Wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Podsumowanie

Test pull-down kalmoduliny (CaM) jest skutecznym sposobem badania oddziaływań CaM z różnymi białkami. Metoda ta wykorzystuje paciorki sefarozowe z CaM do wydajnej i specyficznej analizy białek wiążących CaM. Stanowi ona istotne narzędzie do badania sygnalizacji CaM w funkcjach komórkowych.

Streszczenie

Wapń (Ca²⁺) jest jonem kluczowym w regulacji funkcji komórkowych poprzez szereg mechanizmów. Znaczna część sygnalizacji Ca²⁺ jest przekazywana przez białko wiążące wapń, znane jako kalmodulina (CaM)^1,2. CaM bierze udział na wielu poziomach w niemal wszystkich procesach komórkowych, w tym w apoptozie, metabolizmie, skurczu mięśni gładkich, plastyczności synaptycznej, wzroście nerwów, zapaleniu i odpowiedzi immunologicznej. Liczne białka pomagają regulować te szlaki poprzez oddziaływania z CaM. Wiele z tych oddziaływań zależy od konformacji CaM, która wyraźnie różni się w stanie związania z Ca²⁺ (Ca²⁺-CaM) w porównaniu ze stanem wolnym od Ca²⁺ (ApoCaM)³.

Podczas gdy większość białek docelowych wiąże kompleks Ca²⁺-CaM, niektóre białka wiążą wyłącznie ApoCaM. Niektóre wiążą CaM poprzez swoją domenę IQ, w tym neuromodulina⁴, neurogranina (Ng)⁵ oraz niektóre miozyny⁶. Wykazano, że białka te odgrywają istotną rolę odpowiednio w funkcji presynaptycznej⁷, funkcji postsynaptycznej⁸ oraz w skurczu mięśni⁹. Ich zdolność do wiązania i uwalniania CaM w obecności lub przy braku Ca²⁺ ma kluczowe znaczenie dla ich funkcjonowania. Z kolei wiele białek wiąże wyłącznie Ca²⁺-CaM i wymaga tego wiązania do swojej aktywacji. Przykłady obejmują kinazę lekkich łańcuchów miozyny¹⁰, kinazy (CaMKs)¹¹ i fosfatazy (np. kalcyneurynę)¹² zależne od Ca²⁺/CaM oraz kinazę spektryny¹³, które wywołują szereg bezpośrednich i wtórnych efektów¹⁴.

Wpływ tych białek na funkcje komórkowe często zależy od ich zdolności do wiązania się z CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Na przykład badaliśmy znaczenie wiązania Ng-CaM w funkcji synaptycznej oraz to, jak różne mutacje wpływają na to wiązanie. Stworzyliśmy konstrukt Ng z tagiem GFP z konkretnymi mutacjami w domenie IQ, które zmieniały zdolność Ng do wiązania CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Badanie tych różnych mutacji pozwoliło nam uzyskać cenny wgląd w istotne procesy zaangażowane w funkcję synaptyczną^8,15. Jednak w tego typu badaniach niezbędne jest wykazanie, że zmutowane białka wykazują oczekiwaną zmianę powinowactwa do CaM.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę badania zdolności białek do wiązania się z CaM w obecności lub przy braku Ca²⁺, wykorzystując CaMKII i Ng jako przykłady. Metoda ta jest formą chromatografii powinowactwa, określaną jako test pull-down z wykorzystaniem CaM. Wykorzystuje ona kuleczki CaM-Sepharose do badania białek wiążących się z CaM oraz wpływu Ca²⁺ na to wiązanie. Jest ona znacznie bardziej wydajna pod względem czasu i wymaga mniejszej ilości białka w porównaniu do chromatografii kolumnowej oraz innych testów. W całości stanowi to cenne narzędzie do badania sygnalizacji Ca²⁺/CaM oraz białek oddziałujących z CaM.

Protokół

Podstawowy schemat procedury, rozpoczynającej się od homogenatu, przedstawiono na Rysunku 1. Przewidywany czas od przygotowania ekstraktów komórkowych do elucji białek związanych z CaM wynosi około sześciu do siedmiu godzin.

