Ściąganie białek wiążących kalmodulinę

Summary

Test pull-down kalmoduliny (CaM) jest skutecznym sposobem na zbadanie interakcji CaM z różnymi białkami. Metoda ta wykorzystuje kulki CaM-sepharozy do wydajnej i specyficznej analizy białek wiążących CaM. Stanowi to ważne narzędzie do badania sygnalizacji CaM w funkcjonowaniu komórek.

Abstract

Wapń (Ca²⁺) jest jonem niezbędnym do regulacji funkcji komórkowych poprzez różne mechanizmy. Znaczna część sygnalizacji Ca^{2 +} odbywa się za pośrednictwem białka wiążącego wapń znanego jako kalmodulina (CaM)^1,2. CaM bierze udział na wielu poziomach w prawie wszystkich procesach komórkowych, w tym w apoptozie, metabolizmie, skurczu mięśni gładkich, plastyczności synaptycznej, wzroście nerwów, zapaleniu i odpowiedzi immunologicznej. Wiele białek pomaga regulować te szlaki poprzez ich interakcję z CaM. Wiele z tych oddziaływań zależy od konformacji CaM, która jest wyraźnie inna, gdy jest związana z Ca²⁺ (Ca²⁺-CaM), w przeciwieństwie do jej stanu wolnego od Ca²⁺ (ApoCaM)³.

Podczas gdy większość docelowych białek wiąże Ca²⁺-CaM, niektóre białka wiążą się tylko z ApoCaM. Niektóre wiążą CaM poprzez swoją domenę IQ, w tym neuromodulinę⁴, neurograninę (Ng)⁵ i niektóre miozyny⁶. Wykazano, że białka te odgrywają ważną rolę odpowiednio w funkcji presynaptycznej⁷, funkcji postsynaptycznej⁸ i skurczu mięśni⁹. Ich zdolność do wiązania i uwalniania CaM przy braku lub obecności Ca²⁺ ma kluczowe znaczenie dla ich funkcji. W przeciwieństwie do tego, wiele białek wiąże tylko Ca²⁺-CaM i wymaga tego wiązania do ich aktywacji. Przykłady obejmują kinazę łańcucha lekkiego^{miozyny 10}, kinazy zależne od^Ca2+/CaM (CaMKs)¹¹ i fosfatazy (np. kalcyneurynę)¹² oraz kinazę spektrynową¹³, które mają różne bezpośrednie i dalsze skutki14.

Wpływ tych białek na funkcje komórkowe jest często zależny od ich zdolności do wiązania się z CaM w sposób zależny od^Ca2+. Na przykład przetestowaliśmy znaczenie wiązania Ng-CaM w funkcji synaps i jak różne mutacje wpływają na to wiązanie. Wygenerowano konstrukt Ng znakowany GFP ze specyficznymi mutacjami w domenie IQ, które zmieniłyby zdolność Ng do wiązania CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Badanie tych różnych mutacji dało nam doskonały wgląd w ważne procesy związane z funkcjonowaniem synaps^8,15. Jednak w takich badaniach konieczne jest wykazanie, że zmutowane białka mają oczekiwane zmienione wiązanie z CaM.

Tutaj prezentujemy metodę testowania zdolności białek do wiązania się z CaM w obecności lub braku Ca²⁺, używając przykładów CaMKII i Ng. Metoda ta jest formą chromatografii powinowactwa określaną jako test ściągający CaM. Wykorzystuje kulki CaM-Sepharose do badania białek, które wiążą się z CaM i wpływu Ca²⁺ na to wiązanie. Jest znacznie bardziej efektywny czasowo i wymaga mniej białka w porównaniu z chromatografią kolumnową i innymi testami. W sumie stanowi to cenne narzędzie do badania sygnalizacji Ca²⁺/CaM i białek, które oddziałują z CaM.

