Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Streszczenie

Kardiomiocyty charakteryzują się wieloma przepływami Ca²⁺ o różnym czasie trwania, które wspólnie optymalizują funkcję komórek ^1,2. Zmiany aktywności Ca²⁺ w odpowiedzi na czynniki zewnątrzkomórkowe są regulowane głównie przez szlak fosfolipazy Cβ- Gα_q zlokalizowany w błonie komórkowej, który jest stymulowany przez takie czynniki jak acetylocholina ^3,4. Niedawno odkryliśmy, że domeny białkowe błony komórkowej nazywane kaweolami^5,6 mogą zatrzymywać aktywowane Gα_q ⁷. Zatrzymanie to prowadzi do stabilizacji stanu aktywnego Gα_q, co skutkuje przedłużonymi sygnałami Ca²⁺ w kardiomiocytach i innych typach komórek⁸. Ten zaskakujący wynik odkryliśmy, mierząc dynamiczne odpowiedzi wapniowe w krótkiej skali czasowej w żywych kardiomiocytach. W skrócie, komórki są obciążane fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca²⁺. W naszych badaniach zastosowaliśmy Ca²⁺ Green (Invitrogen, Inc.), który wykazuje wzrost intensywności emisji fluorescencji po związaniu jonów wapnia. Intensywność fluorescencji jest następnie rejestrowana przy użyciu trybu skanowania liniowego (line-scan) w konfokalnym mikroskopie laserowym. Metoda ta pozwala na szybką akwizycję przebiegu czasowego intensywności fluorescencji w pikselach wzdłuż wybranej linii, generując kilkaset przebiegów czasowych w skali mikrosekundowej. Te bardzo szybkie przebiegi są przenoszone do programu Excel, a następnie do programu Sigmaplot w celu analizy i są porównywane z przebiegami uzyskanymi dla szumu elektronicznego, wolnego barwnika oraz innych kontroli. Aby przeanalizować odpowiedzi Ca²⁺ o różnych szybkościach przepływu, przeprowadziliśmy analizę histogramową, w której intensywności pikseli pogrupowano w przedziały czasowe (binning). Binning pozwala nam zgrupować ponad 500 przebiegów skanów i zwizualizować skumulowane wyniki przestrzennie i czasowo na jednym wykresie. Dzięki temu wolne fale Ca²⁺, które są trudne do rozróżnienia podczas nakładania skanów ze względu na różnice w rozmieszczeniu pików i szum, mogą być łatwo dostrzeżone w histogramach pogrupowanych. Bardzo szybkie przepływy w skali czasowej pomiaru wykazują wąski rozkład intensywności w bardzo krótkich przedziałach czasowych, podczas gdy dłuższe fale Ca²⁺ wykazują dane pogrupowane o szerokim rozkładzie w dłuższych przedziałach czasowych. Te zróżnicowane rozkłady czasowe pozwalają nam analizować czas występowania przepływów Ca²⁺ w komórkach oraz określać ich wpływ na różne zdarzenia komórkowe.

Protokół

1. Obciążanie komórek wskaźnikami wapnia

1. Wysiać komórki do szalek MatTek z szklanym dnem o średnicy 35 mm (lub innych komór obserwacyjnych z szklanym dnem).
2. W przypadku użycia pierwotnych miocytów, pokryć komory lamininą (10 μg/ml) na jeden dzień przed wysiewem. Wysiać miocyty sercowe (izolowane od dorosłych psów, noworodków szczurów lub innych organizmów) w buforze KB (bufor Tyrode'a z odwróceniem potasu: 35 mmol/L HEPES, 140 mmol/L KCl, 8 mmol/L KHCO₃, 2 mmol/L MgCl₂ oraz 0,4 mmol/L KH₂PO₄, pH 7,5), a następnie stopniowo zamienić go na pożywkę M199 uzupełnioną o 15% płodowej surowicy bydlęcej, 1% streptomycyny i 0,5% gentamycyny; inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
3. Inkubować komórki z calcium green AM (1-5 μM; Molecular Probes) lub dowolnym innym wybranym wskaźnikiem wapnia przez 30-45 min w temperaturze pokojowej. Przykryć szalkę folią aluminiową, aby zapobiec fotowyblakaniu barwnika.
4. Przemyć komórki trzykrotnie pożywką Leibovitz15 z dodatkiem 14 mM EGTA (jeśli eksperymenty są prowadzone w warunkach niskiego stężenia wapnia) lub dowolną odpowiednią pożywką do obrazowania.
5. Inkubować przez kolejne 30-45 minut w pożywce Leibovitz15 zawierającej 14 mM EGTA.
6. W przypadku badania efektów inhibitorów (np. inhibitora PLC U73122 w stężeniu 10 μM), dodać je podczas drugiej inkubacji.

