Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Streszczenie

Kardiomiocyty charakteryzują się wieloma przepływami Ca²⁺ o różnym czasie trwania, które wspólnie optymalizują funkcję komórek ^1,2. Zmiany aktywności Ca²⁺ w odpowiedzi na czynniki zewnątrzkomórkowe są regulowane głównie przez szlak fosfolipazy Cβ- Gα_q zlokalizowany w błonie komórkowej, który jest stymulowany przez takie czynniki jak acetylocholina ^3,4. Niedawno odkryliśmy, że domeny białkowe błony komórkowej nazywane kaweolami^5,6 mogą zatrzymywać aktywowane Gα_q ⁷. Zatrzymanie to prowadzi do stabilizacji stanu aktywnego Gα_q, co skutkuje przedłużonymi sygnałami Ca²⁺ w kardiomiocytach i innych typach komórek⁸. Ten zaskakujący wynik odkryliśmy, mierząc dynamiczne odpowiedzi wapniowe w krótkiej skali czasowej w żywych kardiomiocytach. W skrócie, komórki są obciążane fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca²⁺. W naszych badaniach zastosowaliśmy Ca²⁺ Green (Invitrogen, Inc.), który wykazuje wzrost intensywności emisji fluorescencji po związaniu jonów wapnia. Intensywność fluorescencji jest następnie rejestrowana przy użyciu trybu skanowania liniowego (line-scan) w konfokalnym mikroskopie laserowym. Metoda ta pozwala na szybką akwizycję przebiegu czasowego intensywności fluorescencji w pikselach wzdłuż wybranej linii, generując kilkaset przebiegów czasowych w skali mikrosekundowej. Te bardzo szybkie przebiegi są przenoszone do programu Excel, a następnie do programu Sigmaplot w celu analizy i są porównywane z przebiegami uzyskanymi dla szumu elektronicznego, wolnego barwnika oraz innych kontroli. Aby przeanalizować odpowiedzi Ca²⁺ o różnych szybkościach przepływu, przeprowadziliśmy analizę histogramową, w której intensywności pikseli pogrupowano w przedziały czasowe (binning). Binning pozwala nam zgrupować ponad 500 przebiegów skanów i zwizualizować skumulowane wyniki przestrzennie i czasowo na jednym wykresie. Dzięki temu wolne fale Ca²⁺, które są trudne do rozróżnienia podczas nakładania skanów ze względu na różnice w rozmieszczeniu pików i szum, mogą być łatwo dostrzeżone w histogramach pogrupowanych. Bardzo szybkie przepływy w skali czasowej pomiaru wykazują wąski rozkład intensywności w bardzo krótkich przedziałach czasowych, podczas gdy dłuższe fale Ca²⁺ wykazują dane pogrupowane o szerokim rozkładzie w dłuższych przedziałach czasowych. Te zróżnicowane rozkłady czasowe pozwalają nam analizować czas występowania przepływów Ca²⁺ w komórkach oraz określać ich wpływ na różne zdarzenia komórkowe.

Protokół

1. Obciążanie komórek wskaźnikami wapnia

1. Wysiać komórki do szalek MatTek z szklanym dnem o średnicy 35 mm (lub innych komór obserwacyjnych z szklanym dnem).
2. W przypadku użycia pierwotnych miocytów, pokryć komory lamininą (10 μg/ml) na jeden dzień przed wysiewem. Wysiać miocyty sercowe (izolowane od dorosłych psów, noworodków szczurów lub innych organizmów) w buforze KB (bufor Tyrode'a z odwróceniem potasu: 35 mmol/L HEPES, 140 mmol/L KCl, 8 mmol/L KHCO₃, 2 mmol/L MgCl₂ oraz 0,4 mmol/L KH₂PO₄, pH 7,5), a następnie stopniowo zamienić go na pożywkę M199 uzupełnioną o 15% płodowej surowicy bydlęcej, 1% stre....

Dyskusja

Opracowaliśmy metodę obrazowania i izolowania szybkich sygnałów wapniowych w żywych kardiomiocytach. Chociaż warunki eksperymentalne tych pomiarów były wcześniej stosowane w innych układach komórkowych¹⁰, jak i w kardiomiocytach¹¹, zastosowanie histogramów i analizy przedziałowej (bin analysis) pozwala na pozyskanie danych z wielu zdarzeń Ca²⁺. Szybsze zdarzenia można łatwo odizolować od wolniejszych, a następnie dostosować modele w celu zrozumienia ich mechanizmów. Hodowla kardiomiocytów.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	ABCD1234