Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Podsumowanie

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu^1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Streszczenie

Rozszczelnienie bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionej wiązki ultradźwięków (FUS) jest coraz częściej badaną techniką obchodzenia BBB^1-5. BBB stanowi istotną przeszkodę w farmakologicznym leczeniu schorzeń mózgu, ponieważ ogranicza przenikanie cząsteczek z naczyń krwionośnych do tkanki mózgowej do cząsteczek o masie mniejszej niż około 500 Da⁶. Indukowane przez FUS rozszczelnienie BBB (BBBD) jest tymczasowe i odwracalne⁴ oraz posiada przewagę nad chemicznymi metodami indukcji BBBD dzięki wysokiej lokalizacji działania. BBBD indukowane przez FUS umożliwia badanie wpływu szerokiego zakresu środków terapeutycznych na mózg, których w przeciwnym razie nie udałoby się dostarczyć do tkanki w wystarczającym stężeniu. Choć wiele parametrów ultradźwięków okazało się skutecznych w rozszczelnianiu BBB^2,5,7, w procedurze eksperymentalnej istnieje kilka krytycznych etapów zapewniających skuteczne rozszczelnienie przy precyzyjnym celowaniu. Niniejszy protokół opisuje sposób realizacji BBBD indukowanego przez FUS pod kontrolą MRI w modelu szczura, ze szczególnym uwzględnieniem krytycznych etapów przygotowania zwierzęcia oraz obchodzenia się z mikropęcherzykami w trakcie eksperymentu.

Protokół

1. Konfiguracja USG i MRI

W badaniu tym wykorzystano kompatybilny z MRI trójosiowy system skupionego ultradźwięków (FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Kanada). Zastosowano dwa różne przetworniki ultradźwiękowe: skonstruowany wewnętrznie przetwornik sferycznie skupiony o częstotliwości 551,5 kHz (promień krzywizny = 60 mm, średnica zewnętrzna = 75 mm, średnica wewnętrzna = 20 mm) oraz macierz 8-sektorową o częstotliwości 1,503 MHz z zintegrowanym hydrofonem PZT (Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, Francja), sterowaną jako pojedynczy element przetwornika sferycznie skupionego (FN = 0,8, apertura = 10 cm). Do rejestracji emisji akustycznych podczas korzystania z przetwornika 551,5 kHz użyto kompatybilnego z MRI odbiornika PVDF⁸. W przypadku zastosowania innego sprzętu sugeruje się następujące rozwiązania:

1. Wybierz odpowiedni, skalibrowany przetwornik ultradźwiękowy o częstotliwości centralnej w zakresie 0,25 MHz - 1,5 MHz i aperturze f-number (promień krzywizny/apertura) równej 1 lub mniejszej.
2. Umieść kąpiel wodną wypełnioną ciepłą, odgazowaną wodą dejonizowaną na stole urządzenia MRI o natężeniu pola 1,5 T lub 3 T. Kąpiel wodna powinna posiadać płytę górną, na której można umieścić zwierzęta. Zamontuj przetwornik ultradźwiękowy w zbiorniku na kompatybilnej z MRI trójosiowej platformie lub systemie pozycjonującym⁹, skierowany w stronę powierzchni wody.
3. Poprowadź kabel przetwornika do urządzenia sterującego ultradźwiękami poprzez panel przepustowy.
4. Wygeneruj sygnał sterujący przetwornikiem za pomocą generatora funkcji i wzmacniacza mocy. Użyj zewnętrznego obwodu dopasowującego, aby zminimalizować odbitą moc elektryczną.
5. Znając ogniskową przetwornika, ustaw ognisko przetwornika na powierzchni wody i poddaj powierzchnię wody sonikacji, aby wytworzyć widoczny fontannowy strumień wody. Kroki 1.6 i 1.7 opisują sposób rejestracji ogniska za pomocą wytworzonego strumienia wody. Bardziej precyzyjną metodę lokalizacji ogniska, polegającą na sonikacji żelu pochłaniającego ciepło i obrazowaniu wynikającego z tego wzrostu temperatury w ognisku za pomocą MRI, można znaleźć w⁹.
6. Oznacz miejsce ogniska za pomocą markera, który będzie widoczny na obrazach MR. Można to zrobić za pomocą płyty z otworem centralnym, który wypełni się wodą po umieszczeniu nad ogniskiem. Wypełniony wodą otwór będzie widoczny w MRI i dostarczy współrzędnych ogniska w dwóch płaszczyznach, natomiast współrzędną w kierunku osiowym przetwornika można określić na podstawie powierzchni wody.
7. Używając sekwencji lokalizacyjnej w trzech płaszczyznach, obrazuj marker ogniska i zarejestruj położenie ogniska w układzie współrzędnych MRI.
8. Aby monitorować emisje akustyczne, zamontuj w kąpieli wodnej skierowany na ognisko przetwornika hydrofon kompatybilny z MR⁸, który służy jako pasywny detektor kawitacji (PCD), lub użyj przetwornika z zintegrowanym hydrofonem.
9. Poprowadź kable PCD do karty oscyloskopowej, która jest wystarczająco szybka, aby rejestrować serie sygnałów o czasie trwania do 10 ms przy PRF do 2 Hz (np. ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada). Kable muszą być uziemione do panelu przepustowego lub ekranu RF w celu zminimalizowania szumów.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Znieczul zwierzęta za pomocą gazu izofluranowego. Ponieważ izofluran wpływa na rozszczelnienie bariery krew-mózg (BBB)¹⁰, zwierzęta należy odłączyć od gazu na 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Na początku znieczulenia nanieś maść lubrykującą do oczu do każdego oka, aby chronić rogówkę przed wysuszeniem lub innymi urazami.
2. Za pomocą golarki elektrycznej ogol sierść z górnej części głowy i szyi zwierzęcia, następnie usuń pozostałą sierść za pomocą kremu do depilacji (np. Nair, Church & Dwight Co., Princeton, NJ, USA) i opłucz skórę głowy łagodnym mydłem i wodą.
3. Przygotuj ogon, stosując środek do mycia skóry Betadine, a następnie przemyj go roztworem Bridine. Przeprowadź końcowe przetarcie alkoholem, aby uwidocznić żyłę ogonową.
4. Wprowadź do żyły ogonowej cewnik 22 G z trójdrożnym kurkiem i przepłucz go mieszaniną heparyny z solą fizjologiczną (33 U/mL), aby zapobiec tworzeniu się skrzepów w cewniku.
5. Podaj znieczulenia do wstrzykiwań (40-50 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny) drogą domięśniową i odłącz zwierzę od izofluranu.
6. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji na plecach w systemie pozycjonującym do USG, tak aby górna część głowy stykała się z kąpielą wodną przez otwór w górnej płycie (Ryc. 1). Na górną część głowy zwierzęcia można nanieść niewielką ilość żelu do USG, aby zminimalizować ryzyko powstania pęcherzyków powietrza.
7. Przymocuj nogi do systemu pozycjonującego taśmą. Głowę można utrzymać w miejscu za pomocą listwy do gryzienia, jeśli jest dostępna, lub taśmy mocno przyklejonej w poprzek brody.
8. Przykryj zwierzę ręcznikiem i kocem z krążącą wodą, aby utrzymać jego ciepłotę ciała.

3. Wybór celu

1. 
   Należy wykonać bazowe osiowe obrazy MR mózgu w obrazowaniu T₂-zależnym oraz T₁-zależnym. W przypadku użycia aparatu MRI 1,5 T i dedykowanej cewki powierzchniowej odbiorczej RF o rozmiarze dopasowanym do głowy, odpowiednie parametry skanowania mogą obejmować:
   
   obrazowanie T₂-zależne: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
   obrazowanie T₁-zależne: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms
   
2. Należy wybrać cel na skanach T₂-zależnych, unikając komór mózgowia oraz linii środkowej mózgu i wybierając głębokość w obrębie środkowej części mózgu.
3. Należy przesunąć ognisko przetwornika do lokalizacji celu.