2. Mikroiniekcja komórek

1. Kultywuj kardiomiocyty w szalkach MatTek z szklanym dnem (lub innych komorach do obserwacji) przez 24 h.
2. Wymień medium na bezfenolowe Leibovitz-15 z 14 mM EGTA (kardiomiocyty muszą być wstrzykiwane w medium wolnym od wapnia, pozostałe komórki mogą być wstrzykiwane w medium zawierającym wapń).
3. Przygotuj roztwór do mikroiniekcji – w naszych badaniach zastosowano peptyd, który eliminuje oddziaływania Gα_q – caveolae. Należy pamiętać, że do komórki wstrzykiwana jest jedynie niewielka objętość (˜fL), dlatego należy stosować odpowiednio skoncentrowane roztwory stokowe. Użyliśmy 2 μM tego peptydu, Cav3-scaffold, z DAPI w medium wolnym od wapnia. DAPI to niebieski barwnik, który barwi jądro komórkowe i pozwala na identyfikację komórek poddanych mikroiniekcji. DAPI nie zakłóca fluorescencji wielu wskaźników wapnia. Ilość DAPI jest zmienna; zazwyczaj stosujemy ilość wystarczającą do wizualizacji jądra (0,5 i 2 μM).
4. Przygotuj roztwór kontrolny zawierający DAPI – sam barwnik śledzący.
5. Do mikroiniekcji użyj igieł samodzielnie dociąganych lub dostępnych komercyjnie. Przećwicz wstrzykiwanie barwnika, aby określić właściwe parametry igły. Zauważamy, że różne komórki mogą wymagać różnych średnic igieł i różnych ciśnień mikroiniekcji.
6. Użyj zautomatyzowanego systemu do mikroiniekcji, na przykład InjectMan NI2 z pompą FemtoJet firmy Eppendorf. Ustaw ciśnienie iniekcji P_i na 90 hPa oraz ciśnienie kompensacyjne P_c na 45 hPa. Ustaw czas iniekcji t na 0,7 s. W razie potrzeby ponownie dostosuj parametry iniekcji.
7. Wykonaj mikroiniekcje na mikroskopie odwróconym (np. Zeiss Axiovert 200M) wyposażonym w obiektyw do kontrastu fazowego o dużej odległości roboczej (na przykład obiektyw powietrzny 40x fazy 2).
8. Wstrzyknij roztwór do jak największej liczby komórek w szybkim tempie. Obejrzyj wstrzyknięte komórki w kontraście fazowym, aby wybrać komórki żywotne.

3. Badania ko-immunofluorescencyjne

1. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i utrwalić 3,7% paraformaldehydem przez 30 minut. W razie potrzeby komórki można stymulować przed utrwaleniem.
2. Przemyć utrwalone komórki trzykrotnie PBS, a następnie inkubować z 0,2% NP40 w PBS przez 5 minut.
3. Zablokować miejsca nieswoistego wiązania, używając PBS zawierającego 4% surowicy koziej (lub innej odpowiedniej surowicy) przez 1 godzinę.
4. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu z 1% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę.
5. Przemyć komórki trzykrotnie przez 10 minut roztworem 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6, a następnie dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne, takie jak przeciwciało wtórne Alexa-Fluor-488 anty-królicze lub Alexa-Fluor-647 anty-mysie rozcieńczone 1:1000 w 1% surowicy koziej w PBS (należy pamiętać, że przy wykrywaniu dwóch różnych białek przeciwciała pierwszorzędowe muszą być wytworzone w różnych gatunkach, a przeciwciała wtórne muszą być skierowane przeciwko odpowiednim gatunkom).
6. Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie przemyć trzykrotnie TBS.
7. Obserwować komórki w buforze TBS lub innym odpowiednim medium do obserwacji.

