Śledzenie sygnalizacji hipoksycznej wewnątrz enkapsulowanych agregatów komórkowych

Podsumowanie

Opisano metodę fotoenkapsulacji komórek w sieciowanym hydrożelu PEG. Sygnalizację hipoksji wewnątrz enkapsulowanych agregatów mysiego insulinoma (MIN6) śledzono przy użyciu fluorescencyjnego systemu markerów. System ten umożliwia seryjne badanie komórek wewnątrz rusztowania hydrożelowego oraz korelację sygnalizacji hipoksji ze zmianami fenotypu komórek.

Streszczenie

W cukrzycy typu 1 autoimmunologiczne zniszczenie komórek β trzustki prowadzi do utraty produkcji insuliny i potencjalnie śmiertelnej hiperglikemii. Jako alternatywną opcję leczenia w stosunku do egzogennych zastrzyków z insuliny badano transplantację funkcjonalnej tkanki trzustki^1,2. Podejście to daje nadzieję na bardziej naturalne, długoterminowe przywrócenie normoglikemii. Aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu, konieczna jest ochrona tkanki dawcy przed układem odpornościowym biorcy, a enkapsulacja jest metodą stosowaną w celu osiągnięcia tego celu.

Materiały pochodzenia biologicznego, takie jak alginian³ i agaroza⁴, były tradycyjnym wyborem do konstrukcji kapsułek, lecz mogą indukować stan zapalny lub przerost włóknisty⁵, co może utrudniać transport składników odżywczych i tlenu. Alternatywnie, syntetyczne hydrożele na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG) są nietrwałe, łatwo funkcjonalizowane, dostępne w wysokiej czystości, posiadają kontrolowaną wielkość porów i są niezwykle biokompatybilne^6,7,8. Dodatkową zaletą jest to, że hydrożele PEG mogą być szybko tworzone w prostej reakcji fotousieciowania, która nie wymaga stosowania temperatur niefizjologicznych^6,7. Taka procedura została tutaj opisana. W reakcji sieciowania degradacja UV fotoinicjatora, 1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-hydroksy-2-metylo-1-propanonu (Irgacure 2959), wytwarza wolne rodniki, które atakują winylowe podwójne wiązania węgiel-węgiel dimetakrylowanego PEG (PEGDM), indukując sieciowanie na końcach łańcuchów. Sieciowanie może zostać osiągnięte w ciągu 10 minut. Wykazano, że hydrożele PEG skonstruowane w ten sposób sprzyjają przeżywalności komórek^7,9, a niskie stężenie fotoinicjatora i krótka ekspozycja na promieniowanie UV nie są szkodliwe dla żywotności i funkcji enkapsulowanej tkanki¹⁰. Chociaż przeprowadzamy metakrylowanie PEG metodą opisaną poniżej, PEGDM można również bezpośrednio zakupić u dostawców takich jak Sigma.

