Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova ^1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Streszczenie

Ocena sposobów naprawy szkieletu jest niezbędna do opracowania terapii stosowanych klinicznie w leczeniu złamań. Stabilność mechaniczna odgrywa istotną rolę w gojeniu urazów kości. W najgorszym scenariuszu niestabilność mechaniczna może prowadzić u ludzi do opóźnionego zrostu lub braku zrostu. Z drugiej strony, ruch może również stymulować proces gojenia. W złamaniach, w których występuje ruch, tworzy się chrząstka stabilizująca końce złamanej kości, a chrząstka ta jest stopniowo zastępowana przez kość poprzez powtórzenie procesu rozwojowego kostnienia chrzęstnego. W przeciwieństwie do tego, jeśli złamanie kości jest sztywno stabilizowane, kość tworzy się bezpośrednio poprzez kostnienie błoniaste. Klinicznie kostnienie chrzęstne i błoniaste zachodzą jednocześnie. Aby skutecznie odtworzyć ten proces, badacze wprowadzają pin do kanału szpikowego złamanej kości zgodnie z opisem Bonnarensa⁴. Ta metoda eksperymentalna zapewnia doskonałą stabilność boczną, jednocześnie dopuszczając utrzymywanie się niestabilności rotacyjnej. Jednakże nasze zrozumienie mechanizmów regulujących te dwa odrębne procesy może zostać poszerzone poprzez eksperymentalną izolację każdego z nich. Opracowaliśmy protokół stabilizacji, który zapewnia stabilizację rotacyjną i boczną. W tym modelu jedynym obserwowanym sposobem gojenia jest kostnienie błoniaste, a parametry gojenia można porównywać pomiędzy różnymi szczepami myszy modyfikowanych genetycznie ^5-7, po zastosowaniu cząsteczek bioaktywnych ^8,9, po zmianie parametrów fizjologicznych gojenia ¹⁰, po modyfikacji czasu lub stopnia stabilizacji ¹¹, po osteogenezie dystrakcyjnej ¹², po wywołaniu braku zrostu ¹³ lub po stworzeniu defektu o rozmiarze krytycznym. W niniejszej pracy ilustrujemy, jak stosować zmodyfikowane stabilizatory Ilizarova do badania gojenia złamań kości piszczelowej oraz osteogenezy dystrakcyjnej u myszy.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) UCSF i są zgodne z wytycznymi krajowymi.

1. Przygotowanie utrwalaczy przed operacją

1. Przed stworzeniem stabilnego złamania należy złożyć specjalnie zaprojektowane urządzenie do stabilizacji zewnętrznej. Specjalnie zaprojektowane ramy stabilizatora zewnętrznego składały się z dwóch aluminiowych pierścieni stabilizowanych trzema prętami gwintowanymi ze stali nierdzewnej #0/56, 8 sześciokątnych nakrętek #2/56 oraz 17 pasujących śrub (Small Part Inc., Miami Lakes, FL³).
2. Na każde złamanie potrzebne są dwa aluminiowe pierścienie. Do jednego pierścienia należy zamontować 4 sześciokątne nakrętki #2/56 (Small Part Inc., Miami Lakes, FL) i pasujące śruby w odpowiednich otworach; powinny one pozostać luźne. Będzie to pierścień proksymalny. Do pierścienia dystalnego należy zamontować 3 nakrętki i śruby, ponownie nie dokręcając ich całkowicie.