4. Szybkie obrazowanie wapnia

1. Należy użyć konfokalnego mikroskopu skaningowego (np. Fluoview 1000 Olympus).
2. Należy zastosować obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej.
3. Należy ustawić parametry akwizycji. W przypadku użycia calcium green należy zastosować wzbudzenie 488 nm oraz filtry emisyjne long pass 515.
4. Należy dostosować czas piksela – dla szybkich pomiarów stężenia wapnia ustawić go na 2 μs/pixel.
5. Należy ustawić powiększenie obrazu tak, aby uzyskać rozmiar piksela od 0,05 do 0,3 μm.
6. Należy wybrać linię z wybranej komórki w konkretnym obszarze.
7. W oknie sterowania czasem należy wybrać akwizycję czasową dla co najmniej 1500 skanów (aby uzyskać pożądany zakres czasowy odpowiedzi – 1,3 ms/line pozwoliłoby uzyskać 2 sekundy).
8. Należy zarejestrować odczyt tła przed stymulacją.
9. Komórki należy stymulować 5 μM karbacholu i natychmiast rozpocząć rejestrację danych. Komórki powinny znajdować się w 1 mL pożywki Leibovitz15; należy przygotować 10 μM karbacholu w pożywce Leibovitz15 i delikatnie dodać 1 mL do naczynia.

5. Analiza danych

1. Wyodrębnij intensywności dla każdego piksela z zarejestrowanego obrazu. Zapisz dane o intensywności w formie tabeli przy użyciu oprogramowania Fluoview 1000.
2. Zaimportuj dane o intensywności do programu Sigmaplot lub podobnego programu do analizy danych i pogrupuj dane w ˜9-40 przedziałów (biny). Porównaj wyniki z eksperymentami kontrolnymi oraz szumem elektronicznym.

6. Reprezentatywne wyniki:

Obrazowanie komórek przeprowadzono przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM510 (Zeiss, Jena, Niemcy) wyposażonego w wieloliniowe wzbudzenie laserowe oraz obiektyw apochromatyczny z imersją wodną 40x/1.2 NA. Na Rys. 1 (czerwony) przedstawiono rozkład kaweol w utrwalonych i barwionych przeciwciałem przeciwko kaweolinie-3 kardiomiocytach komór komory serca dorosłego psa; kaweolina-3 jest głównym białkiem strukturalnym kaweol w tych komórkach ⁹. Kaweolinę-3 oznakowano immunochemicznie fluorophorem Alexa-647 i wzbudzano linią 633-nm lasera He:Ne. Obrazy rejestrowano przy użyciu filtra emisyjnego LP650 nm. Rozkład kaweoliny-3 porównano z Gα_q, która została oznakowana immunochemicznie Alexa-488 (zielony). Alexa-488 wzbudzano linią 488nm lasera argonowo-jonowego, a obraz rejestrowano przy użyciu filtra emisyjnego BP505-530nm. W tych pomiarach kolokalizacji oba fluorofory wzbudzano sekwencyjnie, korzystając z akwizycji Multi Track. Procedura ta minimalizuje przesłuchy między kanałami (cross-talk). Analizę danych pod kątem kolokalizacji przeprowadzono przy użyciu oprogramowania AIM dostarczanego z Zeiss LSM510-Meta. Jak widać, oba białka są kolokalizowane.

Aby określić, w jaki sposób sprzężenie kaweoliny-3 z Gα_q wpływa na sygnały wapniowe, przeprowadziliśmy badania obrazowania wapnia przy użyciu systemu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (Fluoview, Olympus, Tokyo, Japonia) sprzężonego z mikroskopem odwróconym (IX70, Olympus) z obiektywem 40x (UPlanApo, Olympus, apertura numeryczna 1,3), choć pomiary te można było przeprowadzić również na systemach Zeis opisanych powyżej. Do tych pomiarów komórki obciążono barwnikiem Ca²⁺ Green. Barwnik wzbudzano laserem argonowym 488nm, a obrazy gromadzono za pomocą filtra emisyjnego LP515. Klatki obrazów zbierano w odstępach 500 ms. Wartości intensywności dla każdego piksela wyekstrahowano przy użyciu oprogramowania Olympus oraz programu ImageJ. Tryb skanowania liniowego (line scan) wykorzystano do analizy ilościowej szybszych przejściów Ca²⁺ oraz iskier wapniowych (Ca²⁺ sparks). Rozmiar piksela zastosowany w niniejszym badaniu wynosił 0,1-0,3 μm. Szybkość skanowania liniowego wynosiła około kilkuset μs na linię. Na Rys. 2 przedstawiamy skan liniowy kardiomiocytu obciążonego Ca²⁺ Green, w którym czas przebywania piksela wynosił 2 μs, a czas linii 142 μs. Obraz składa się z 1200 linii.

