Śledzenie sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych

Summary

Opisano metodę fotoenkapsulacji komórek w usieciowanym hydrożelu PEG. Sygnalizacja niedotlenienia w zamkniętych w kapsułkach sim skupiskach insulinoma (MIN6) jest śledzona za pomocą systemu markerów fluorescencyjnych. System ten umożliwia seryjne badanie komórek w rusztowaniu hydrożelowym i korelację sygnalizacji hipoksyjnej ze zmianami fenotypu komórki.

Abstract

W cukrzycy typu 1 autoimmunologiczne zniszczenie komórek β trzustki powoduje utratę produkcji insuliny i potencjalnie śmiertelną hiperglikemię. Jako alternatywną opcję leczenia dla egzogennego wstrzykiwania insuliny, badano przeszczep funkcjonalnej tkanki trzustki^1,2. Takie podejście daje nadzieję na bardziej naturalne, długoterminowe przywrócenie normoglikemii. Ochrona tkanki dawcy przed układem odpornościowym gospodarza jest wymagana, aby zapobiec odrzuceniu, a enkapsulacja jest metodą stosowaną w celu osiągnięcia tego celu.

Materiały pochodzenia biologicznego, takie jak alginian³ i agaroza⁴, były tradycyjnym wyborem do budowy kapsułek, ale mogą wywoływać stan zapalny lub przerost zwłóknienia5, co może utrudniać transport składników odżywczych i tlenu. Alternatywnie, syntetyczne hydrożele na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG) nie ulegają degradacji, łatwo się funkcjonalizują, są dostępne w wysokiej czystości, mają kontrolowaną wielkość porów i są wyjątkowo ^{biokompatybilne,6,7,8}. Dodatkową korzyścią jest to, że hydrożele PEG mogą powstawać szybko w prostej reakcji fotosieciowania, która nie wymaga stosowania temperatur niefizjologicznych^6,7. Taka procedura jest opisana tutaj. W reakcji sieciowania degradacja UV fotoinicjatora, 1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-hydroksy-2-metylo-1-propano-1-on (Irgacure 2959), wytwarza wolne rodniki, które atakują podwójne wiązania winylowo-węglowo-węglowe dimetakrylowalowanego PEG (PEGDM), indukując sieciowanie na końcach łańcucha. Sieciowanie można osiągnąć w ciągu 10 minut. Wykazano, że tak skonstruowane hydrożele PEG korzystnie wspierają komórki^7,9, a niskie stężenie fotoinicjatora i krótka ekspozycja na promieniowanie UV nie są szkodliwe dla żywotności i funkcji kapsułkowanej tkanki¹⁰. Podczas gdy metakryflujemy nasz PEG metodą opisaną poniżej, PEGDM można również kupić bezpośrednio od dostawców takich jak Sigma.

Nieodłączną konsekwencją enkapsulacji jest izolacja komórek od sieci naczyniowej. Dopływ składników odżywczych, zwłaszcza tlenu, jest zatem zmniejszony i ograniczony przez dyfuzję. Ta zmniejszona dostępność tlenu może szczególnie wpływać na β komórek, których funkcja wydzielania insuliny jest w dużym stopniu zależna od tlenu^11-13. Skład i geometria kapsuły będą również miały wpływ na szybkość i długość dyfuzji tlenu. Dlatego opisujemy również technikę identyfikacji niedotlenionych komórek w naszych kapsułkach PEG. Zakażenie komórek rekombinowanym adenowirusem pozwala na wytworzenie sygnału fluorescencyjnego, gdy aktywowane są szlaki wewnątrzkomórkowego czynnika indukowanego hipoksją (HIF)¹⁴. Ponieważ HIF są głównymi regulatorami odpowiedzi transkrypcyjnej na hipoksję, stanowią idealny marker docelowy do wykrywania sygnalizacji niedotlenienia¹⁵. Takie podejście pozwala na łatwe i szybkie wykrywanie niedotlenionych komórek. Krótko mówiąc, adenowirus ma sekwencję dla białka czerwonej fluorescencji (Ds Red DR firmy Clontech) pod kontrolą trymera elementu reagującego na niedotlenienie (HRE). Stabilizacja HIF-1 przez warunki niskiego poziomu tlenu będzie napędzać transkrypcję białka fluorescencyjnego (ryc. 1). Dodatkowe szczegóły na temat budowy tego wirusa zostały opublikowane wcześniej¹⁵. Wirus jest przechowywany w 10% glicerolu w temperaturze -80° C, ile 150 μl podwielokrotności w 1,5 ml probówkach wirówkowych o stężeniu 3,4 x^{10 10} pfu/ml.