1. Przygotowanie tkanki

1. Wstrzyknąć do organotypowych przekrojów hipokampa wirusa zawierającego plazmid ekspresyjny dla rekombinowanego białka zainteresowania (w tym przykładzie Ng z etykietą białka fluorescencyjnego GFP) i pozostawić tkankę na noc w celu ekspresji białka.
2. Około 12 do 18 godzin po wstrzyknięciu wirusa (zależnie od czasu ekspresji wiralnej), przygotować tkankę do pobrania. Do szalki Petriego dodać 1mL buforu do dyssekcji (10mM glukozy, 4mM KCl, 26mM NaHCO3, 233mM sacharozy, 5mM MgCl₂, 1mM CaCl₂ oraz 0,1% czerwieni fenolowej, nasyconego mieszanką 5% CO₂ i 95% O₂). Przenieść hodowaną tkankę/insert do szalki Petriego i dodać 2mL buforu do dyssekcji do insertu, aby zanurzyć tkankę.
3. Pobrać organotypową tkankę hipokampa (od 5 do 10 przekrojów), delikatnie oddzielając tkankę od membrany insertu za pomocą skalpela. Opcjonalnie można usunąć konkretny obszar zainteresowania (np. CA1). Przenieść zawieszoną tkankę do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5mL za pomocą odwróconej pipety Pasteura.
4. Wirować próbki przy 1 500 rcf przez 1 min, aby oddzielić tkankę od buforu do dyssekcji. Ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację, uważając, aby nie zaburzyć osadu.
5. Dla każdego użytego przekroju dodać do tkanki od 30 do 60 μL buforu do homogenizacji (150mM NaCl, 20mM Tris pH 7,5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptyny, 1μg/mL chemostatyny, 1μg/mL antipainy, 1μg/mL pepstatyny oraz 1% Triton X-100) i dokładnie zhomogenizować za pomocą tłuczka.
6. W celu usunięcia resztek komórkowych, wirować pozostały homogenat przy 1 100 rcf przez 10 min i ostrożnie usunąć nadsącz przez aspirację, unikając zanieczyszczenia osadem.
7. Odjąć 10% nadsączu jako próbkę wejściową (próbka 1). Pozostały nadsącz przechowywać w lodzie podczas przygotowywania kulek CaM-sepharose do użycia w kroku 3.

Uwaga: Wykorzystana w tym przypadku tkanka to organotypowe skrawki hipokampa. Można jednak użyć dysocjowanych neuronów lub dowolnego innego systemu hodowli komórkowej. W takim przypadku należy rozpocząć od kroku 1.4 po odpowiednim pobraniu tkanki.

2. Przygotowanie kulek do pull-down

Podczas pracy z kuleczkami ważne jest odzyskanie ich oraz maksymalizacja wydajności reakcji poprzez zapobieganie wysychaniu kuleczek na ściankach probówki. Aby to osiągnąć, najlepiej jest obrócić probówki na bok, pozwalając roztworowi zwilżyć kuleczki znajdujące się na ściankach, bezpośrednio przed wirowaniem.

1. Do każdego pull-downu pipetuj 400 μL zawiesiny kulek Calmodulin-Sepharose do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL z relatywnie płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię kontaktu i interakcję roztworów z kulekami podczas inkubacji.
2. Centryfuguj kuleczki przy 21 000 rcf przez 30 sekund i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie poruszyłeś osadu kulek.
3. Aby wypłukać kuleczki, dodaj 100 μL odpowiedniego buforu do homogenizacji zawierającego 2 mM CaCl₂ w przypadku pull-downu białek wiążących Ca²⁺-CaM lub 2 mM EDTA (znanego chelatora Ca²⁺) w przypadku kulek do pull-downu białek wiążących ApoCaM. Delikatnie opukaj probówkę, aby ponownie zawiesić kuleczki, i centryfuguj przy 1 500 rcf przez 1 min. Ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację, dbając o to, by nie poruszyć kuleczek.

Uwaga: We wszystkich etapach aspiracji zaleca się stosowanie końcówek do pipety z wąskim otworem (np. końcówek do nakładania żeli), aby umożliwić usunięcie roztworu bez usuwania kulek.

