórki znakowano BrdU przez cztery godziny. Jak pokazano na Ryc. 4, znakowanie BrdU w komórkach w fazie S jest znacznie ograniczone przez sygnalizację TGF-β1; specyficzność naszego barwienia została również potwierdzona za pomocą negatywnej kontroli z użyciem IgG (Ryc. 4C). Ilościowe określenie różnych faz cyklu komórkowego potwierdza, że TGF-β1 hamuje przede wszystkim proliferację w fazie G1 cyklu komórkowego, co prowadzi do akumulacji komórek w tej fazie.

W naszym ostatnim przykładzie komórki SaOS-2 z niedoborem pRB zostały przetransfekowane wektorem ekspresyjnym CMV-CD20 oraz albo CMV-RB, albo CMV-β-Gal jako kontrolą. Trzy dni po transfekcji komórki zostały zebrane, zabarwione i utrwalone. Analizę cytometryczną tych komórek przedstawiono na Rys. 5. Przedstawiono na nim rozkład cyklu komórkowego w komórkach przetransfekowanych kontrolą negatywną (Rys. 5A) w porównaniu z rozkładem po 72 godzinach ekspresji pRB (Rys. 5B). Po dopasowaniu krzywej za pomocą oprogramowania Multi Cycle, bezpośrednie porównanie proporcji faz cyklu komórkowego przedstawiono na Rys. 5C. Wykazuje to akumulację komórek w fazie G1 po ekspresji pRB oraz względne zmniejszenie liczby komórek w fazach S i G2/M. Wykorzystaliśmy warianty tego testu do szeroko zakrojonych badań nad mechanizmami zatrzymania w fazie G1^{9, 10, 11, 12, 13}.

Przykłady te demonstrują, w jaki sposób można mierzyć kontrolę cyklu komórkowego w odpowiedzi na różne bodźce lub manipulacje komórkowe. Podejście to może zatem zostać dostosowane do wielu zastosowań wymagających pomiaru fazy cyklu komórkowego w eksperymentach z wykorzystaniem hodowli komórkowych.

Rycina 1. Ilościowe określenie faz cyklu komórkowego za pomocą połączonego barwienia jodkiem propidyny i BrdU (PI-BrdU). (A) Ten panel przedstawia trójwymiarową cytometrię przepływową komórek barwionych jodkiem propidyny i BrdU. Należy zauważyć, że komórki o zawartości DNA 2N i 4N są wyśrodkowane nad znacznikami 200 i 400 na skali osi X dla intensywności barwienia jodkiem propidyny. Intensywność barwienia BrdU jest mierzona w skali logarytmicznej na osi Y. Zwróć uwagę na położenie bram użytych do ilościowego oznaczenia komórek w fazach G1, S i G2/M cyklu komórkowego. (B) Na tym wykresie przedstawiono względną proporcję komórek w każdej z bram G1, S i G2/M z panelu A.

Rysunek 2. Ilościowe oznaczenie faz cyklu komórkowego w wybranych komórkach przy użyciu jodku propidium i markera powierzchniowego CD20. (A) Ten panel przedstawia barwienie jodkiem propidium i CD20 dla mieszaniny komórek, z których niektóre ektopowo ekspresują CD20 i pRB. Należy zauważyć, że komórki z zawartością DNA 2N i 4N (najliczniejsze populacje) są wycentrowane nad znacznikami 200 i 400 na osi X. Położenie bramki CD20 + wybiera komórki, które są zabarwione co najmniej 10X jaśniej niż tło. (B) Przedstawiono wykres liczby komórek względem intensywności barwienia jodkiem propidium dla komórek CD20-ujemnych z panelu A, które proliferują asynchronicznie. (C) Analogiczny wykres przedstawiono dla komórek CD20-dodatnich z panelu A, u których wywołano zatrzymanie cyklu poprzez ekspresję pRB i które zawierają głównie komórki o treści DNA 2N. Dowodzi to, że przy użyciu tej techniki barwienia można odróżnić zatrzymaną subpopulację od pozostałych komórek w tej hodowli.

