Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodek danio pręgowanego stał się popularnym modelem kręgowca in vivo do badania rozwoju serca oraz ludzkich chorób serca ze względu na korzystną embriologię i genetykę 1,2. Każdego tygodnia od jednej pary dorosłych ryb można łatwo uzyskać około 100-200 zarodków. Przezroczyste zarodki rozwijające się ex utero sprawiają, że są one idealne do oceny wad serca 3. Ekspresję dowolnego genu można manipulować za pomocą technologii morfolino lub wstrzykiwania RNA 4. Ponadto, badania genetyki forward doprowadziły już do stworzenia listy mutantów, które wpływają na różne aspekty kardiogenezy 5.
Immunobarwienie całego preparatu (whole mount immunostaining) jest ważną techniką w tym modelu zwierzęcym, pozwalającą na ujawnienie wzorca ekspresji docelowego białka w konkretnej tkance 6. Jednakże uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które mogłyby ukazać struktury komórkowe lub podkomórkowe, było trudne, głównie ze względu na fizyczne położenie serca oraz słabą penetrację przeciwciał.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rozwiązania tych ograniczeń poprzez wstępne rozcięcie serca, a następnie przeprowadzenie procesu barwienia na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Aby zapobiec utracie małych próbek serca i ułatwić manipulację roztworami, próbki serca ograniczono do obszaru koła narysowanego na powierzchni szkiełek przedmiotowych za pomocą pisaka immEdge. Po barwieniu sygnały fluorescencyjne można bezpośrednio obserwować za pomocą mikroskopu złożonego.
Nasza nowa metoda znacznie poprawia penetrację przeciwciał, ponieważ serce zarodka ryby składa się tylko z kilku warstw komórek. Wysokiej jakości obrazy z nienaruszonych serc można uzyskać w znacznie krótszym czasie przetwarzania dla embrionów zebrafish w wieku od 2. do 6. dnia. Naszą metodę można potencjalnie rozszerzyć na barwienie innych narządów wyizolowanych z zebrafish lub innych małych zwierząt.
Protokół
1. Przygotowanie szkiełek i komory nawilżanej
- Komorę nawilżania można wykonać z pudełka, np. z pustego pudełka na końcówki. Zarówno komorę, jak i pokrywę należy owinąć folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.
- Do wnętrza komory włóż stos mokrych ręczników papierowych w celu utrzymania wilgotności, co zapobiegnie wysychaniu próbek serca. Na wierzchu ręcznika papierowego ustaw małą płytkę mikrotitracyjną, która posłuży jako podstawka dla szkiełek.
- Za pomocą pisaka immEdge narysuj na powierzchni szkiełka mikroskopowego linie lub okręgi, tworząc wgłębienia dla próbek serca o wymiarach około 5x5 mm. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia.
- Umieść szkiełka w komorze nawilżania i dodaj 50ul świeżego 4% formaldehydu do każdego wgłębienia.
2. Disekcja embrionalnego serca
- Zanurzyć zarodek ryby w wodzie do jaj E3 7 zawierającej 0,4% trikainy na około 1 minutę, aż ryba przestanie wykonywać ruchy ciała, lecz zachowa prawidłowe tętno serca.
- Umieścić wklęsłe szkło przedmiotowe na stole mikroskopu stereoskopowego. Przenieść zarodki do wklęsłego wgłębienia.
- Dostosować oświetlenie mikroskopu stereoskopowego tak, aby serce było wyraźnie widoczne. W zależności od preferencji może to być oświetlenie w ciemnym polu lub polaryzowane światło typu DIC.
- Oczyścić dwie strzykawki insulinowe 75% etanolem, a następnie osuszyć.
- Ustawić mikroskop stereoskopowy na większym powiększeniu i skupić ostrość na sercu. Unieruchomić mechanicznie zarodek, wbijając końcówkę jednej igły w granicę między żółtkiem a somytami w pobliżu głowy. Wbić drugą igłę w pobliżu obszaru serca i szybko je wyciągnąć. Jeśli serce nie zostało całkowicie oddzielone od zarodka, odciąć pozostałą tkankę łączącą serce z żółtkiem.
- Ustawić mikroskop na mniejszym powiększeniu i skupić ostrość na wyizolowanym sercu. Użyć pipety automatycznej 10 µl ustawionej na objętość 1 µl. Przyłożyć końcówkę pipety, aby wessać lub dotknąć próbki serca, tak aby wyizolowane serce znalazło się wewnątrz końcówki lub przywarło do jej powierzchni.
- Zanurzyć końcówkę pipety w 4% roztworze formaldehydu na przygotowanych szkiełkach i nacisnąć tłok pipety, aby uwolnić serce do roztworu. Napięcie powierzchniowe wody również wspomaga uwalnianie serca z końcówki pipety do roztworu. Umieścić mniej niż 3 serca w każdym wgłębieniu.
3. Immunobarwienie
- Zamknąć komorę i umieścić ją na wytrząsarce z łagodnym ruchem kołyszącym. Utrwalić próbkę serca przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Osuszyć wodę z tyłu szkiełek i umieścić je na stole mikroskopu sekcyjnego w celu wymiany buforu.