2. Znieczulenie, wywołanie złamania i aplikacja stabilizatora

1. Myszy (wiek, płeć i masa ciała są określane przez użytkownika) poddaje się znieczuleniu poprzez domięśniowy zastrzyk z ketaminą 50mg/ml i medetomidyną 0,5 mg/ml (0,03 ml/mysz).
2. Należy zastosować lubrykant do oczu myszy i przykleić kawałek taśmy przez ich głowy, aby chronić oczy podczas procedury.
3. Zwierzę jest umieszczane na podkładce grzewczej przez pozostały czas trwania procedury.
4. Należy ustabilizować proksymalne i dystalne nasady lewej kości piszczelowej, używając czterech sterylnych szpilek entomologicznych 0,25 mm (Anticorro: Fine Science Tool, Foster City, CA), mocując szpilki do narzędzia Dremel i nawiercając nimi kość.
5. Szpilki są orientowane prostopadle do długiej osi kości piszczelowej oraz pod kątem 90 ° względem siebie. Odległość między szpilkami proksymalnymi a dystalnymi powinna wynosić co najmniej 10 mm.
6. Należy umieścić pierwszy pierścień powyżej szpilek proksymalnych, tak aby nakrętki były skierowane do wewnątrz, w stronę szpilek. Należy przymocować szpilki do pierścienia, utrzymując kość piszczelową w centralnej pozycji wewnątrz aluminiowego pierścienia.
7. Należy umieścić drugi pierścień poniżej szpilek dystalnych i przymocować szpilki do pierścienia za pomocą nakrętek sześciokątnych, analogicznie jak wcześniej. Do stabilizatora dystalnego należy dodać czwarty zestaw śruby i nakrętki.
8. Złamanie poprzeczne wywołuje się poprzez zginanie trójpunktowe przy użyciu odpowiedniego urządzenia. Stosujemy system grawitacyjny Bonnarensa i Einhorna ⁴. Należy oprzeć tylno-boczną powierzchnię kości piszczelowej na blokach, podnieść obciążnik na określoną wysokość wzdłuż ramienia opadającego i zwolnić obciążnik tak, aby uderzył on w przednio-boczną stronę kości piszczelowej, powodując tępe złamanie. Wysokość, z której zrzucany jest obciążnik, musi zostać ustalona dla każdego szczepu myszy, aby zapewnić pojedyncze złamanie wyłącznie kości piszczelowej.
9. Złamanie potwierdza się za pomocą RTG.
10. Po potwierdzeniu złamania do pierścieni mocuje się trzy gwintowane pręty ze stali nierdzewnej #0/56. Zaczynając od końca dystalnego, należy wsunąć pręt i nakręcić nakrętkę na pierścień dystalny, aby zabezpieczyć pręt. Następnie należy nałożyć kolejną nakrętkę na pręt; pierścień proksymalny zostanie umieszczony na tej nakrętce. Należy upewnić się, że dwa pierścienie są utrzymywane w równych odstępach i nie napierają na szpilki. Pierścień proksymalny mocuje się do prętów za pomocą trzeciej nakrętki.
11. Bezpośrednio po operacji podaje się podskórne zastrzyki z buprenorfiną (1,0 mg/kg) w celu przeciwbólowym; zwierzęta są monitorowane pod kątem bólu i otrzymują buprenorfinę w razie potrzeby.
12. Znieczulenie odwraca się poprzez podanie atipamezolu; zwierzęta są monitorowane do momentu odzyskania reaktywności i zdolności do poruszania się.

3. Osteogeneza dystrakcyjna (patrz również: ^12,13)

Modyfikacja tej procedury w celu dostosowania jej do osteogenezy dystrakcyjnej jest prosta. Pierścienie są utrzymywane w pozycji za pomocą prętów gwintowanych, a poprzez obracanie nakrętek mocujących pręty można oddalać pierścienie od siebie.

1. Okres latencji: W przypadku standardowej osteogenezy dystrakcyjnej z wykorzystaniem tego modelu, stabilizatory są mocowane do kości piszczelowej i pozostawiane bez ingerencji na okres latencji trwający 5 dni.
2. Dystrakcja: Osteogenezę dystrakcyjną przeprowadza się poprzez obracanie nakrętek na prętach stabilizujących o ¼ obrotu (0,25 mm) każdego dnia przez 7 dni.
3. Dojrzewanie: Mostkowanie kostne obserwuje się do 10. dnia, a pełne zrostowanie stwierdza się do 27. dnia po zakończeniu dystrakcji.

4. Wykonanie defektu o rozmiarze krytycznym

Aby stworzyć ubytek o rozmiarze krytycznym, zastosowano stabilizatory zewnętrzne zgodnie z wcześniejszym opisem, wprowadzając następujące modyfikacje.