Nieuchronną konsekwencją enkapsulacji jest izolacja komórek od sieci naczyniowej. Dostawa substancji odżywczych, a w szczególności tlenu, jest zatem ograniczona i zależna od dyfuzji. Zmniejszona dostępność tlenu może w szczególności wpływać na komórki β, których funkcja wydzielania insuliny jest silnie zależna od tlenu^11-13. Skład i geometria kapsułki będą również wpływać na szybkość i drogę dyfuzji tlenu. W związku z tym opisujemy również technikę identyfikacji komórek niedotlenionych w naszych kapsułkach z PEG. Infekcja komórek rekombinowanym adenowirusem umożliwia wygenerowanie sygnału fluorescencyjnego w momencie aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków czynnika indukowanego hipoksją (HIF)¹⁴. Ponieważ HIF-y są głównymi regulatorami odpowiedzi transkrypcyjnej na hipoksję, stanowią one idealny marker docelowy do wykrywania sygnalizacji hipoksycznej¹⁵. Podejście to pozwala na łatwe i szybkie wykrywanie komórek niedotlenionych. W skrócie, adenowirus posiada sekwencję czerwonego białka fluorescencyjnego (Ds Red DR z Clontech) pod kontrolą trimeru elementu odpowiadającego na hipoksję (HRE). Stabilizacja HIF-1 w warunkach niskiego poziomu tlenu będzie napędzać transkrypcję białka fluorescencyjnego (Rycina 1). Dodatkowe szczegóły dotyczące konstrukcji tego wirusa zostały opublikowane wcześniej¹⁵. Wirus jest przechowywany w 10% glicerolu w temperaturze -80° C w wielu alikwotach po 150 μL w probówkach wirówkowych 1,5 mL w stężeniu 3,4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Poprzednie badania w naszym laboratorium wykazały, że komórki MIN6 enkapsulowane w formie agregatów zachowują żywotność przez 4 tygodnie hodowli w 20% tlenie. Agregaty MIN6 hodowane w 2% lub 1% tlenu wykazywały zarówno oznaki obecności komórek nekrotycznych (nadal około 85-90% żywotnych) w barwieniu bromkiem etydium, jak i zmiany morfologiczne w porównaniu z komórkami w 20% tlenie. Gładki, sferyczny kształt agregatów obserwowany przy 20% tlenu został utracony, a agregaty przypominały bardziej zdezorganizowane grupy komórek. Chociaż stres związany z niskim stężeniem tlenu nie powoduje gwałtownego spadku żywotności, wyraźnie wpływa on na agregację i funkcję komórek MIN6, co zmierzono za pomocą wydzielania insuliny stymulowanego glukozą¹⁵. Analiza Western blot enkapsulowanych komórek w 20% i 1% tlenie wykazała również istotny wzrost poziomu HIF-1α w komórkach hodowanych w warunkach niskiego stężenia tlenu, co koreluje z ekspresją białka DsRed DR.

Protokół

1. Synteza PEGDM oraz przygotowanie fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM

1. Odważ 2g PEG (liniowy, 10 000Da) do szklanej fiolki o pojemności 40mL z twardą plastikową zakrętką.
2. Dodaj około 308μL bezwodnika metakrylowego i lekko zakręć fiolkę.
3. Podgrzewaj fiolkę w standardowej kuchence mikrofalowej na wysokiej mocy przez 2 minuty. Mając na dłoniach rękawice odporne na wysoką temperaturę, dokładnie wymieszaj zawartość fiolki za pomocą wortexa, a następnie podgrzewaj na wysokiej mocy przez kolejne 5 minut.
4. Odczekaj chwilę, aż fiolka ostygnie na tyle, aby można było ją bezpiecznie trzymać w rękawicach. Odkręć zakrętkę i powoli dodawaj chlorek metylenu, delikatnie obracając fiolkę. Dodaj taką ilość, aby roztwór stał się przejrzysty i jednorodny, w razie potrzeby mieszając próbkę na wortexie. Całkowita objętość użytego chlorku metylenu powinna wynosić 1,5 - 2 mL.
5. Wytrąć PEGDM w 200 mL zimnego, mieszanego eteru dietylowego, dodając roztwór kroplami.
6. Zbierz PEGDM za pomocą filtracji próżniowej i pozostaw do wyschnięcia.
7. Rozpuść PEGDM w odpowiedniej ilości wody dejonizowanej (zazwyczaj 100 -150 mL).
8. Dializuj roztwór przeciwko wodzie dejonizowanej przez 5 dni w tubach dializacyjnych o progu odcięcia masy cząsteczkowej 1 000 Da. Wymieniaj wodę raz dziennie.
9. Rozdziel roztwór do odpowiednich pojemników i zamroź w temperaturze -80°C przez noc. Liofilizuj roztwór przez 4 dni, aby otrzymać oczyszczony biały proszek PEGDM. Przechowuj proszek w temperaturze 4°C, gdy nie jest używany.
10. Aby przygotować fotoaktywny roztwór PEGDM, przygotuj najpierw 0,5% wagowo roztwór zapasowy fotoinicjatora, rozpuszczając Irgacure 2959 w wodzie dejonizowanej. Wymieszaj roztwór na wortexie i przechowuj w ciemności.
11. Przygotuj roztwór 10% wagowo PEGDM i 0,025% wagowo Irgacure 2959 w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). Wymieszaj dokładnie na wortexie, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie PEGDM. Zazwyczaj przygotowujemy 1mL tego roztworu jednorazowo.
12. Zesterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL. Owiń probówkę folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4°C.