- Zanurzyć końcówkę pipety 10μl w pustym obszarze każdej studzienki, utrzymując ją jak najdalej od próbek serca. Należy zachować ostrożność, aby serce nie przywarło do końcówki, ponieważ organy mogą przemieszczać się wraz z przepływem wody podczas pobierania roztworu. W razie potrzeby zmienić położenie końcówki.
- Usunąć roztwór na chusteczkę, unikając powstawania pęcherzyków powietrza w końcówce, ponieważ w ich obecności próbka serca może zostać łatwo utracona. Krótkotrwałe utrzymywanie próbek serca w stanie częściowego wysuszenia może pomóc w ich przyleganiu do szkiełek.
- Dodać 50μl PBST, aby pokryć próbkę serca, i inkubować w nawilżonej komorze przy powolnym ruchu kołyszącym przez 5 min. Powtórzyć płukanie jeszcze raz. Po tym etapie próbki serca można przechowywać w nawilżonej komorze do 1 tygodnia w temperaturze 4°C.
- Zablokować próbkę serca za pomocą 10% surowicy owczej w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować próbkę serca z przeciwciałami pierwszorzędowymi, np. w rozcieńczeniu 1:200 dla przeciwciał przeciwko β-catenin oraz 1:200 dla przeciwciał specyficznych przeciwko mef2, w 10% surowicy owczej/PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Przemyć próbkę serca buforem PBST trzy razy (po 5 min. każde) w temperaturze pokojowej.
- Inkubować próbkę z przeciwciałami wtórnymi, np. w rozcieńczeniu 1:1000 dla przeciwciał antymysich i/lub antykróliczych znakowanych Alexa, w PBST przez 0,5 godziny.
- Przemyć próbki serca buforem PBST trzy razy (po 5 min. każde) w temperaturze pokojowej.
4. Obrazowanie
- Usunąć PBST i dodać 10 μl medium montażowego do każdej studni. Kołysać komorą przez kilka minut, aż roztwór stanie się klarowny.
- Usunąć większość medium montażowego i przykryć wszystkie studnie na jednym szkiełku przedmiotowym szkiełkiem nakrywkowym (24x50).
- Wykonać obrazowanie serca ryby przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioplan 2 wyposażonego w system ApoTome (Carl Zeiss).
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład obrazu ukazującego błony i jądra wszystkich kardiomiocytów danio pręgowanego przedstawiono na Rys. 1. Do barwienia próbek serca wypreparowanych z zarodków danio pręgowanego w 52 hpf zastosowano przeciwciała przeciwko mef2c oraz β-kateninie. Podczas gdy przeciwciało mef2c barwi jądra kardiomiocytów, przeciwciało przeciwko β-kateninie uwidacznia granice poszczególnych komórek 8-10. Poprzez regulację stolika mikroskopu złożonego można ustawić obrazy próbek serca w tej samej orientacji, co umożliwi obserwację krzywizny zewnętrznej i wewnętrznej serca 11. Następnie można zmierzyć całkowitą liczbę kardiomiocytów, wielkość komórek kardiomiocytów oraz ich kolistość.
Kolejny przykład ukazujący strukturę sarkomeryczną serca embrionalnego przedstawiono na Ryc. 2. Przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne z użyciem F59, przeciwciała przeciwko miozynie, w przekroju serca embrionalnego. Sieć miofibryli w całym sercu embrionalnym jest wyraźnie widoczna przy niskim powiększeniu, natomiast prążkowany układ grubych filamentów można zaobserwować przy większym powiększeniu (Ryc. 2) 6.
Rycina 1. Immunobarwienie mef2 (czerwony) i β-catenin (zielony) w celu wykazania jąder i konturów kardiomiocytów w komorze serca rybki zebrafish. Pasek skali = 10μm
Rysunek 2. Immunobarwienie miozyny w celu wykazania grubych filamentów w komorze serca ryby zebrafish przy małym powiększeniu (A) lub dużym powiększeniu (B). pasek skali=10μm
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W porównaniu do klasycznych metod immunobarwienia całych preparatów (whole mount), nasza metoda oferuje następujące zalety. Po pierwsze, dzięki poprawie penetracji można konsekwentnie uzyskiwać znacznie silniejsze sygnały fluorescencyjne. W metodzie immunobarwienia całych preparatów gęsta tkanka skóry otaczająca serce znacznie ograniczała penetrację wielu przeciwciał, co prowadziło do wysokiego poziomu tła w całym organizmie. Problem ten jest szczególnie dotkliwy w przypadku embrionów starszych niż 3 dni od zapłodnienia ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Beninio Jomok za pomoc w hodowli danio prążkowanych. Praca ta była finansowana przez NIH HL81753.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| trikaina | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyd | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Strzykawka insulinowa | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Przeciwciało przeciwko β-kateninie | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Przeciwciało przeciwko Mef2c | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Przeciwciało przeciwko α-aktininie | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Przeciwciało przeciwko Ilk | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 kozie przeciwciało przeciwko królikiemu IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiemu IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Medium montażowe do fluorescencji | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Pisak ImmEdge | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Laminaty pokryte poli-L-lizyną | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Wklęsłe szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Mikroskop sekcyjny | Leica Microsystems | ||
| Mikroskop złożony | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 | |||
| 25X Trikaina: 400 mg trikainy 97,9 mL ddH2O 2,1 mL (1M Tris pH9) Dostosować pH do 7,0 |
Bibliografia
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