Protocol

Zapoznaj się z Rysunkiem 1, aby zapoznać się z podstawowym schematem procedury rozpoczynającej się od homogenatu. Szacowany czas od przygotowania ekstraktów komórkowych do elucji białek związanych z CaM wynosi około sześciu do siedmiu godzin.

1. Przygotowanie tkanek

1. Wstrzyknąć organotypowe wycinki hipokampa wirusem zawierającym plazmid wyrażający rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania (w tym przykładzie białko zielone fluorescencyjne (GFP) znakowane Ng) i pozwolić tkance na ekspresję białka przez noc.
2. Około 12 do 18 godzin po wstrzyknięciu wirusa (w zależności od czasu ekspresji wirusa) przygotuj się do pobrania tkanki. Dodać 1 ml buforu do rozwarstwiania (10 mM glukozy, 4 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 233 mM sacharozy, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ i 0,1% czerwieni fenolowej, zagazowanej 5% CO₂ 95% O_{2 )} na szalkę Petriego. Przenieś hodowaną tkankę/wkładkę na szalkę Petriego i dodaj 2 ml buforu preparacyjnego do wkładki, aby zanurzyć tkankę.
3. Zebrać organotypową tkankę hipokampa (od 5 do 10 plastrów), delikatnie zeskrobując tkankę z błony wkłucia za pomocą skalpela. W szczególności możliwe jest również usunięcie określonego obszaru zainteresowania (np. CA1). Przenieś zawieszoną tkankę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą odwróconej pipety Pasteura.
4. Odwirować próbki w temperaturze 1,500 rcf przez 1 minutę w celu oddzielenia tkanki od buforu rozwarstwiającego. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
5. Do każdego użytego plastra dodaj od 30 do 60 μl buforu homogenizacyjnego (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml chemostatyny, 1 μg/ml leku przeciwbólowego, 1 μg/ml pepstatyny i 1% Triton X-100) do tkanki i dokładnie homogenizuj tłuczkiem.
6. W celu usunięcia resztek komórkowych należy odwirować pozostały homogenat w temperaturze 1,100 rcf przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację, unikając zanieczyszczenia z osadu.
7. Pobrać 10% supernatantu jako próbkę wsadu (próbka 1). Pozostałą supernatanty należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania kulek CaM-sepharozy do użycia w kroku 3.

Uwaga: Użyte tutaj tkanki to organotypowe plastry hipokampa. Można jednak użyć zdysocjowanych neuronów lub dowolnego innego systemu hodowli komórek. W takim przypadku należy rozpocząć od kroku 1.4 po pobraniu tkanki w odpowiedni sposób.

2. Przygotowanie koralików do ściągania

Podczas obchodzenia się z koralikami, ważne jest, aby je odzyskać i zmaksymalizować efektywność reakcji, zapobiegając wysychaniu koralików po bokach tuby. Aby to zrobić, najlepiej obrócić probówki na bok, pozwalając roztworowi zwilżyć kulki na ściankach probówki, bezpośrednio przed odwirowaniem.

1. Do każdego pociągnięcia pipetą należy pobrać 400 μl zawieszonych kulek kalmoduliny-sefarozy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml ze stosunkowo płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię i interakcję roztworów z kulkami podczas inkubacji.
2. Odwirować kulki w temperaturze 21 000 rcf przez 30 sekund i ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
3. Aby przepłukać kulki, dodać 100 μl odpowiedniego buforu homogenizacyjnego zawierającego 2 mM CaCl₂ do używanych do ściągania białek wiążących Ca^{2 +} CaM i 2 mM EDTA (znanego chelatora Ca²⁺) do kulek ściągających białka wiążące ApoCaM. Delikatnie postukaj w probówkę, aby ponownie zawiesić kulki i odwirować w temperaturze 1,500 rcf przez 1 minutę. Ostrożnie usuń supernatant przez aspirację, uważając, aby nie naruszyć kulek.

Uwaga: Do wszystkich etapów aspiracji zaleca się użycie końcówki do pipety z drobnym otworem (np. końcówki do ładowania żelem), aby umożliwić usunięcie roztworu bez usuwania kulek.