Każda linia skanu odpowiada fluktuacji intensywności Ca²⁺ Green, składającej się z 71 punktów pobranych w zakresie 142 μs, i może służyć jako szybki odczyt odpowiedzi wapniowych. Na przykład na rys. 3 przedstawiamy aktywność Ca²⁺ pojedynczej linii pojedynczego kardiomiocyta, mierzoną jako intensywność fluorescencji Ca²⁺ Green w funkcji czasu w sekundach przed (góra) i po (dół) dodaniu 5 μM karbacholu, który zwiększa poziom wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ poprzez aktywność Gα_q-PLCβ. Po uśrednieniu wielu linii stymulacja karbacholem powoduje ˜1,8-krotny wzrost intensywności Ca²⁺ Green. Ze względu na zmienność warunków eksperymentalnych (temperatura pokojowa, moc lasera, odpowiedź detektora, rozkład barwnika itp.), wzrost ten może nie być widoczny w pojedynczych skanach liniowych. Mimo że wartości intensywności (wartości na osi y) są podobne, wyraźnie widać, że wykres stymulowany karbacholem na dole ma znacznie szersze piki, odpowiadające bardziej trwałym poziomom wapnia, niż wąskie piki fluktuacji widoczne przed stymulacją. To poszerzenie i względny wzrost intensywności maskują małe, wolniejsze oscylacje. Naszym celem jest lepsze rozróżnienie między tymi różnymi pozornymi typami fluktuacji wapnia.

Kolejny przykład tych szybkich fluktuacji wapnia przedstawiono na Ryc. 4. Górny wykres pokazuje surowe dane liniowe dla stymulowanych kardiomiocytów komorowych (kolor czerwony), a czarną linią zaznaczono średnią z 3 śladów liniowych. Aby określić w jakim stopniu fluktuacje wapnia były pośredniczone przez oddziaływania Gα_q - kaveolina3, przeprowadzono mikroiniekcję peptydu destabilizującego oddziaływania kaveolina-3 - Gα_q (tj. peptydu Cav3), co eliminuje dłuższy prąd Ca²⁺; dane te przedstawiono kolorem niebieskim (zauważamy, że od intensywności sygnału peptydu Cav3 odjęto wartość 500, aby oba ślady były lepiej rozróżnialne).

Kolumny surowych danych z naszych plików Excel zaimportowaliśmy do programu Sigmaplot (Jandel, Inc.) i przeprowadziliśmy analizę histogramową. W tej analizie liczba zdarzeń jest grupowana w równą liczbę przedziałów (koszy), aby utworzyć histogram. Szerokość przedziału reprezentuje równy odstęp czasu. Intensywności są wprowadzane do poszczególnych przedziałów czasowych w taki sposób, aby wysokość danego przedziału odpowiadała liczbie wystąpień danej intensywności w określonym oknie czasowym. Ponieważ ten rodzaj analizy zależy wyłącznie od zbierania danych z taką samzą częstotliwością skanowania, wiele przebiegów można analizować jednocześnie. Dodatkowo analiza ta nie jest wrażliwa na różnice w poziomach barwnika, mocy lasera itp., a szum elektroniczny i tło występują w bardzo krótkich skalach czasowych i są widoczne jedynie w pierwszych 1-2 przedziałach.

Odpowiadające surowym danym histogramy z Rys. 4 przedstawiono na dole strony. Histogram dla komórek kontrolnych jest rozłożony na dużą liczbę przedziałów odpowiadających szerokiemu rozkładowi czasowemu, co obrazuje czerwona linia (linia ta służy jedynie jako pomoc wizualna i nie zakłada żadnego modelu). W przeciwieństwie do tego, przedziały dla odpowiedzi komórek, w których interakcja Gα_q-Cav3 została przerwana przez peptyd, ograniczają się do wąskiego rozkładu przedziałów, co sugeruje, że obecność peptydu eliminuje przepływy o dłuższym czasie trwania. Mikroiniekcja peptydu kontrolnego, który nie przerywa interakcji Gα_q-Cav3, daje histogram podobny do komórek niepoddanych iniekcji⁸.

