Artykuł metodologiczny

Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3543

⸱

16 lutego 2012

 ,  ,  , 
1Women & Infants Hospital of Rhode Island, Alpert Medical School of Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju płuc oraz w ich uszkadzaniu. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów z płuc płodowych gryzoni i poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu systemu in vitro.

Streszczenie

Siły mechaniczne generowane in utero przez powtarzające się ruchy przypominające oddychanie oraz przez rozciąganie cieczą są kluczowe dla prawidłowego rozwoju płuc. Kluczowym elementem rozwoju płuc jest różnicowanie nabłonkowych komórek pęcherzykowych typu II, które są głównym źródłem surfaktantu płucnego. Komórki te uczestniczą również w homeostazie płynów w świetle pęcherzyków, obronie gospodarza oraz naprawie uszkodzeń. Dodatkowo komórki dystalnego miąższu płuc mogą być bezpośrednio narażone na nadmierne rozciąganie podczas wentylacji mechanicznej po urodzeniu. Jednakże precyzyjne mechanizmy molekularne i komórkowe, dzięki którym komórki płuc wykrywają bodźce mechaniczne, wpływając na rozwój płuc i sprzyjając ich uszkodzeniu, nie są w pełni zrozumiałe. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek typu II i fibroblastów z płodowych płuc gryzoni, zapewniającą wysoką czystość preparatu. Następnie opisujemy system in vitro, Flexcell Strain Unit, służący do dostarczania stymulacji mechanicznej komórkom płodowym, co symuluje siły mechaniczne występujące podczas rozwoju płuc płodu lub w przebiegu uszkodzenia płuc. Ten system eksperymentalny stanowi doskonałe narzędzie do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych w komórkach płodowych płuc narażonych na rozciąganie. Wykorzystując to podejście, nasze laboratorium zidentyfikowało kilka receptorów i białek sygnałowych uczestniczących w mechanotransdukcji podczas rozwoju płuc płodu oraz w procesie uszkodzenia płuc.

Protokół

1. Powlekanie płytek białkami ECM

  1. W warunkach sterylnych wymieszać 120 μg lamininy z 12 ml zimnego sterylnego 1X PBS na każdą płytkę.
  2. Przygotować niepotraktowane płytki Bioflex i dodać 2 ml roztworu do każdej studni (końcowe stężenie lamininy wynosi 2 μg/cm2). Alternatywnie można zastosować inne białka ECM, takie jak kolagen typu I [10 μg/cm2], fibronektyna [5 μg/cm2], witronektyna [0,5 μg/cm2] lub elastyna [10 μg/cm2]. Technika powlekania jest analogiczna do opisanej dla lamininy. Należy upewnić się, że studnie są całkowicie pokryte roztworem.
  3. Owiniąć płytki folią i pozostawić na płaskiej powierzchni w temperaturze 4°C przez noc, aby umożliwić adsorpcję lamininy do dna studni. W tych warunkach płytki można przechowywać przez co najmniej tydzień, zachowując prawidłową funkcjonalność ECM.
  4. Następnego dnia, w warunkach sterylnych, wypłukać studnie 3 razy za pomocą 1X PBS.
  5. Do każdej studni dodać 1 ml 1% BSA w 1X PBS i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 h w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania na membranach.
  6. Wypłukać płytki 3 razy za pomocą 1X PBS, aby usunąć niezaadsorbowane białka.
  7. Przechowywać płytki w temperaturze 37°C w medium DMEM do momentu wyizolowania komórek w kroku 2.14.

2. Izolacja komórek nabłonkowych typu II płuc płodowych gryzoni

Dzień przed izolacją należy przygotować autoklawowane kubki z sitami o różnych rozmiarach oczek nylonowych.

