Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena sposobów naprawy szkieletu jest niezbędna do opracowania terapii stosowanych klinicznie w leczeniu złamań. Stabilność mechaniczna odgrywa istotną rolę w gojeniu urazów kości. W najgorszym scenariuszu niestabilność mechaniczna może prowadzić u ludzi do opóźnionego zrostu lub braku zrostu. Z drugiej strony, ruch może również stymulować proces gojenia. W złamaniach, w których występuje ruch, tworzy się chrząstka stabilizująca końce złamanej kości, a chrząstka ta jest stopniowo zastępowana przez kość poprzez powtórzenie procesu rozwojowego kostnienia chrzęstnego. W przeciwieństwie do tego, jeśli złamanie kości jest sztywno stabilizowane, kość tworzy się bezpośrednio poprzez kostnienie błoniaste. Klinicznie kostnienie chrzęstne i błoniaste zachodzą jednocześnie. Aby skutecznie odtworzyć ten proces, badacze wprowadzają pin do kanału szpikowego złamanej kości zgodnie z opisem Bonnarensa4. Ta metoda eksperymentalna zapewnia doskonałą stabilność boczną, jednocześnie dopuszczając utrzymywanie się niestabilności rotacyjnej. Jednakże nasze zrozumienie mechanizmów regulujących te dwa odrębne procesy może zostać poszerzone poprzez eksperymentalną izolację każdego z nich. Opracowaliśmy protokół stabilizacji, który zapewnia stabilizację rotacyjną i boczną. W tym modelu jedynym obserwowanym sposobem gojenia jest kostnienie błoniaste, a parametry gojenia można porównywać pomiędzy różnymi szczepami myszy modyfikowanych genetycznie 5-7, po zastosowaniu cząsteczek bioaktywnych 8,9, po zmianie parametrów fizjologicznych gojenia 10, po modyfikacji czasu lub stopnia stabilizacji 11, po osteogenezie dystrakcyjnej 12, po wywołaniu braku zrostu 13 lub po stworzeniu defektu o rozmiarze krytycznym. W niniejszej pracy ilustrujemy, jak stosować zmodyfikowane stabilizatory Ilizarova do badania gojenia złamań kości piszczelowej oraz osteogenezy dystrakcyjnej u myszy.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) UCSF i są zgodne z wytycznymi krajowymi.
1. Przygotowanie utrwalaczy przed operacją
- Przed utworzeniem stabilnego złamania należy zmontować specjalnie zaprojektowane urządzenie do stabilizacji zewnętrznej. Specjalnie zaprojektowane ramy do stabilizacji zewnętrznej składały się z dwóch aluminiowych pierścieni stabilizowanych za pomocą trzech gwintowanych prętów ze stali nierdzewnej #0/56, 8 sześciokątnych nakrętek #2/56 oraz 17 pasujących śrub (Small Part Inc., Miami Lakes, FL3).
- Na każde złamanie potrzebne są dwa aluminiowe pierścienie. Do jednego pierścienia należy włożyć w odpowiednie otwory 4 sześciokątne nakrętki #2/56 (Small Part Inc., Miami Lakes, FL) oraz pasujące śruby; nie należy ich dokręcać. Będzie to pierścień proksymalny. Do pierścienia dystalnego należy zamocować 3 nakrętki i śruby, również bez pełnego dokręcania.
2. Znieczulenie, tworzenie złamania i aplikacja stabilizatora
- Myszy (wiek, płeć i masa ciała są określane przez użytkownika) są znieczulane poprzez dostrychalne wstrzyknięcie 50 mg/ml ketaminy oraz 0,5 mg/ml medetomidyny (0,03 ml/mysz).
- Należy zaaplikować lubrykant do oczu myszy i przykleić kawałek taśmy w poprzek głowy, aby chronić oczy podczas procedury.
- Zwierzę jest umieszczane na podkładce grzewczej przez resztę procedury.
- Następuje transfixacja proksymalnych i dystalnych metafiz lewej kości piszczelowej za pomocą czterech sterylnych szpilek entomologicznych 0,25 mm (Anticorro: Fine Science Tool, Foster City, CA), mocując szpilki do narzędzia Dremel i wiercąc nimi przez kość.
- Szpilki są zorientowane prostopadle do długiej osi kości piszczelowej oraz pod kątem 90° względem siebie. Odległość między szpilkami proksymalnymi a dystalnymi musi wynosić co najmniej 10 mm.
- Pierwszy pierścień należy ustawić nad szpilkami proksymalnymi, tak aby nakrętki były skierowane do wewnątrz, w stronę szpilek. Należy przymocować szpilki do pierścienia, utrzymując kość piszczelową centralnie wewnątrz aluminiowego pierścienia.
- Drugi pierścień należy ustawić poniżej szpilek dystalnych i przymocować szpilki do pierścienia za pomocą nakrętek sześciokątnych, analogicznie jak poprzednio. Do stabilizatora dystalnego należy dodać czwarty zestaw śruba-nakrętka.