Poprzednie badania w naszym laboratorium wykazały, że komórki MIN6 zamknięte jako agregaty zachowują swoją żywotność przez 4 tygodnie hodowli w 20% tlenu. Agregaty MIN6 hodowane w 2 lub 1% tlenu wykazywały zarówno oznaki komórek martwiczych (nadal około 85-90% żywotności) poprzez barwienie bromkiem etydyny, jak i zmiany morfologiczne w stosunku do komórek w 20% tlenu. Gładki kulisty kształt agregatów wyświetlanych na poziomie 20% został utracony, a agregaty wyglądały bardziej jak zdezorganizowane grupy komórek. Chociaż niski stres tlenowy nie powoduje wyraźnego spadku żywotności, wyraźnie wpływa na agregację i funkcję MIN6, mierzoną za pomocą stymulowanego glukozą wydzielania insuliny¹⁵. Analiza Western blot komórek zamkniętych w 20% i 1% tlenu wykazała również znaczny wzrost HIF-1α dla komórek hodowanych w warunkach niskiego poziomu tlenu, co koreluje z ekspresją białka DsRed DR.

Protocol

1. Synteza PEGDM i przygotowanie fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM

1. Zważ 2 g PEG (liniowego, 10 000 Da) do szklanej fiolki o pojemności 40 ml z twardą plastikową nakrętką.
2. Dodać około 308 μl bezwodnika metakrylowego i luźno zakręcić fiolkę.
3. Podgrzewaj fiolkę na wysokich obrotach w kuchence mikrofalowej przez 2 minuty w standardowej domowej kuchence mikrofalowej. Zakładając rękawice odporne na ciepło, dokładnie rozkręć fiolkę, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez dodatkowe 5 minut.
4. Na krótko odczekać, aż fiolka ostygnie na tyle, aby można było z nią obchodzić się w rękawiczkach. Odkręć nakrętkę i powoli dodaj chlorek metylenu, obracając fiolkę. Dodaj tyle, aby roztwór wydawał się klarowny i jednorodny, wirując próbkę w razie potrzeby. Całkowita objętość użytego chlorku metylenu powinna wynosić 1,5 - 2 ml.
5. Wytrącić PEGDM w 200 ml zimnego, wymieszanego eteru dietylowego, dodając roztwór kroplami.
6. Zebrać PEGDM przez filtrację próżniową i pozostawić do wyschnięcia.
7. Rozpuść PEGDM w odpowiedniej ilości wody dejonizowanej (zwykle 100 -150 ml).
8. Roztwór należy dializować z wodą dejonizowaną przez 5 dni w rurkach dializacyjnych o wartości granicznej masy cząsteczkowej 1,000 Da. Wymieniaj wodę raz dziennie.
9. Roztwór przelać do odpowiednich pojemników i zamrozić w temperaturze -80°C przez noc. Liofilizuj roztwór przez 4 dni, aby uzyskać oczyszczony biały proszek PEGDM. Przechowywać proszek w temperaturze 4°C, gdy nie jest używany.
10. Aby przygotować fotoaktywny roztwór PEGDM, należy najpierw przygotować roztwór podstawowy fotoinicjatora o stężeniu 0,5 procenta wagowego, rozpuszczając Irgacure 2959 w wodzie dejonizowanej. Zmieszaj roztwór i przechowuj go w ciemności.
11. Przygotować 10% wagowy roztwór PEGDM i 0,025% wag. Irgacure 2959 w Zrównoważonym Roztworze Soli Hanka (HBSS). Dokładnie przemieszać, aby zapewnić rozpuszczenie PEGDM. Zazwyczaj przygotowujemy jednorazowo 1 ml tego roztworu.
12. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml. Zawiń probówkę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze 4°C