4. Przygotowanie mikropęcherzyków

Mikropęcherzyki Definity (Lantheus Medical Imaging, MA, USA) są stosowane przez kilka grup badawczych w celu wywołania BBBD za pomocą FUS wspomaganego mikropęcherzykami^2,5,7. Odpowiednie dawki dla innych rodzajów mikropęcherzyków można znaleźć w literaturze^11,12.

1. Aktywować mikropęcherzyki Definity i powoli nabrać niewielką objętość do strzykawki 1 mL za pomocą igły o rozmiarze 18G.
2. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, delikatnie przesuwając tłok w przód i w tył. Nie opukiwać strzykawki, ponieważ może to doprowadzić do rozpadu pęcherzyków.
3. Rozcieńczyć Definity w soli fizjologicznej w stosunku 10:1 (sól fizjologiczna do Definity), powoli wstrzykując wymaganą objętość preparatu Definity do strzykawki z solą fizjologiczną. W przypadku podawania w formie infuzji, Definity można dodatkowo rozcieńczyć do 50:1 lub 100:1.
4. Delikatnie odwracać strzykawkę, aby dokładnie wymieszać Definity z solą fizjologiczną, aż do uzyskania jednorodnego wyglądu. Delikatne odwrócenie strzykawki bezpośrednio przed wstrzyknięciem może być również konieczne, jeśli pęcherzyki zaczęły wypływać z zawiesiny.
5. Obliczyć wymaganą objętość dawki w oparciu o 0,02 mL/kg Definity lub 0,2 mL/kg roztworu (przy rozcieńczeniu 10:1).

5. Podawanie ultradźwięków

1. Ustaw parametry sonikacji, stosując serie impulsów o niskim cyklu pracy, a nie sonikację falą ciągłą. Odpowiednie parametry sonikacji przy 0.5 MHz to ciśnienie in situ 0.23 MPa, impulsy 10 ms przy PRF 1 Hz oraz całkowity czas sonikacji 2 min. Przy 1.5 MHz odpowiednie ciśnienia in situ wynoszą około 0.45-0.5 MPa.

Odpowiednie ciśnienia przy różnych częstotliwościach można oszacować, przyjmując indeks mechaniczny wynoszący 0,46 ¹³.

2. Sprawdzić, czy głowa zwierzęcia jest nadal sprzężona z wodą.
3. Powoli wstrzyknąć mikropęcherzyki do cewnika w żyle ogonowej i przepłukać 0.5 mL soli fizjologicznej. Sonikację rozpocząć jednocześnie z początkiem wstrzykiwania.

6. Ocena efektów leczenia w badaniu MRI

1. Po sonikacji wstrzyknij do cewnika w żyle ogonowej środek kontrastowy do MRI (np. 0,2 ml/kg Omniscan, GE Healthcare), a następnie przepłucz go 0,5 mL soli fizjologicznej.
2. Wykonaj obrazowanie T₁-zależne aż do momentu przejścia szczytu kontrastowego. Miejsca sonikacji, które zostały pomyślnie rozszczelnione, wykażą silniejsze wzmocnienie niż tkanka otaczająca.
3. Wykonaj obrazowanie T₂-zależne w celu sprawdzenia obecności obrzęku. Wysoki sygnał w miejscach sonikacji świadczy o wystąpieniu obrzęku.

7. Reprezentatywne wyniki

Kontrastowe środki do MRI mogą być skutecznie dostarczane przez BBB przy użyciu skupionej wiązki ultradźwięków i krążących mikropęcherzyków. Rysunek 2 przedstawia typowe obrazy T₁-w przed i po FUS. Rysunek 2B przedstawia obraz T₁-w z wzmocnieniem kontrastowym (CE), z wyraźnymi ogniskowymi otwarciami w czterech miejscach sonikacji. Miejsca sonikacji 1 i 2 wykazują szczególnie jasne wzmocnienie. Na Rys. 3 widać również, że miejsca 1 i 2 odpowiadają wysokiemu sygnałowi T₂-w, co wskazuje na obrzęk.