1. Przed rozpoczęciem procedury skórę oczyszcza się 70 % etanolem.
2. Fiksatory aplikuje się w całości przed utworzeniem defektu.
3. Myszy umieszcza się następnie pod mikroskopem stereoskopowym w celu zwizualizowania przyśrodkowej części piszczeli i wykonuje nacięcie (5-7 mm) za pomocą skalpela z ostrzem nr 10.
4. Mięsień jest delikatnie przecinany i rozsuwany, aby odsłonić środek trzonu kości piszczelowej.
5. Następnie z połowy trzonu usuwa się fragment kości o długości 3 mm za pomocą nożyczek. Wykorzystując końcówkę nożyczek, powoli wycina się kość, a fragmenty kostne usuwa się pęsetą, jeśli jest to konieczne. Należy uważać podczas operowania końcówkami nożyczek, aby uniknąć przemieszczenia piszczeli pod wpływem dużej siły mechanicznej.
6. Należy sprawdzić miejsce operacyjne, aby upewnić się, że nie pozostały w nim fragmenty kostne, ponieważ mogłyby one przyspieszyć gojenie.
7. Mięsień należy rozprowadzić wokół stępionych końców piszczeli.
8. Nacięcie skóry zamyka się za pomocą 2-3 szwów z monofilamentu poliaminowego 6-0.
9. Działa anestezji zostają zniesione, a zwierzęta są monitorowane pod kątem bólu i otrzymują leki przeciwbólowe zgodnie z wcześniejszym opisem.

5. Reprezentatywne wyniki

Prawidłowo zastosowane stabilizatory zewnętrzne zapewniają większą sztywność stabilizacji zamkniętego złamania kości piszczelowej z doskonałym repozycjonowaniem (Rys. 1, 2). Jednak w niektórych przypadkach występuje niewystarczające repozycjonowanie (wyraźna i duża szczelina między końcami kości lub liczne złamania (Rys. 3)), a takie myszy są wykluczane z analiz. Złamania stabilizowane tą metodą goją się głównie poprzez kostnienie błonowe (Rys. 4). W przeciwieństwie do tego, jeśli złamanie nie zostanie ustabilizowane, w szczelinie złamania tworzy się duży kostnina chrzęstna (Rys. 5), która następnie zostaje zastąpiona kością w procesie kostnienia błonowego.

Rycina 1. Radiografie przedstawiające zewnętrzny stabilizator kostny użyty do stabilizacji złamania kości piszczelowej. Radiografia wykonana po złamaniu, wykazująca dobrze wyrównane fragmenty kości (grot strzałki).

Rycina 2. Obraz myszy po zastosowaniu utrwalacza.

Rycina 3. Radiogram wykonany po złamaniu pokazuje przemieszczone i pofragmentowane odłamki kostne (grot strzałki).

Rysunek 4. Stabilizowane złamanie goi się poprzez kostnienie błoniaste. Barwienie trichromem stabilizowanego złamania wykazuje obecność nowej kości (b) w miejscu złamania. Pasek skali = 500 μm.

Rysunek 5. Nieustabilizowane złamanie goi się poprzez kostnienie chondralne. Barwienie trichromowe nieustabilizowanego złamania wykazuje obecność chrząstki (c) i kości (b) w miejscu złamania. Pasek skali = 500 μm.

Dyskusja

Kości goją się na dwa różne sposoby, w zależności od stabilności mechanicznej (przegląd w: ¹⁴). W przypadku braku stabilności w szczelinie złamania tworzy się duży szablon chrzestny, który zostaje zastąpiony przez kość, aby połączyć oba końce złamanej kości. Proksymalnie i dystalnie względem złamania kość powstaje bezpośrednio poprzez kostnienie błonowe w obrębie okostnej i błony wewnętrznej kości. Z kolei w przypadku złamań stabilnych gojenie zachodzi wyłącznie poprzez kostnienie błonowe ³. Jednak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szpilka entomologiczna 0,25 mm	Fine Science Tools	26000-25	Stal czerniona anodowana, średnica pręta 0,25 mm, długość 4 cm
Sześciokątna nakrętka ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	#2-56	Długość 1/8", 56 gwintów na cal
Sześciokątna nakrętka ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	#0-80	Długość 1/8", 80 gwintów na cal
Śruba maszynowa ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	#0-80	Długość 1/8", 80 gwintów na cal
Gwintowany pręt maszynowy ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	#0-80	Długość 6", 80 gwintów na cal
Śruba maszynowa z łbem ze stali nierdzewnej 18-8	McMaster-Carr		Gwint 2-56, długość 3/6"
Urządzenie do stabilizacji zewnętrznej	Warsztat mechaniczny	Projekt własny