2. Hodowla, infekcja i agregacja komórek MIN6

1. Komórki MIN6 hoduje się w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, 7 mM glukozy, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 0,5 μg/ml amfotercyny B w wilgotnym środowisku w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
2. Aby uwolnić komórki z powierzchni kolby hodowlanej poddanej działaniu substancji, należy odessać pożywkę, przepłukać komórki HBSS o temperaturze 37°C bez wapnia/magnezu, odessać HBSS, a następnie dodać 2 ml roztworu trypsyny-EDTA o temperaturze 37°C i pozostawić komórki do inkubacji przez 3 minuty.
3. Mocno nacisnąć bok kolby, aby uwolnić komórki, a następnie dodać 8 ml pożywki o temperaturze 37°C i energicznie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
4. Pipetować komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wykonać zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub innej procedury liczenia komórek.
5. Przygotowując się do zakażenia komórek wirusem twórcy, należy najpierw określić całkowitą liczbę komórek, które mają zostać zainfekowane, i obliczyć objętość zawiesiny wirusa wymaganą do osiągnięcia pożądanej wielokrotności infekcji (MOI) (od 50 do 100 zakaźnych cząstek na komórkę).
6. Rozcieńczyć wirusa w HBSS, ostrożnie dozując odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do wstępnie podanej objętości HBSS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml. Właściwe jest 50 μl HBSS na studzienkę komórek agregujących.
7. Rozproszyć komórki, pipetując je w górę iw dół w probówce, a następnie odpipetować niezbędną objętość, aby uzyskać 400 000 komórek na studzienkę do dołka na 6-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej.
8. Dodaj odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki, aby osiągnąć pożądany MOI.
9. Dodaj pożywkę do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość do 1,7 ml.
10. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora. Ustaw wytrząsarkę na niskim ustawieniu, aby medium delikatnie myło się wokół studzienek ( ̃100 obr./min). Pozwól komórkom agregować się przez 24-36 godzin. Należy formować kruszywa o przybliżonej średnicy 75-175 μm.

3. Hermetyzacja komórek w PEGDM

1. Komórki mogą być kapsułkowane jako dyspersja (krok 2.4) lub po agregacji (krok 2.10). Ponieważ roztwór PEGDM prekursora hydrożelu jest cieczą, komórki mogą mieć tendencję do osiadania przed sieciowaniem i tworzeniem hydrożelu. Jeśli oczekuje się, że osiadanie nastąpi szybko, na przykład w przypadku większych agregatów, korzystne może być wytwarzanie hydrożelu w dwóch etapach, tak aby komórki osiadły na centralnej płaszczyźnie żelu. Przedstawiono jednoetapową procedurę syntezy hydrożelu odpowiednią dla komórek rozproszonych (rysunek 2), a także procedurę dwuetapową (rysunek 3) i szczegółowo opisano poniżej (3.2-3.9).
2. Stwórz naczynie, w którym utworzy się hydrożel, odcinając stożkową końcówkę plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i umieszczając ją otwartym końcem w stojaku.
3. Odmierzyć pipetę 20 μl fotoaktywnego roztworu PEGDM do otwartego końca strzykawki na tłok, upewniając się, że objętość pokrywa całą powierzchnię tłoka. Regulować tłok małymi krokami, aby uzyskać płaską powierzchnię płynu.
4. Umieść pipetę w stojaku i umieść ją pod lampą UV (365 nm, ̃7 mW/cm²) na około 8 minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelowe. W tym czasie można rozpocząć przygotowanie komórek
5. Odmierzyć pipetę zawierającą żądaną liczbę komórek/agregatów do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,8 ml, nakryć i odwirować probówkę o masie 130 g przez 5 minut.
6. Za pomocą mikropipetora ostrożnie usunąć pożywkę, nie naruszając osadu komórkowego na końcu probówki. Gdy głowica pożywki zbliża się do granulki, pomocne może być użycie drobniejszej końcówki pipety o pojemności 10 μl.
7. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 20 μl fotoaktywnego roztworu PEGDM (w przypadku pracy z agregatami należy użyć końcówki pipety z szerokim otworem) i dodać zawiesinę komórek do strzykawki na wierzchu uprzednio usieciowanej części hydrożelu.
8. Wystawić strzykawkę na działanie dodatkowych 8 minut światła UV, aby zakończyć budowę hydrożelu. Po zakończeniu komórki powinny być całkowicie zamknięte w cylindrycznym hydrożelu (ryc. 3).
9. Wysunąć hydrożel ze strzykawki i wlać go do 1 ml HBSS w zagłębieniu 24-dołkowej płytki, aby krótko przepłukać żel. Przenieść żel do 1 ml pożywki w dołku 24-dołkowej płytki i wyhodować w pożądanych warunkach.