Rysunek 3. Hamowanie proliferacji komórek przez p27KIP1. (A) Analiza PI-BrdU służy do pomiaru faz cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferującej populacji komórek transdukowanych pustym wektorem retrowirusowym pBABE. (B) Analogiczna analiza komórek transdukowanych pBABE-p27. Zwróć uwagę na brak komórek w fazie S oraz większą intensywność zdarzeń w bramkach G1 i G2/M. (C) Ilościowe oznaczenie komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferujących komórkach kontrolnych oraz komórkach wykazujących ekspresję p27.

Rycina 4. Hamowanie proliferacji komórek przez TGF-β1 (A) Analiza PI-BrdU asynchronicznie proliferujących komórek MCF10A. (B) Analiza komórek traktowanych 100 pM TGF-β1 przez 24 godziny. Zwróć uwagę na akumulację komórek głównie w fazie G1 cyklu komórkowego. (C) Walidacja barwienia BrdU poprzez zastąpienie przeciwciała pierwszorzędowego anty-BrdU nieswoistą kontrolą IgG w asynchronicznie proliferujących komórkach. (D) Graficzna kwantyfikacja poszczególnych faz cyklu komórkowego z paneli A i B.

Rycina 5. Hamowanie proliferacji komórek przez pRB. (A) Przedstawiono liczbę komórek w stosunku do barwienia jodkiem propidyny w komórkach transfekowanych CD20 i ß-gal. Jest to istotna kontrola, ponieważ transfekcja może częściowo synchronizować komórki, sprawiając, że populacja nietransfekowana (komórki CD20-) staje się niewłaściwą kontrolą dla transfekowanej subpopulacji. Komórki transfekowane muszą być porównywane z innymi komórkami transfekowanymi w analogiczny sposób. (B) Wykres liczby komórek w stosunku do barwienia jodkiem propidyny dla komórek transfekowanych CD20 i pRB. Zwróć uwagę na niemal wyłączną obecność piku 2N. (C) Graficzna reprezentacja proporcji faz cyklu komórkowego wyznaczonych z A i B przy użyciu metod dopasowania krzywych w oprogramowaniu Multi Cycle.

Dyskusja

W naszym doświadczeniu sukces w stosowaniu tych technik zależy od kilku kluczowych kontroli i warunków eksperymentalnych. Jedną z nich jest ustalenie kontroli asynchronicznie proliferujących do wykorzystania w tych doświadczeniach. Kontrola ta służy trzem istotnym celom. Po pierwsze, zapewnia ona, że warunki hodowli zastosowane dla wszystkich próbek eksperymentalnych są odpowiednie do podtrzymania ciągłej proliferacji w przypadku braku traktowania. Próbka ta służy również jako kontrola pozytywna dla metodologii barwienia, aby upewnić się, że komórki BrdU-dodatnie lub CD20-dodatnie mogą zostać wykryte, gdy są obecne. Wreszcie, próbka ta jest wykorzystywana do kalibracji cytometru przepływowego. Próbkę kontrolną tę można wykorzystać do dostrojenia intensywności barwienia jodkiem propidium, aby wykryć komórki 2N i 4N odpowiednio przy wartościach 200 i 400. Ponadto czułość detekcji BrdU lub CD20 można dostosować tak, aby sygnały negatywne i pozytywne były wycentrowane, jak pokazano na Rysunkach 1A i 2A. Gdy wszystkie próbki mają podobne stężenie komórek w roztworze PI-RNase, konieczność wprowadzania korekt w ustawieniach cytometru podczas analizy kolejnych próbek jest minimalna. Jest to istotne z powodów przedstawionych na Rys. 4B i 5B, gdzie silna akumulacja w fazie G1 tworzy w zasadzie pojedynczy pik G1, który mógłby zostać błędnie zinterpretowany jako faza G2/M.