3. Wiązanie białek CaM-sefaroza

1. Podziel swój supernatant na dwa warunki zawierające równą objętość. W zależności od stanu zdrowia dodaj odpowiednią ilość CaCl₂ lub EDTA do supernatantu o stężeniu do 2 mM dla każdego z nich.
2. Dodać supernatant z kroku 1.7 do kulek umytych w odpowiednim buforze homogenizacyjnym. Delikatnie postukaj w tubkę, aby wymieszać.
3. Próbki inkubować w temperaturze 4°C przez 3 godziny na wytrząsarce. Ponownie zawieszaj koraliki co około 30 minut, aby zwiększyć wydajność wiązania.
4. Probówka wirówkowa zawierająca próbki i kulki o ciśnieniu 1 500 rcf przez 3 min.
5. Pobrać 50 μl supernatantu jako próbkę niezwiązanego białka (próbka 2) i ostrożnie usunąć pozostały supernatant przez aspirację i wyrzucić.
6. Umyj kulki trzy razy, jak opisano w kroku 2.3, używając 100 μl odpowiedniego buforu homogenizacyjnego.

4. Elucja

1. Do kulek dodać 50 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl) zawierającego przeciwny warunek (10 mM CaCl₂ lub 10 mM EDTA). Na przykład próbki, które zostały zhomogenizowane i związane w buforze zawierającym Ca²⁺, są eluowane w buforze elucyjnym zawierającym EDTA i odwrotnie.

Opcjonalnie: Podgrzanie bufora elucji do 37°C przed dodaniem do kulek może zwiększyć wydajność.

2. Inkubować roztwór z kulkami w temperaturze pokojowej przez 30 minut na shakerze. Wymieszaj kulki, delikatnie stukając w rurkę co około 5 minut.
3. Odwirować kulki w temperaturze 1 500 rcf przez 3 minuty i ostrożnie usunąć 50 μl supernatantu dla związanego białka (próbka 3) przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
4. Dodać białkowy bufor ładujący do wszystkich próbek (tj. białka homogenatycznego, niezwiązanego i związanego, jak również tych, które nadal są związane z kulkami).

Uwaga: Aby zmaksymalizować elucję (szczególnie w przypadku nieefektywnej elucji), dodaj 50μL odpowiedniego buforu elucyjnego (np. dodając bufor zawierający EDTA do kulek związanych w CaCl₂) do kulek przed podgrzaniem próbek, aby pomóc w elucji pozostałego związanego białka i powtórz kroki opisane w 4.3 w celu usunięcia pozostałych związanych białek.

5. SDS-PAGE i western blot

Przeprowadź SDS-PAGE i analizuj za pomocą western blot, sondując interesujące Cię białko i sondując białko, o którym wiadomo, że wiąże CaM w odwrotnym stanie niż kontrola pozytywna.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2B pokazuje przykład testu CaM-pull-down testującego wiązanie CaM Ng znakowanego GFP w porównaniu z endogennym Ng. Aby to zrobić, GFP-Ng uległ nadekspresji w naszych organotypowych wycinkach hipokampa w ciągu nocy, a tkanka została zhomogenizowana. Homogenat inkubowano z kulkami CaM-sefarozy w obecności Ca²⁺ lub EDTA. Wejście homogenatu pokazuje, że GFP-Ng ulegał ekspresji oprócz endogennego Ng i kinazy Ca^{2 +} / CaM zależnej II (CaMKII). Zgodnie z oczekiwaniami opartymi na znanym wiązaniu endogennego Ng (zilustrowanym na ryc. 2A), Ng znakowany GFP był eluowany pod nieobecność Ca²⁺ (białko związane z EDTA) i niezwiązany w obecności Ca²⁺ (ryc. 2B). W przeciwieństwie do tego, kontrola, CaMKII, była eluowana tylko w obecności Ca^{2 +} (związane białko) i nie była związana pod jego nieobecność (EDTA). Świadczy to o tym, że kulki CaM funkcjonowały prawidłowo, a elucja była skuteczna. Co najważniejsze, pokazuje to, że GFP-Ng wiąże się z ApoCaM w podobny sposób jak forma endogenna, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienił funkcji naszego rekombinowanego białka.

