Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodek danio pręgowanego stał się popularnym modelem kręgowca in vivo do badania rozwoju serca oraz ludzkich chorób serca ze względu na korzystną embriologię i genetykę 1,2. Każdego tygodnia od jednej pary dorosłych ryb można łatwo uzyskać około 100-200 zarodków. Przezroczyste zarodki rozwijające się ex utero sprawiają, że są one idealne do oceny wad serca 3. Ekspresję dowolnego genu można manipulować za pomocą technologii morfolino lub wstrzykiwania RNA 4. Ponadto, badania genetyki forward doprowadziły już do stworzenia listy mutantów, które wpływają na różne aspekty kardiogenezy 5.
Immunobarwienie całego preparatu (whole mount immunostaining) jest ważną techniką w tym modelu zwierzęcym, pozwalającą na ujawnienie wzorca ekspresji docelowego białka w konkretnej tkance 6. Jednakże uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które mogłyby ukazać struktury komórkowe lub podkomórkowe, było trudne, głównie ze względu na fizyczne położenie serca oraz słabą penetrację przeciwciał.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rozwiązania tych ograniczeń poprzez wstępne rozcięcie serca, a następnie przeprowadzenie procesu barwienia na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Aby zapobiec utracie małych próbek serca i ułatwić manipulację roztworami, próbki serca ograniczono do obszaru koła narysowanego na powierzchni szkiełek przedmiotowych za pomocą pisaka immEdge. Po barwieniu sygnały fluorescencyjne można bezpośrednio obserwować za pomocą mikroskopu złożonego.
Nasza nowa metoda znacznie poprawia penetrację przeciwciał, ponieważ serce zarodka ryby składa się tylko z kilku warstw komórek. Wysokiej jakości obrazy z nienaruszonych serc można uzyskać w znacznie krótszym czasie przetwarzania dla embrionów zebrafish w wieku od 2. do 6. dnia. Naszą metodę można potencjalnie rozszerzyć na barwienie innych narządów wyizolowanych z zebrafish lub innych małych zwierząt.
Protokół
1. Przygotowanie szkiełek i komory nawilżanej
- Komorę nawilżania można wykonać z pudełka, np. z pustego pudełka na końcówki. Zarówno komorę, jak i pokrywę należy owinąć folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.
- Do wnętrza komory włóż stos mokrych ręczników papierowych w celu utrzymania wilgotności, co zapobiegnie wysychaniu próbek serca. Na wierzchu ręcznika papierowego ustaw małą płytkę mikrotitracyjną, która posłuży jako podstawka dla szkiełek.
- Za pomocą pisaka immEdge narysuj na powierzchni szkiełka mikroskopowego linie lub okręgi, tworząc wgłębienia dla próbek serca o wymiarach około 5x5 mm. Pozostaw szkiełka do wyschnięci....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W porównaniu do klasycznych metod immunobarwienia całych preparatów (whole mount), nasza metoda oferuje następujące zalety. Po pierwsze, dzięki poprawie penetracji można konsekwentnie uzyskiwać znacznie silniejsze sygnały fluorescencyjne. W metodzie immunobarwienia całych preparatów gęsta tkanka skóry otaczająca serce znacznie ograniczała penetrację wielu przeciwciał, co prowadziło do wysokiego poziomu tła w całym organizmie. Problem ten jest szczególnie dotkliwy w przypadku embrionów starszych niż 3 dni od zapłodnienia .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Beninio Jomok za pomoc w hodowli danio prążkowanych. Praca ta była finansowana przez NIH HL81753.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| trikaina | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyd | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Strzykawka insulinowa | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Przeciwciało przeciwko β-kateninie | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Przeciwciało przeciwko Mef2c | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Przeciwciało przeciwko α-aktininie | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Przeciwciało przeciwko Ilk | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 kozie przeciwciało przeciwko królikiemu IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiemu IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Medium montażowe do fluorescencji | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Pisak ImmEdge | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Laminaty pokryte poli-L-lizyną | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Wklęsłe szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Mikroskop sekcyjny | Leica Microsystems | ||
| Mikroskop złożony | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 | |||
| 25X Trikaina: 400 mg trikainy 97,9 mL ddH2O 2,1 mL (1M Tris pH9) Dostosować pH do 7,0 |
Bibliografia
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