3. Wiązanie białek do sepharose-CaM

1. Podziel supernatant na dwie próbki o równej objętości. W zależności od warunków doświadczenia, dodaj do supernatantu odpowiednią ilość CaCl₂ lub EDTA, tak aby osiągnąć stężenie 2 mM dla każdego z nich.
2. Dodaj supernatant z kroku 1.7 do kulek wypłukanych w odpowiednim buforze homogenizacyjnym. Delikatnie stuknij probówką o blat, aby wymieszać zawartość.
3. Inkubuj próbki w temperaturze 4°C przez 3 h na wytrząsarce. Resuspenduj kulejki mniej więcej co 30 min, aby zwiększyć wydajność wiązania.
4. Odwiruj probówkę z próbkami i kulejkami przy 1 500 rcf przez 3 min.
5. Pobierz 50 µL supernatantu jako próbkę białka niezwiązanego (próbka 2), a pozostały supernatant ostrożnie usuń za pomocą aspiratora i odrzuć.
6. Wypłucz kulejki trzy razy zgodnie z opisem w kroku 2.3, używając 100 µL odpowiedniego buforu homogenizacyjnego.

4. Elucja

1. Dodaj do kulek 50μL buforu elucyjnego (50mM Tris-HCl pH 7.5 i 150mM NaCl) zawierającego przeciwstawne warunki (10mM CaCl₂ lub 10mM EDTA). Na przykład próbki, które zostały homogenizowane i związane w buforze zawierającym Ca²⁺, są eluowane w buforze elucyjnym zawierającym EDTA i odwrotnie.

Opcjonalnie: Podgrzanie buforu elucyjnego do 37°C przed dodaniem go do kulek może zwiększyć wydajność.

2. Inkubować roztwór z kuleczkami w temperaturze pokojowej przez 30 min na wytrząsarce. Mieszać kuleczki, delikatnie opukując probówkę mniej więcej co 5 min.
3. Wiruć kuleczki przy 1 500 rcf przez 3 min, a następnie ostrożnie odessać 50 μL supernatantu zawierającego białko związane (próbka 3). Należy uważać, aby nie poruszyć osadu kuleczek.
4. Dodać bufor do ładowania białek do wszystkich próbek (tj. do homogenatu, białka niezwiązanego i związanego, a także do białek wciąż związanych z kuleczkami).

Uwaga: Aby zmaksymalizować elucję (zwłaszcza w przypadku nieefektywnej elucji), przed podgrzaniem próbek należy dodać do kulek 50μL odpowiedniego buforu elucyjnego (np. dodanie buforu zawierającego EDTA do kulek związanych w CaCl₂), aby pomóc w elucji pozostałego związanego białka, a następnie powtórzyć kroki opisane w punkcie 4.3 w celu usunięcia pozostałych związanych białek.

5. SDS-PAGE i western blot

Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i przeanalizuj wyniki za pomocą western blotu, wykrywając interesujące białko oraz białko znane z wiązania CaM w przeciwstawnym wariancie jako kontrolę pozytywną.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2B przedstawia przykład testu CaM-pull-down badającego wiązanie CaM przez Ng znakowane GFP w porównaniu do endogennego Ng. W tym celu GFP-Ng wyeksprymowano nadekspresyjnie w naszych organotypowych skrawkach hipokampa przez noc, a następnie tkankę poddano homogenizacji. Homogenizat inkubowano z kuleczkami CaM-sepharose w obecności Ca²⁺ lub EDTA. Próbka wejściowa homogenizatu pokazuje, że GFP-Ng zostało wyeksprymowane obok endogennego Ng i kinazy II zależnej od Ca²⁺/CaM (CaMKII). Zgodnie z oczekiwaniami, opartymi na znanym wiązaniu endogennego Ng (przedstawionym na Rys. 2A), Ng znakowane GFP zostało eluowane wobec braku Ca²⁺ (białko związane przez EDTA) i nie zostało związane w obecności Ca²⁺ (Rys. 2B). W przeciwieństwie do tego, kontrola, CaMKII, została eluowana tylko w obecności Ca²⁺ (białko związane) i nie została związana w jego nieobecności (EDTA). Dowodzi to, że kuleczki CaM działały prawidłowo, a elucje były wydajne. Co najważniejsze, wykazuje to, że GFP-Ng wiąże się z ApoCaM w sposób podobny do formy endogennej, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienił funkcji naszego białka rekombinowanego.