- Złamanie poprzeczne wywołuje się poprzez zginanie trójpunktowe przy użyciu odpowiedniego urządzenia. Stosujemy system grawitacyjny Bonnarensa i Einhorna 4. Powierzchnię tylno-boczną kości piszczelowej opiera się na blokach, podnosi obciążenie na określoną wysokość wzdłuż ramienia zrzutowego, a następnie upuszcza obciążenie tak, aby uderzyło w powierzchnię przednio-boczną kości piszczelowej, powodując złamanie stępne. Wysokość, z której upuszczane jest obciążenie, musi zostać ustalona dla każdego szczepu myszy, aby zapewnić pojedyncze złamanie wyłącznie kości piszczelowej.
- Złamanie jest potwierdzane za pomocą RTG.
- Po potwierdzeniu złamania do pierścieni mocuje się trzy gwintowane pręty ze stali nierdzewnej #0/56. Zaczynając od końca dystalnego, należy wsunąć pręt i nakręcić nakrętkę na pierścień dystalny, aby go zabezpieczyć. Następnie na pręt nakłada się kolejną nakrętkę, na której spocznie pierścień proksymalny. Należy upewnić się, że oba pierścienie są utrzymane w równych odległościach i nie naprężają szpilek. Pierścień proksymalny mocuje się do prętów trzecią nakrętką.
- Bezpośrednio po operacji podaje się podskórne zastrzyki buprenorfiny (1,0 mg/kg) w celu analgezji; zwierzęta są monitorowane pod kątem bólu i w razie potrzeby otrzymują buprenorfinę.
- Znieczulenie jest odwracane poprzez podanie atipamezolu, a zwierzęta są monitorowane do czasu odzyskania reaktywności i zdolności do poruszania się.
3. Osteogeneza dystrakcyjna (patrz również: 12,13)
Modyfikacja tej procedury w celu umożliwienia osteogenezy dystrakcyjnej jest prosta. Pierścienie są utrzymywane w pozycji przez pręty gwintowane, a poprzez obracanie nakrętek mocujących pręty można je od siebie oddalić.
- Okres utajenia: W przypadku standardowej dystrakcyjnej osteogenezy z wykorzystaniem tego modelu, stabilizatory są mocowane do kości piszczelowej i pozostawiane bez ingerencji na okres utajenia wynoszący 5 dni.
- Dystrakcja: Dystrakcyjną osteogenezę można przeprowadzić, obracając nakrętki na prętach stabilizujących o ¼ obrotu (0.25 mm) każdego dnia przez 7 dni.
- Dojrzewanie: Mostkowanie kostne obserwuje się do 10. dnia, a pełną konsolidację do 27. dnia po zakończeniu dystrakcji.
4. Wykonanie defektu o rozmiarze krytycznym
W celu stworzenia defektu o rozmiarze krytycznym zastosowano stabilizatory zewnętrzne zgodnie z wcześniejszym opisem, z następującymi modyfikacjami.
- Przed rozpoczęciem procedury skórę oczyszcza się 70 % etanolem.
- Fiksatory nanosi się w całości przed utworzeniem defektu.
- Myszy umieszcza się następnie pod mikroskopem stereoskopowym w celu wizualizacji przyśrodkowej części kości piszczelowej, a następnie wykonuje się nacięcie (5-7 mm) za pomocą skalpela z ostrzem nr 10.
- Mięsień jest delikatnie przecinany i rozsuwany, aby odsłonić część środkową trzonu kości piszczelowej.
- Następnie za pomocą nożyczek usuwa się odcinek kości o długości 3 mm z części środkowej trzonu. Wykorzystując końcówkę nożyczek, powoli odcina się kość, a fragmenty kostne usuwa się pęsetą, jeśli jest to konieczne. Należy zachować ostrożność przy użyciu końcówek nożyczek, aby uniknąć przemieszczenia kości piszczelowej pod wpływem dużej siły mechanicznej.
- Należy sprawdzić miejsce operowane, aby upewnić się, że nie pozostały w nim fragmenty kostne, ponieważ mogłyby one wspomagać gojenie.
- Mięśnie należy ułożyć z powrotem wokół stępionych końców kości piszczelowej.
- Nacięcie skóry zamyka się 2-3 szwami z monofilamentu poliamidowego 6-0.
- Odwraca się działanie znieczulenia, monitoruje zwierzęta pod kątem występowania bólu i podaje leki przeciwbólowe zgodnie z wcześniejszym opisem.
5. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym zastosowaniu stabilizatory zewnętrzne zapewniają sztywniejszą stabilizację zamkniętego złamania kości piszczelowej z doskonałym repozycjonowaniem (Rys. 1, 2). Jednak w niektórych przypadkach występuje niewystarczające repozycjonowanie (wyraźna i duża szczelina między końcami kości lub wieloodłamowe złamania (Rys. 3)) i takie myszy są wykluczane z analiz. Złamania stabilizowane tą metodą goją się głównie poprzez kostnienie błonowe (Rys. 4). W przeciwieństwie do tego, jeśli złamanie nie zostanie ustabilizowane, w szczelinie złamania tworzy się duży kostnina chrzęstna (Rys. 5), która jest zastępowana przez kość w procesie kostnienia błonowego.
Rysunek 1. Radiogramy przedstawiające zewnętrzny stabilizator stosowany do stabilizacji złamania kości piszczelowej. Radiogram wykonany po złamaniu wykazujący dobrze wyrównane fragmenty kości (grot strzałki).
Rysunek 2. Zdjęcie myszy po zastosowaniu stabilizatora.
Rycina 3. Radiogram wykonany po złamaniu pokazuje przesunięte i pofragmentowane segmenty kostne (grot strzałki).
Rycina 4. Stabilizowane złamanie goi się poprzez kostnienie błonowe. Barwienie trichromem stabilizowanego złamania wykazuje obecność nowej kości (b) w miejscu złamania. Pasek skali = 500 μm.
Rycina 5. Niestabilne złamanie goi się poprzez kostnienie endochondralne. Barwienie trichromowe niestabilnego złamania wykazuje obecność chrząstki (c) i kości (b) w miejscu złamania. Pasek skali = 500 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kości goją się na dwa różne sposoby, w zależności od stabilności mechanicznej (przegląd w: 14). W przypadku braku stabilności w szczelinie złamania tworzy się duży szablon chrzestny, który zostaje zastąpiony przez kość, aby połączyć oba końce złamanej kości. Proksymalnie i dystalnie względem złamania kość powstaje bezpośrednio poprzez kostnienie błonowe w obrębie okostnej i błony wewnętrznej kości. Z kolei w przypadku złamań stabilnych gojenie zachodzi wyłącznie poprzez kostnienie błonowe 3. Jednak ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu R01-AR053645 przyznanego przez NIAMS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szpilka entomologiczna 0,25 mm | Fine Science Tools | 26000-25 | Stal czerniona anodowana, średnica pręta 0,25 mm, długość 4 cm |
| Sześciokątna nakrętka ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | #2-56 | Długość 1/8", 56 gwintów na cal |
| Sześciokątna nakrętka ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | #0-80 | Długość 1/8", 80 gwintów na cal |
| Śruba maszynowa ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | #0-80 | Długość 1/8", 80 gwintów na cal |
| Gwintowany pręt maszynowy ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | #0-80 | Długość 6", 80 gwintów na cal |
| Śruba maszynowa z łbem ze stali nierdzewnej 18-8 | McMaster-Carr | Gwint 2-56, długość 3/6" | |
| Urządzenie do stabilizacji zewnętrznej | Warsztat mechaniczny | Projekt własny |
Bibliografia
- Ilizarov, G. A., Lediaev, V. I., Shitin, V. P. The course of compact bone reparative regeneration in distraction osteosynthesis under different conditions of bone fragment fixation (experimental study). Eksperimentalnaia Khirurgiia i Anesteziologiia. 14, 3-12 (1969).
- Ilizarov, G. A., Deviatov, A. A. Surgical elongation of the leg. Ortopediia Travmatologiia i Protezirovanie. 32, (1971).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J. Orthop. Res. 20, 1091-1098 (2002).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal. J. Orthop. Res. 2, 97-101 (1984).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Lange, J. Action of IL-1beta during fracture healing. J. Orthop. Res. 28, 778-784 (2010).
- Xing, Z. Multiple roles for CCR2 during fracture healing. Dis. Model Mech. 3, 451-458 (2010).
- Lu, C. Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment. J. Orthop. Res. , (2009).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Lu, C., Colnot, C. Bone morphogenetic protein 2 stimulates endochondral ossification by regulating periosteal cell fate during bone repair. Bone. 47, 65-73 (2010).
- Lu, C., Miclau, T., Hu, D., Marcucio, R. S. Ischemia leads to delayed union during fracture healing: a mouse model. J. Orthop. Res. 25, 51-61 (2007).
- Miclau, T. Effects of delayed stabilization on fracture healing. J. Orthop. Res. 25, 1552-1558 (2007).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16, 636-642 (1998).
- Choi, P., Ogilvie, C., Thompson, Z., Miclau, T., Helms, J. A. Cellular and molecular characterization of a murine non-union model. J. Orthop. Res. 22, 1100-1107 (2004).
- Buckwalter, J. A., Marsh, E. T., J, L. Rockwood and Green's fractures in adults. Heckman, J. D., Bucholz, R. W. , Lippincott Williams & Wilkins. 245-271 (2001).
- Garcia, P. The LockingMouseNail-A New Implant for Standardized Stable Osteosynthesis in Mice. J. Surg. Res. , (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