Zakres obrzęku w obrazach T₂-w można czasem łatwiej zwizualizować na przekrojach strzałkowych. Rycina 4 przedstawia strzałkowe przekroje CE-T₁-w oraz T₂-w przez miejsca sonikacji 1 i 3. Obrzęk jest widoczny w miejscu 1, ale nie w miejscu 3.

Analiza spektralna zarejestrowanych danych emisji akustycznej (Rys.5) może wykazać emisje harmoniczne i/lub emisje sub- i ultraharmoniczne w przypadku występowania kawitacji stabilnej. Harmoniczne mogą wynikać również z nieliniowości tkanek, podczas gdy emisje sub- i ultraharmoniczne mogą pojawić się wyłącznie w wyniku aktywności pęcherzyków¹⁴. Przy wyższych ciśnieniach można również wykryć emisje szerokopasmowe wskazujące na kawitację inercyjną. Wiąże się je jednak z większą ilością ekstrawasacji erytrocytów i mikrourazów niż w przypadku sonikacji bez kawitacji inercyjnej¹¹.

Stosowanie wyższych częstotliwości sonikacji prowadzi do bardziej zlokalizowanych otwarć dzięki mniejszej wielkości plamki ogniskowej. Rysunek 6 pokazuje, że wyższe częstotliwości mogą być wykorzystane do tworzenia mniejszych obszarów otwarcia. Pozwala to na badanie efektów w środkowym mózgu przy mniejszej liczbie efektów w pobliżu czaszki.

Rycina 1. Układ eksperymentalny.

Rycina 2. Obrazy T₁-zależne mózgu szczura przed (lewo) i po (prawo) leczeniu, wykazujące wzmocnienie sygnału w czterech miejscach sonikacji.

Rysunek 3. Obrazy T₂-w mózgu szczura przed (lewo) i po (prawo) leczeniu (ten sam osobnik co na Rys. 2), wykazujące obrzęk w obrazowaniu T₂-w w miejscach sonikacji 1 i 2.

Rycina 4. Obrazy w płaszczyźnie strzałkowej T₁-w (lewo) i T₂-w (prawo) po leczeniu, wykonane z tego samego mózgu szczura co na ryc. 2 i 3. Otwarcie w lokalizacji 1 (lewo) koreluje z obrzękiem w obrazie T₂-w (prawo). Lokalizacja 3 wykazuje otwarcie (lewo), ale brak obrzęku w obrazie T₂-w.

Rycina 5. Widmo częstotliwości z danych zarejestrowanych podczas pojedynczego impulsu o czasie 10 ms przy 551,5 kHz. Widoczna jest częstotliwość podstawowa (f₀) oraz harmoniczne (2f₀) i subharmoniczne/ultraharmoniczne (0,5 f₀, 1,5f₀).

Rycina 6. Obrazy osiowe (lewo) i strzałkowe (prawo) CE-T₁-w po leczeniu, wykonane z mózgu szczura poddanego sonikacji w czterech miejscach przy częstotliwości 1,503 MHz. Widać, że otwarcia BBB przy tej częstotliwości są bardziej zlokalizowane.

Dyskusja

Przygotowanie zwierząt i mikropęcherzyków to najistotniejsze aspekty tej procedury. Sierść z głowy zwierzęcia musi zostać całkowicie usunięta, aby uniknąć tłumienia wiązki ultradźwiękowej. Bariera krew-mózg (BBB) może być rozszczelniana w znieczuleniu izofluranem, jednak w takim przypadku trudniej jest uzyskać spójne otwarcie.

Z mikropęcherzykami należy zawsze obchodzić się ostrożnie; podczas ich pobierania należy używać igieł o małym rozmiarze (gauge) i dużej średnicy, aby uniknąć ich rozbic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System do ukierunkowanego ultradźwięków dla małych zwierząt	FUS Instruments, Inc.	RK-100
Definity	Lantheus Medical Imaging
Omniscan	GE Healthcare