Na rys. 5 porównujemy szybkie fluktuacje intensywności Ca²⁺Green w dorosłych kardiomiocytach komorowych psa (lewo) oraz w świeżych, niestymulowanych kardiomiocytach neonatalnych szczura, które nie posiadają kaweol (prawo). W tym przypadku odpowiadające im histogramy intensywności z okresu 3 minut zostały pogrupowane w przedziały o szerokości 35, aby uwidocznić wolniejsze zdarzenia wapniowe. Należy zauważyć, że kardiomiocyty neonatalne wykazują szybkie fluktuacje na płaskiej linii bazowej, co wskazuje na brak wolniejszej aktywności Ca²⁺, podczas gdy w przypadku komórek dorosłych widoczna jest bardziej ustrukturyzowana linia bazowa. Różnice te są najlepiej widoczne na histogramach.

Rysunek 1. Obrazy dorosłych kardiomiocytów komorowych psa pokazujące rozkład Gα_q znakowanego immunofluorescencyjnie Alexa-488, gdzie Alexa-488 był wzbudzany linią lasera argonowego 488nm, a obraz zapisano przy użyciu filtra emisyjnego BP505-530nm. W prawym górnym rogu znajduje się ten sam obraz przedstawiający lokalizację kaweoliny-3 znakowanej immunofluorescencyjnie Alexa-647, wzbudzanej linią 633-nm lasera He:Ne i zapisanej przy użyciu filtra emisyjnego LP650 nm. Na dole po lewej znajduje się obraz scalony, na którym kolokalizacja jest widoczna w kolorze pomarańczowym, z powiększonym fragmentem obrazu po prawej stronie.

Rycina 2. Obrazowanie wapnia w żywym, dorosłym kardiomiocycie komorowym psa obciążonym barwnikiem Ca²⁺ Green. Obraz wykonano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego z obiektywem 40x, wykorzystując laser argonowy 488nm oraz filtr emisji LP515. Obraz składa się z 1200 linii, czas ekspozycji piksela wynosił 2 μs, a rozmiar piksela 0.1 μm.

Rycina 3. GÓRA: Fluktuacje intensywności śladu liniowego z żywego, dorosłego kardiomiocyta komorowego psa obciążonego Ca²⁺ Green i obrazowanego zgodnie z opisem, oraz DÓŁ: ta sama komórka stymulowana poprzez dodanie 5 μM karbacholu.

Rycina 4. GÓRA Przykład zapisów liniowych z żywego, dorosłego kardiomiocytu komorowego psa załadowanego barwnikiem Ca²⁺ Green (czerwony), wykonanych w czasie 180 ms, gdzie średnia z 3 zapisów przedstawiona jest czarną linią, w porównaniu do komórki po mikroiniekcji peptydu zaburzającego oddziaływanie Gα_q-kaweolina 3 (czerwony), gdzie średnia z trzech zapisów przedstawiona jest w kolorze czarnym. Zauważamy, że dla ułatwienia wizualizacji od dolnego zestawu danych odjęto 400 jednostek intensywności. Dolne panele to odpowiadające im histogramy danych pogrupowanych w koszyki (biny), zgodnie z opisem w tekście, gdzie numer koszyka jest dowolny, a liczba zliczeń w koszyku (lub po prostu liczba zliczeń) odpowiada całkowitej intensywności w tym konkretnym koszyku. Zaznaczamy, że czerwone i niebieskie linie naniesione na histogramach kontrolnych (lewo) i peptydowych (prawo) służą ułatwieniu identyfikacji i porównania danych; nie przyjęto przy tym żadnego modelu.

Rycina 5. Poniżej przedstawiono fluktuacje intensywności Ca²⁺Green w dorosłych kardiomiocytach komorowych psa (lewo) oraz świeżych, niestymulowanych kardiomiocytach noworodka szczura pozbawionych kaweoli (prawo) wraz z odpowiadającymi im histogramami.

Dyskusja

Opracowaliśmy metodę obrazowania i izolowania szybkich sygnałów wapniowych w żywych kardiomiocytach. Chociaż warunki eksperymentalne tych pomiarów były wcześniej stosowane w innych układach komórkowych¹⁰, jak i w kardiomiocytach¹¹, zastosowanie histogramów i analizy przedziałowej (bin analysis) pozwala na pozyskanie danych z wielu zdarzeń Ca²⁺. Szybsze zdarzenia można łatwo odizolować od wolniejszych, a następnie dostosować modele w celu zrozumienia ich mechanizmów. Hodowla kardiomiocytów...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	ABCD1234