2. Hodowla, zakażanie i agregacja komórek MIN6

1. Komórki MIN6 hoduje się w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS, 7mM glukozy, 100 jednostek/mL penicyliny/streptomycyny oraz 0,5 μg/mL amfoterycyny B w warunkach zwiększonej wilgotności w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
2. Aby uwolnić komórki z powierzchni podłoża w kolbie hodowlanej, odessaj pożywkę, przemyj komórki roztworem HBSS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37°C, odessaj HBSS, a następnie dodaj 2 mL roztworu trypsyny-EDTA o temperaturze 37°C i inkubuj komórki przez 3 minuty.
3. energicznie uderz w bok kolby, aby odczepić komórki, a następnie dodaj 8 mL pożywki o temperaturze 37°C i intensywnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
4. Przenieś komórki pipetą do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mL i wykonaj zliczenie komórek za pomocą hemocytometru lub innej procedury zliczania komórek.
5. Przygotowując się do zakażenia komórek wirusem markerowym, najpierw określ całkowitą liczbę komórek do zakażenia i oblicz objętość zawiesiny wirusa niezbędną do uzyskania pożądanej wielokrotności zakażenia (MOI) (od 50 do 100 cząstek zakaźnych na komórkę).
6. Rozcieńcz wirusa w HBSS, ostrożnie pipetując odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do wcześniej odmierzonej objętości HBSS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL. Odpowiednia ilość to 50 μL HBSS na dołek z agregującymi komórkami.
7. Rozprosz komórki, pipetując je w górę i w dół w probówce, a następnie przenieś wymaganą objętość, aby uzyskać 400 000 komórek na dołek, do dołków 6-dołkowej płytki do hodowli w zawiesinie.
8. Dodaj do każdego dołka odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa, aby uzyskać pożądane MOI.
9. Dodaj pożywkę do każdego dołka, aby zwiększyć objętość całkowitą do 1,7 mL.
10. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora. Ustaw wytrząsarkę na niskie obroty, tak aby pożywka delikatnie opływała dołki (˜100 rpm). Pozostaw komórki do agregacji na 24-36 godzin. Powinny utworzyć się agregaty o przybliżonej średnicy 75-175 μm.

3. Enkapsulacja komórek w PEGDM

1. Komórki mogą być enkapsulowane w formie dyspersji (krok 2.4) lub po agregacji (krok 2.10). Ponieważ roztwór prekursora hydrożelu PEGDM jest cieczą, komórki mogą mieć tendencję do osadzania się przed sieciowaniem i formowaniem hydrożelu. Jeśli oczekuje się szybkiego osadzania, na przykład w przypadku większych agregatów, korzystne może być wytworzenie hydrożelu w dwóch etapach, aby komórki osadziły się w centralnej płaszczyźnie żelu. Procedura jednoetapowej syntezy hydrożelu odpowiednia dla komórek w dyspersji została przedstawiona na (Rysunku 2), a procedura dwuetapowa została pokazana na (Rysunku 3) i szczegółowo opisana poniżej (3.2-3.9).
2. Przygotuj naczynie, w którym zostanie uformowany hydrożel, odcinając zwężoną końcówkę plastikowej strzykawki 1 mL i umieszczając ją otwartym końcem do góry w statywie.
3. Pipetuj 20 μL fotoaktywnego roztworu PEGDM do otwartego końca strzykawki, na tłok, upewniając się, że objętość pokrywa całą powierzchnię tłoka. Reguluj położenie tłoka w niewielkich przyrostach, aby uzyskać płaską powierzchnię cieczy.
4. Umieść pipetę w statywie i ustaw statyw pod lampą UV (365nm, ˜7 mW/cm²) na około 8 minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelu. W tym czasie można rozpocząć przygotowanie komórek.
5. Pipetuj objętość zawierającą pożądaną liczbę komórek/agregatów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL, zakręć i wiruj probówkę przy 130 g przez 5 minut.
6. Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń medium, nie naruszając pelletu komórkowego na dnie probówki. Gdy poziom medium zbliży się do pelletu, pomocne może być użycie cieńszego końcówki do pipety 10 μL.
7. Łagodnie resuspenduj pellet komórkowy w 20 μL fotoaktywnego roztworu PEGDM (w przypadku pracy z agregatami użyj końcówki do pipety o szerokim wylocie) i dodaj zawiesinę komórkową do strzykawki, na wierzch wcześniej usieciowanej części hydrożelu.
8. Naświetlaj strzykawkę dodatkowymi 8 minutami światła UV, aby dokończyć formowanie hydrożelu. Po zakończeniu komórki powinny być w pełni zamknięte w cylindrycznym hydrożelu (Rysunek 3).
9. Wysuń hydrożel ze strzykawki do 1 mL HBSS w studzience płytki 24-dołkowej, aby krótko wypłukać żel. Przenieś żel do 1 mL medium w studzience płytki 24-dołkowej i inkubuj w pożądanych warunkach.