4. Śledzenie niedotlenienia

1. W dowolnym momencie hodowli zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić inicjację sygnalizacji niedotlenienia. W zależności od tego, co jest obrazowane, można obrazować w płytce wielodołkowej lub przenieść żel na szkiełko mikroskopowe przed umieszczeniem na stoliku mikroskopu. Szczytowe wzbudzenie Ds Red osiąga się przy 556 nm, a szczytowa emisja występuje przy 586 nm. Emisja jest dość intensywna, dlatego nie zaobserwowano, aby fotowybielanie było problematyczne. Czas opóźnienia między rozpoczęciem produkcji białka a wykryciem pierwszego sygnału wynosi około 12 godzin. Sygnał jest wystarczająco specyficzny, aby zidentyfikować poszczególne komórki sygnalizacyjne, ale rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia lokalizacji sygnału wewnątrzkomórkowego. W komórkach sygnalizacyjnych sygnał jest zwykle obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie. Intensywność sygnału może również wzrosnąć przy długotrwałej ekspozycji na niedotlenienie, chociaż nie ustaliliśmy jeszcze w pełni, czy jest to spowodowane zwiększoną ekspresją białka, ogólną akumulacją białka, czy opóźnionym dojrzewaniem białka.

5. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny przykład agregatów MIN6 zamkniętych w hydrożelu PEG jest pokazany na rysunku 4. Usieciowany żel będzie przez cały czas stały, przyjmując kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję. Do implantacji preferowany jest żel o gładkich powierzchniach zewnętrznych, aby zapobiec reakcji ciała obcego. Wewnątrz żelu agregaty komórkowe powinny być całkowicie zamknięte w matrycy i jednorodnie rozmieszczone, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych.

Reprezentatywne obrazy sygnalizacji hipoksyjnej w agregatach MIN6 są pokazane na rysunku 5. Identyczne agregaty MIN6 zakażone wirusem markerowym hodowano w 20%_O2 (5a) lub 1%_O2 (5b) przez 44 godziny przed uchwyceniem obrazu.

Rysunek 1. Schemat działania naszego systemu markerów niedotlenienia. Adenowirusowa insercja genu DR Ds Red i promotora HRE pozwala na indukowaną hipoksją produkcję białka fluorescencyjnego pod kontrolą HIF-1.

Rysunek 2. Proceduralny schemat blokowy dla jednoetapowej enkapsulacji rozproszonych komórek MIN6 w usieciowanym hydrożelu PEGDM. Dla każdego żelu zdyspergowane komórki są zawieszone w 40 μl fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM. Umieszcza się go w strzykawce o pojemności 1 ml, a hydrożel formuje się pod wpływem światła UV 365 nm po 10-12 minutach. Po zakończeniu, krążek hydrożelu wyjmuje się ze strzykawki, myje i umieszcza w płytce wypełnionej podłożem w celu inkubacji.