  1. Pobrać płuca płodowe z ciężarnych myszy/szczurów w 17-19 dniu ciąży (E17-19). Przenieść tkankę do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej medium DMEM i umieścić na lodzie.
  2. Przygotować bufor do trawienia w probówce stożkowej o pojemności 50 ml: (10 ml). Dla tej objętości wykorzystuje się tkankę płuc z około 20 płodów myszy/szczura.
    8,5 ml DMEM
    0,5 ml 500mM HEPES pH 7,4
    5 mg kolagenazy 1
    5 mg kolagenazy 1A
    1 ml surowicy kurzej, inaktywowanej ciepłem
  3. Wymieszać dokładnie do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 mikrona w sterylnej komorze laminarnej. Umieścić probówkę stożkową z buforem do trawienia w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
  4. Usunąć medium DMEM z probówki stożkowej z kroku 2.1 i przenieść tkankę do sterylnej płytki Petriego.
  5. Dokładnie posiekać płuca sterylnymi nożyczkami lub żyletką, tak aby kawałki tkanki miały mniej niż 1 mm, a następnie przenieść tkankę do probówki stożkowej zawierającej uprzednio ogrzany bufor do trawienia z kroku 2.3.
  6. Strawić tkankę poprzez wielokrotne pipetowanie:
    100 razy pipetą 10 ml
    100 razy pipetą 5 ml
    100 razy pipetą Pasteura
  7. Odwirować homogenat przy 1 300 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Ostrożnie usunąć nadosad przez aspirację i resuspender osad zawierający komórki w 15 ml DMEM z dodatkiem 20% FBS.
  9. Przygotować lejki filtrujące z nylonowych sit o rozmiarach oczek 100, 30 i 15 mikronów i umieścić je na sterylnych zlewkach o pojemności 150 ml.
  10. Dodać homogenat komórkowy z kroku 2.8 i sekwencyjnie przefiltrować przez sita 100, 30 i 15 mikronów.
  11. Zebrać skupione komórki niefiltrowane z sit 30- i 15-mikronowych po kilku płukaniach medium DMEM z dodatkiem 10% FBS, aby ułatwić filtrację komórek nieepithelialnych.
  12. Odrzucić filtrat z sita 15-mikronowego, który zawiera głównie fibroblasty.
  13. Dalsze oczyszczanie komórek typu II poprzez inkubację komórek z kroku 2.11 w kolbach 75 cm2 przez 30 min (około 10 ml zawiesiny komórkowej na kolbę).
  14. Zebrać nadosad i odwirować przy 1 300 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
  15. Ostrożnie usunąć nadosad przez aspirację i resuspender osad zawierający komórki w bezzsrótkowym medium DMEM. Objętość resuspensji zależy od ilości przetworzonej tkanki. Przesiewamy równowartość komórek uzyskanych z jednego płodu do każdej studni (2 ml), aby następnego dnia uzyskać konfluencję na poziomie 60-70%.
  16. Wysiać zawiesinę komórkową na płytki Bioflex z sześcioma studniami, uprzednio pokryte lamininą lub fibronektyną.

3. Izolacja fibroblastów płuc płodu gryzonia

  1. Należy postępować zgodnie z opisanymi powyżej krokami izolacji komórek typu II aż do punktu 2.11.
  2. Przenieść filtrat z siatki 15 µm (bez uprzedniego płukania; przybliżona objętość wynosi 10-15 ml) na naczynia o powierzchni 75 cm2 i inkubować w temperaturze 37°C przez 30-60 min, aby umożliwić adhezję fibroblastów.
  3. Odessać supernatant, zastąpić go pożywką DMEM bez surowicy i inkubować przez noc.
  4. Następnego dnia zebrać komórki za pomocą 0,25% (w/v) trypsyny w 0,4 mM EDTA i wysiać je na płytki Bioflex pokryte uprzednio fibronektyną.

4. System eksperymentalny do stymulacji mechanicznej komórek płuc

  1. Wysiać komórki (około 50% konfluencji) na płytki hodowlane Bioflex w bezserowym medium DMEM (2 ml/dołek) i pozostawić do przyczepienia i rozprzestrzenienia się na co najmniej 6 h przed rozpoczęciem doświadczeń. Zazwyczaj w naszym laboratorium komórki utrzymuje się w hodowli przez około 24 h przed zastosowaniem naprężenia mechanicznego. Jeśli do doświadczeń wymagana jest określona liczba komórek, po izolacji komórki typu II utrzymuje się w kolbach 75-cm2 z bezserowym medium DMEM, a następnego dnia komórki są trypsynizowane, liczone, a następnie wysiewane.
  2. Następnego dnia medium zastępuje się świeżym bezserowym DMEM (2 ml/dołek), a płytki Bioflex montuje się w urządzeniu do naprężania Flexcell FX-5000 Strain Unit. Monowarstwy przed rozpoczęciem doświadczeń nie powinny przekraczać 80% konfluencji.
  3. Do membran przyłożone zostaje naprężenie równoosiowe. Schemat naprężenia jest różny w zależności od symulowanych sił mechanicznych in vivo (patrz dyskusja).
  4. Jako kontrolę stosuje się komórki hodowane równolegle na membranach nierozciągniętych.
  5. Po zakończeniu doświadczeń monowarstwy można poddać analizie w celu zbadania zmian w ekspresji genów (na przykład białka surfaktantu C) za pomocą real-time PCR, ilości białek za pomocą Western blot itp. Monowarstwy można również utrwalić do badań immunocytochemicznych. W tej technice, po utrwaleniu, membrany silastyczne są wycinane z płytek i montowane na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu 10-20 μl wody jako środka montującego, przed permeabilizacją i inkubacją z przeciwciałami. Nadpłyn może być również wykorzystany do badania obecności czynników wzrostu, cytokin itp.

5. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 i Rycina 2 przedstawiają reprezentatywne zdjęcia w kontraście fazowym komórek typu II z płodu myszy w 18. dniu embrionalnym (E18), wyizolowanych przy użyciu techniki opisanej w niniejszym manuskrypcie.

Rysunek 3 wykazuje, że naprężenie mechaniczne indukuje różnicowanie płodowych komórek nabłonkowych typu II, przy zastosowaniu białka surfaktantu C jako markera.

Obraz mikroskopowy proliferacji komórkowej przedstawiający tworzenie kolonii w analizie hodowli tkankowej.
Rysunek 1. Reprezentatywna fotografia w kontraście fazowym wykonana bezpośrednio po izolacji, przedstawiająca skupioną strukturę komórek typu II płodu.

Wzrost komórek pod mikroskopem, obraz mikroskopowy, hodowla komórkowa, badanie biologiczne, analiza komórkowa.
Rysunek 2. Komórki nabłonka typu II płodu E18 zostały wyizolowane zgodnie z opisem i wysiane na płytki bioflex pokryte lamininą. Zdjęcie wykonano następnego dnia, po utrwaleniu nienapiętych komórek w paraformaldehydzie. Czystość komórek określono na 90 ± 5% na podstawie analizy mikroskopowej morfologii komórek nabłonka oraz immunobarwienia na SP-C.

Analiza ekspresji białka, ekspresja mRNA SP-C, wykres słupkowy, obrazy mikroskopowe, kontrola vs. rozciąganie.
Rysunek 3. Płodowe komórki nabłonkowe typu II poddano 5% cyklicznemu odkształceniu przy 40 cyklach/min przez 16h. A) Northern blot ekspresji mRNA białka surfaktantu C (SP-C), wykazujący, że odkształcenie indukuje różnicowanie komórek typu II na różnych podłożach ECM. Znaki +/- oznaczają odpowiednio ekspozycję lub brak ekspozycji na odkształcenie. Dane przedstawiono jako średnia +/- SEM, n=3; * P<0.05. B) Obrazy fluorescencyjnej immunocytochemii obrazujące poziomy białka SP-C (kolor zielony) w płodowych komórkach typu II poddanych lub nie (kontrola) odkształceniu mechanicznemu. Jądra komórkowe wybarwiono dapi (kolor niebieski). Pasek skali, 10 μm. C) Wyniki Western blot z trzech eksperymentów wykazujące, że rozciąganie mechaniczne zwiększa poziom białka SP-C. N=3; * P<0.05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji płodowych komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów, a także poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu aparatu Flexcell Strain Apparatus. Technika ta została przez nas wykorzystana do oceny różnicowania komórek nabłonkowych 1,2 oraz do badania receptorów i szlaków sygnalizacyjnych aktywowanych przez rozciąganie 3-9. Ponadto metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowych indukowanych urazem mechanicznym 10,11....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wspierane przez grant NIH HD052670.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMSigma-AldrichD5648
HEPESSigma-AldrichH3375
Kolagenaza 1Sigma-AldrichC0130
Kolagenaza 1ASigma-AldrichC9891
Surowica kurczęcaSigma-AldrichC5405
Sitka do przesiewaniaSigma-AldrichCD1-1KT
Filtry strzykawkoweFisher Scientific09-754-25
Siatka nylonowa 100 micronSmall Parts, Inc.CMN-100-D
Siatka 30 micronSmall Parts, Inc.CMN-30-D
Siatka 15 micronDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX15
LamininaSigma-AldrichL2020
Kolagen-1Collagen BiomedPC0701
FibrynektynaSigma-AldrichF1141
WitronektynaSigma-AldrichV-0132
ElastynaSigma-AldrichE-6402
Płyta BioflexFlexcell InternationalBF-3001UNiepowlekana
Urządzenie do rozciągania FlexcellFlexcell InternationalFX-5000

Bibliografia

  1. Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
  2. Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
  3. Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
  4. Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
  5. Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
  6. Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
  7. Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
  8. Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
  9. Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
  10. Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
  11. Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
  12. Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
  13. Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
  14. Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

odkszta cenie mechanicznekom rki typu IIizolacja fibroblast wsystem do odkszta ce mechanicznych Flexcellpowlekanie ECMPCR w czasie rzeczywistymWestern blotimmunochemia fluorescencyjnar nicowanie kom rek

Powiązane artykuły