4. Monitorowanie hipoksji

1. Na dowolnym etapie hodowli obrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić rozpoczęcie sygnalizacji hipoksycznej. W zależności od tego, co jest obrazowane, można to robić bezpośrednio w płytce wielodołkowej lub przenieść żel na szkiełko przedmiotowe przed umieszczeniem go na stoliku mikroskopu. Maksymalne wzbudzenie Ds Red osiąga się przy 556nm, a maksymalna emisja występuje przy 586nm. Emisja jest dość intensywna, w związku z czym nie zaobserwowano problemów z fotoblakaniem. Czas opóźnienia między rozpoczęciem produkcji białka a pierwszą detekcją sygnału wynosi około 12 godzin. Sygnał jest na tyle specyficzny, że pozwala na identyfikację poszczególnych komórek sygnalizujących, jednak rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji sygnału. W komórkach sygnalizujących sygnał jest zazwyczaj obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie. Intensywność sygnału może również wzrastać przy przedłużonej ekspozycji na hipoksję, choć nie ustaliliśmy jeszcze w pełni, czy wynika to ze zwiększonej ekspresji białka, ogólnej akumulacji białka czy opóźnionego dojrzewania białka.

5. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny przykład agregatów MIN6 zamkniętych w hydrożelu PEG przedstawiono na Rysunku 4. Usieciowany żel będzie jednorodnie stały, przyjmując kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję. W celu ułatwienia zapobiegania reakcji na ciało obce, do implantacji preferowany jest żel o gładkich powierzchniach zewnętrznych. Wewnątrz żelu agregaty komórkowe powinny być w pełni zamknięte w macierzy i rozmieszczone homogenicznie, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych.

Reprezentatywne obrazy sygnalizacji hipoksycznej w agregatach MIN6 przedstawiono na Rysunku 5. Identyczne agregaty MIN6 zainfekowane wirusem markerowym hodowano w atmosferze 20% O₂ (5a) lub 1% O₂ (5b) przez 44 godziny przed wykonaniem obrazowania.

Rysunek 1. Schemat działania naszego systemu markerów hipoksji. Adenowirusowa insercja genu Ds Red DR oraz położonego powyżej promotora HRE umożliwia indukowaną hipoksją produkcję białka fluorescencyjnego pod kontrolą HIF-1.

Rycina 2. Schemat procedury jednotapowej enkapsulacji zdyspergowanych komórek MIN6 w sieciowanym hydrożelu PEGDM. W przypadku każdego żelu zdyspergowane komórki zawiesza się w 40μL fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM. Roztwór ten umieszcza się w odciętej strzykawce o pojemności 1mL, a hydrożel formuje się pod wpływem światła UV o długości fali 365nm przez 10-12 minut. Po zakończeniu procesu dysk hydrożelowy wyjmuje się ze strzykawki, przemywa i umieszcza w wypełnionej pożywką płytce wielodołkowej w celu inkubacji.