Rysunek 3. Proceduralny schemat blokowy dla dwuetapowej enkapsulacji zagregowanych komórek MIN6 w usieciowanym hydrożelu PEGDM. Dla każdego żelu najpierw tworzy się półżel przez sieciowanie UV 20 μl fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM przez 8 minut. Agregaty MIN6 są ostrożnie zawieszane w dodatkowych 20 μl fotoaktywnego roztworu makromeru, który dodaje się do wstępnie uformowanego półżelu. Pełny żel powstaje w wyniku dodatkowych 8 minut ekspozycji na promieniowanie UV z agregatami całkowicie zamkniętymi w środkowej płaszczyźnie żelu.

Rysunek 4. Obraz hydrożelu o pojemności 40 μl w 20-krotnym powiększeniu. Agregaty MIN6 (~ 400 000 komórek ogółem) są wyraźnie widoczne w żelu. Średnica hydrożelu wynosi około 6 mm (bar = 1 mm).

Rysunek 5. Sygnalizacja fluorescencyjnej hipoksji w zagregowanych komórkach MIN6 w hydrożelu PEGDM. Komórki, które zostały zamknięte, a następnie umieszczone w inkubacji w temperaturze 20%_O2 przez 44 godziny, nie wykazują sygnalizacji niedotlenienia (a), podczas gdy komórki, które zostały zamknięte, a następnie inkubowane w 2%_O2 przez 44 godziny, wyświetlają wyraźny, wszechobecny sygnał. (bar = 100μm) lit. b).

Discussion

Przedstawiona tutaj metoda oferuje szybką i prostą technikę enkapsulacji komórek w hydrożelu PEG przy minimalnym wykorzystaniu warunków niefizjologicznych. PEG jest bardzo przydatnym materiałem do hermetyzacji ze względu na jego biokompatybilność i łatwość modyfikacji. Na przykład prosta zmiana procentowej zawartości PEG w roztworze fotoaktywnym może być wykorzystana do dostosowania właściwości mechanicznych, takich jak moduł ściskania i właściwości transportowe poprzez wielkość porów. Ponadto PEG można łatwo modyfikować poprzez dodanie łańcuchów bocznych. Hydrożele PEG stanowią zatem zarówno obiecujące urządzenie kliniczne, jak i elastyczną platformę do badań in vitro

Zaprezentowano również metodę śledzenia niedotlenienia w komórkach zamkniętych w PEG. Ta metoda jest przydatna ze względu na prostotę wykrywania hipoksji i uniknięcie konieczności poświęcania komórek będących przedmiotem zainteresowania. Technika ta może być stosowana do różnych typów komórek w różnych warunkach, co sprawia, że jej użyteczność jest szeroka. Na przykład niedotlenienie jako wskazówka do różnicowania komórek macierzystych może być śledzone w hodowlach mikromas komórek macierzystych. Jednak metoda ta może być stosowana tylko do rozproszonych układów komórkowych lub układów, w których rozproszone komórki są później agregowane. Ponadto wykrycie sygnału fluorescencyjnego może być trudne w większych lub gęstszych tkankach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Bezwodnik metakrylowy	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Kuchenka mikrofalowa	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries Inc.	SI-A236
Chlorek metylenu	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Eter dietylowy	Sigma-Aldrich	346136-1L
Rurki do dializy	Spectrum	132640
	Laboratoria
Liofilizator zamrażarki
	Labconco Corp.
Pompa próżniowa	Welch Allyn	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech, Inc.	21-022-CV
Filtr strzykawkowy	VWR international	28145-477
RPMI 1640	Mediatech, Inc.	*	*niestandardowa
formuła FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicylina-Streptomycyna	Mediatech, Inc.	30-002-CI
Amfoterycyna B	Mediatech, Inc.	30-003-CF
Inkubator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3597	Napco Series 8000 WJ z tłumieniem O2
Trypsyna EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Wytrząsarka orbitalna	VWR international	12620-926
Lampa UV	Sanyo Denki	FLR40SBLB/M	Mieści dwie 40W, 365nm czarno-niebieskie żarówki UV
Wirówka	Eppendorf	5811 000.010*	*numer zamówienia. Model 5810 R
	Mikroskop Nikon Instruments	TI-ND6-PFS	Z zestawem filtrów do wzbudzenia 556nm / 586nm emisja