Rysunek 1. Zarys testu
CaM pull-down (A) Homogenat tkankowy jest wirowany w celu usunięcia resztek komórkowych. Około 10% supernatantu pobiera się jako próbkę wejściową (1). Pozostały supernatant dzieli się równo dla różnych warunków i dodaje się odpowiednie odczynniki (CaCl₂ lub EDTA) w celu przeprowadzenia testu wiązania w tych warunkach. Każdy supernatant (zawierający CaCl₂ lub EDTA) jest ładowany na odpowiednio przygotowane kulki CaM-sefarozy i inkubowany (B) w celu umożliwienia wiązania. Niezwiązane białka są usuwane (2) i (C), związane białka (3) są eluowane z kulek za pomocą buforu elucyjnego (E.B.) zawierającego stan odwrotny do wiązania. Skład białkowy tych trzech próbek białek można analizować za pomocą SDS-PAGE i analizy western blot.

Rysunek 2. A.) Schemat wiązania i elucji CaM zależnego od Ca²⁺ w teście pull-down Podano przykłady dwóch typów białek, które wiążą CaM w sposób zależny od Ca²⁺. Neurogranina (Ng) reprezentuje białka, które wiążą apo-CaM, a CaMKII reprezentuje białka, które wiążą się z CaM bogatym w Ca²⁺. CaM jest pokazany w stanie zdysocjowanym przed inkubacją z białkami homogenowymi. Po inkubacji w warunkach wysokich stężeń Ca²⁺ (2 mM) lub w obecności chelatora Ca²⁺, EDTA (2 mM), białka odpowiednio zwiążą się z CaM. Ng wiąże CaM w stanie EDTA, ponieważ Ca²⁺ jest obecny niewiele lub nie ma go wcale, i zostałby wymyty z kulek CaM-sefarozy w obecności Ca²⁺. Jednak CaMKII wiązałby się z CaM w obecności dużych ilości Ca²⁺ i dysocjowałby po chelatacji Ca²⁺.
B.) Wyniki z przykładowego testu ściągania CaM. Rysunek ten pokazuje oczekiwany wynik końcowy ściągania CaM-sefarozy w dół z próbkami badanymi pod kątem Ng i CaMKII. Zarówno endogenny Ng, jak i GFP-Ng są obecne na torach białek związanych z CaM w obecności EDTA. Żaden Ng nie jest związany, gdy próbki są inkubowane z CaM w obecności Ca²⁺, co pokazuje, że Ng wiąże tylko apo-CaM. Z drugiej strony nasza kontrola pozytywna, CaMKII, wiąże się z CaM tylko w obecności Ca²⁺.

Discussion

Dostarczony protokół wykorzystuje kulki CaM-sefarozy do zbadania zależności Ca²⁺ białek wiążących CaM. Wiele białek wiąże CaM w sposób zależny od^Ca2+. Interakcje te mają ogromne znaczenie ze względu na liczbę białek wiążących CaM i ich krytyczną rolę w wielu szlakach sygnałowych. W tym protokole kulki CaM-sefarozy są używane do oddzielania białek wiążących CaM od homogenatu tkankowego w obecności lub bez Ca²⁺. Wyniki tego prostego podejścia pozwolą lepiej zrozumieć, w jaki sposób biał...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koraliki kalmodulinowo-sefarozowe	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anty-neurogranina	EMD Millipore	07-425
Końcówki do pipet do ładowania żelem	Fisher Scientific	02-707-138	Służy do aspiracji supernatantów
Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)	Fisher Scientific	05-408-146	Stosować do wszystkich etapów związanych z kulkami kalmoduliny i sefarozy