Rycina 3. Schemat procedury dwuetapowej enkapsulacji agregatów komórek MIN6 w sieciowanym hydrożelu PEGDM. W przypadku każdego żelu, najpierw tworzona jest połowa żelu poprzez sieciowanie UV 20μL fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM przez 8 minut. Agregaty MIN6 są ostrożnie zawieszone w dodatkowych 20μL fotoaktywnego roztworu makromeru, który nanosi się na wcześniej uformowaną połowę żelu. Pełny żel powstaje po kolejnych 8 minutach ekspozycji na promieniowanie UV, w wyniku czego agregaty zostają w pełni zamknięte w płaszczyźnie środkowej żelu.

Rysunek 4. Obraz 40μL hydrożelu przy 20-krotnym powiększeniu. Wewnątrz żelu wyraźnie widoczne są agregaty MIN6 (~400,000 komórek łącznie). Średnica hydrożelu wynosi około 6mm (pasek = 1mm).

Rysunek 5. Fluorescencyjne sygnalizowanie hipoksji w zagregowanych komórkach MIN6 w hydrożelu PEGDM. Komórki, które zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane przy 20% O₂ przez 44 godziny, nie wykazują sygnalizowania hipoksji (a), natomiast komórki enkapsulowane, a następnie inkubowane przy 2% O₂ przez 44 godziny, wykazują wyraźny, powszechny sygnał (pasek skali = 100μm) (b).

Dyskusja

Metoda zaprezentowana w niniejszym opracowaniu oferuje szybką i prostą technikę enkapsulacji komórek w hydrożelu PEG przy minimalnym wykorzystaniu warunków niefizjologicznych. PEG stanowi bardzo użyteczny materiał do enkapsulacji ze względu na swoją biokompatybilność i łatwość modyfikacji. Prosta zmiana procentowej zawartości PEG w roztworze fotoaktywnym może być na przykład wykorzystana do regulacji właściwości mechanicznych, takich jak moduł sprężystości przy ściskaniu, oraz właściwości transportowych poprzez wielkość porów. Ponadto PEG jest łatwo modyfikowalny poprzez dodawanie łańcuchów bocznych. Hydrożele PEG stanowią zatem zarówno obiecujące urządzenie kliniczne, jak i elastyczną platformę do badań in vitro

Przedstawiono również metodę śledzenia hipoksji w komórkach enkapsulowanych w PEG. Metoda ta jest użyteczna ze względu na prostotę detekcji hipoksji oraz brak konieczności poświęcania badanych komórek. Technikę tę można zastosować do wielu rodzajów komórek w różnych warunkach, co nadaje jej szerokie zastosowanie. Na przykład można śledzić hipoksję jako sygnał do różnicowania komórek macierzystych w kulturach mikromasy komórek macierzystych. Jednak metoda ta może być stosowana wyłącznie w systemach komórek rozproszonych lub w systemach, w których rozproszone komórki są później agregowane. Ponadto detekcja sygnału fluorescencyjnego może być utrudniona w tkankach większych lub gęstszych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Bezwodnik metakrylowy	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Kuchenka mikrofalowa	Emerson	MW8784SB
Vortex	Scientific Industries Inc.	SI-A236
Chlorek metylenu	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Eter dietylowy	Sigma-Aldrich	346136-1L
Membrana do dializy	Spectrum	132640
	Laboratories
Zamrażarka
Liofilizator	Labconco Corp.	7670521
Pompa próżniowa	Welch Allyn	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech, Inc.	21-022-CV
Filtr strzykawkowy	VWR international	28145-477
RPMI 1640	Mediatech, Inc.	*	*skład niestandardowy
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicylina-streptomycyna	Mediatech, Inc.	30-002-CI
Amfoterycyna B	Mediatech, Inc.	30-003-CF
Inkubator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3597	Napco Series 8000 WJ z redukcją O2
Trypsyna EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Mieszadło orbitalne	VWR international	12620-926
Lampa UV	Sanyo Denki	FLR40SBLB/M	Pomieszcza dwie niebieskie żarówki UV 40W, 365nm
Wirówka	Eppendorf	5811 000.010*	*numer zamówienia. Model 5810 R
Mikroskop	Nikon Instruments	TI-ND6-PFS	Z zestawem filtrów dla wzbudzenia 556nm/ emisji 586nm