Reprezentatywne eksperymenty wskazują również na inne istotne kwestie. Po pierwsze, demonstrują one, że pobieranie i znakowanie BrdU mogą różnić się w zależności od typu komórek. Z tego powodu ważne jest empiryczne określenie długości impulsu oraz warunków barwienia niezbędnych do odpowiedniego wykrycia komórek w fazie S. Generalnie typy komórek, które w hodowli ulegają podwojeniu w ciągu 24 godzin lub krócej, mogą zostać znakowane BrdU w ciągu godziny. Wolniej rosnące typy komórek mogą wymagać dłuższych impulsów oraz modyfikacji warunków i czasu barwienia przeciwciałami. Komórki MCF10A są w tym względzie doskonałym przykładem, ponieważ były one znakowane BrdU przez cztery godziny i barwione dwukrotnym standardowym stężeniem przeciwciał przez cztery razy dłuższy czas. Badacze powinni uważać, aby czas znakowania BrdU nie przekroczył 6 godzin, nawet w przypadku bardzo wolno rosnących komórek, ponieważ może to błędnie doprowadzić do włączenia komórek w fazie G2/M do populacji w fazie S. Po drugie, porównując efekty ekspresji p27KIP1 z efektami TGF-β1, wyraźnie widać, że p27 może indukować akumulację w fazie G1 lub G2/M, podczas gdy sygnalizacja TGF-β1 indukuje zatrzymanie w fazie G1. Tradycyjne metody wykrywania proliferacji, takie jak wbudowywanie ³H-tymidyny i liczenie scyntylacyjne, nie są w stanie rozróżnić tych możliwości.

W naszym alternatywnym protokole demonstrujemy wykrywanie subpopulacji komórek w większej populacji nietransfekowanej. Ważne jest, aby empirycznie określić najbardziej odpowiedni reporter do wykrywania komórek transfekowanych. Z naszego doświadczenia wynika, że niektóre typy komórek słabo eksponują markery powierzchniowe lub mogą′nie transportują ich prawidłowo do błony plazmatycznej, co skutkuje brakiem możliwości wykrycia komórek transfektowanych. Podobnie nie wszystkie komórki tolerują formę GFP związaną z błoną. Wybór najodpowiedniejszego reporteru powinien nastąpić po ocenie wydajności transfekcji reportera oraz względnej intensywności ekspresji w porównaniu z nietransfektowanymi kontrolami. W idealnym przypadku heterologiczna ekspresja tych cząsteczek będzie dobrze tolerowana, co sugeruje, że markery mają niewielki lub żaden wpływ na rozkład cyklu komórkowego.

Jednym z ograniczeń tego rodzaju podejść w cytometrii przepływowej jest fakt, że pozwalają one jedynie na ustalenie względnej liczebności poszczególnych faz cyklu komórkowego w stosunku do siebie nawzajem. Z tego powodu nie jest jednoznaczne, czy ekspresja p27 przedstawiona na rysunku 3 rzeczywiście indukuje zatrzymanie w fazach G1 i G2/M, czy jedynie spowalnia przejście przez te fazy w porównaniu z fazą S. Możliwości te można badać dalej, traktując równoległą próbkę komórek inhibitorem mitozy, takim jak nocodazole, lub inhibitorem G1/S, takim jak afidikolina. Ponieważ leki te wywołują dominujące zatrzymanie odpowiednio w fazie M lub wczesnej fazie S, komórki proliferujące powoli będą gromadzić się w punkcie zatrzymania indukowanego przez lek. Na przykład komórki zatrzymane w fazie G1 z powodu ekspresji pRB pozostaną w fazie G1 mimo zastosowania nocodazole, podczas gdy komórki kontrolne będą gromadzić się w fazie M¹³.

Wszystkie te podejścia eksperymentalne razem stanowią elastyczną metodologię, którą można zastosować w szerokim zakresie zagadnień badawczych dotyczących cyklu komórkowego ssaków. Pozwalają one na łatwe wykrywanie zmian w przebiegu cyklu komórkowego oraz ilościowe określanie różnic w porównaniu z grupami kontrolnymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynik do znakowania proliferacji komórek	GE Healthcare	RPN201
Przeciwciała anty-BrdU	BD Biosciences	347580
Przeciwciała anty-mysie koniugowane z FITC	Vector Laboratories	FI-2000
Filtry do szczepów komórkowych	BD Biosciences	352235
Przeciwciała anty-CD20	BD Biosciences	347673
Oprogramowanie Multi Cycle	Phoenix Flow Systems	N/A