Rycina 1. Schemat badania pull-down CaM
(A) Homogenat tkankowy jest wirowany w celu usunięcia szczątków komórkowych. Około 10% supernatantu jest pobierane jako próbka wejściowa (input) (1). Pozostały supernatant dzieli się po równo na różne warunki i dodaje odpowiednie odczynniki (CaCl₂ lub EDTA), aby sprawdzić wiązanie w tych warunkach. Każdy supernatant (zawierający CaCl₂ lub EDTA) nanosi się na odpowiednio przygotowane kulki CaM-sepharose i (B) inkubuje, aby umożliwić wiązanie. Niewiążące się białka są usuwane (2), a następnie (C) związane białka (3) są eluowane z kulek przy użyciu buforu elucyjnego (E.B.) zawierającego warunki przeciwstawne do warunków wiązania. Skład białkowy tych trzech próbek białkowych można analizować za pomocą SDS-PAGE i analizy western blot.

Rycina 2. A.) Schemat zależnego od Ca²⁺ wiązania i elucji CaM w analizie pull-down. Przedstawiono przykłady dwóch typów białek, które wiążą CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Neurogranina (Ng) reprezentuje białka wiążące apo-CaM, a CaMKII reprezentuje białka wiążące CaM bogatą w Ca²⁺. CaM przedstawiono w stanie dysocjowanym przed inkubacją z białkami z homogenatu. Po inkubacji w warunkach wysokich stężeń Ca²⁺ (2 mM) lub w obecności chelatora Ca²⁺, EDTA (2 mM), białka zwiążą się z CaM odpowiednio do tych warunków. Ng wiąże CaM w warunkach z EDTA, ponieważ obecność Ca²⁺ jest znikoma lub żadna, i zostałaby eluowana z kulek CaM-sepharose w obecności Ca²⁺. Natomiast CaMKII wiązałaby się z CaM w obecności wysokich ilości Ca²⁺ i dysocjowałaby po chelatacji Ca²⁺.
B.) Wyniki przykładowej analizy pull-down CaM. Rycina ta demonstruje oczekiwany końcowy wynik analizy pull-down z użyciem CaM-sepharose, w której próbki badano pod kątem obecności Ng i CaMKII. Zarówno endogenna Ng, jak i GFP-Ng są obecne w ścieżkach białek związanych z CaM w obecności EDTA. Ng nie wiąże się, gdy próbki są inkubowane z CaM w obecności Ca²⁺, co dowodzi, że Ng wiąże wyłącznie apo-CaM. Z kolei nasza kontrola pozytywna, CaMKII, wiąże się z CaM tylko w obecności Ca²⁺.

Dyskusja

Przedstawiony protokół wykorzystuje kulek CaM-sepharose do badania zależności białek wiążących CaM od stężenia Ca²⁺. Wiele białek wiąże CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Oddziaływania te mają ogromne znaczenie ze względu na liczbę białek wiążących CaM oraz ich krytyczną rolę w wielu szlakach sygnalizacyjnych. W niniejszym protokole kulek CaM-sepharose są używane do oddzielenia białek wiążących CaM z homogenatu tkankowego w obecności lub w braku Ca²⁺. Wyniki tego prostego podejścia pozwolą na ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kuleczki Calmodulin-Sepharose	GE Healthcare	17-0529-01
Przeciwciało anty-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Przeciwciało anty-neurogranina	EMD Millipore	07-425
Końcówki do pipet do nakładania żelu	Fisher Scientific	02-707-138	Stosować do odsysania nadnadkładzin
Probówki do mikrocentryfugi (2,0 mL)	Fisher Scientific	05-408-146	Stosować we wszystkich etapach z użyciem kuleczek calmodulin-sepharose