Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Podsumowanie

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Streszczenie

Progranulina (PGRN), znana również jako prekursor granuliny i epiteliny (GEP), jest autokrynnym czynnikiem wzrostu składającym się z 593 aminokwasów. Znane jest, że PGRN odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i chorobowych, w tym we wczesnej embriogenezie, gojeniu ran ¹, stanach zapalnych ^{2, 3} oraz w mechanizmach odporności organizmu ⁴. PGRN pełni również funkcję czynnika neurotroficznego ⁵, a mutacje w genie PGRN prowadzące do częściowej utraty białka PGRN wywołują otępienie czołowo-skroniowe ^{6, 7}. Nasze niedawne badania doprowadziły do wykazania, że PGRN jest istotnym regulatorem rozwoju i degradacji chrząstki ^8-11. Chociaż PGRN, odkryty niemal dwie dekady temu, odgrywa kluczową rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, wysiłki zmierzające do wykorzystania działania PGRN i zrozumienia zaangażowanych w to mechanizmów były znacznie utrudnione przez brak możliwości zidentyfikowania jego receptora lub receptorów wiążących. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę dwuhybrydową drożdżową (MY2H), opartą na najczęściej stosowanym systemie dwuhybrydowym z wykorzystaniem GAL4. W porównaniu z konwencjonalnym przesiewem dwuhybrydowym w drożdżach, MY2H drastycznie skraca proces selekcji i zmniejsza liczbę fałszywie dodatnich klonów. Ponadto podejście to jest powtarzalne i niezawodne; z sukcesem wykorzystaliśmy ten system do izolacji białek wiążących dla różnych przynęt, w tym kanałów jonowych ¹², białek macierzy pozakomórkowej ^{10, 13} oraz czynników wzrostu¹⁴. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedurę eksperymentalną MY2H na przykładzie PGRN, która doprowadziła do zidentyfikowania TNFR2 jako pierwszego znanego receptora powiązanego z PGRN ^{14, 15}.

Protokół

1. Informacje wprowadzające

System drożdżowego dwu-hybrydowego jest potężną techniką genetyczną wykorzystywaną do wykrywania oddziaływań białko-białko ^{16, 17}. Dostępnych jest komercyjnie kilka rodzajów systemów dwu-hybrydowych, takich jak systemy oparte na lexA, system rekrutacji Sos oraz systemy dwu-hybrydowe oparte na komórkach bakteryjnych lub ssaków; niniejsza praca skupia się konkretnie na modyfikacjach najczęściej stosowanego systemu drożdżowego dwu-hybrydowego opartego na GAL4. W skrócie metoda ta opiera się na właściwościach białka GAL4 drożdży, które składa się z oddzielnych domen odpowiedzialnych za wiązanie DNA i aktywację transkrypcyjną. Białko przynęta (bait) jest wyrażane jako fuzja z domeną wiążącą DNA (DNA-BD) białka GAL4, natomiast białka ofiara (prey) są wyrażane jako fuzje z domeną aktywacyjną (AD) białka GAL4. Oddziaływanie między białkami fuzyjnymi przynęty i ofiary prowadzi do aktywacji transkrypcyjnej miejsc wiązania GAL4 zawierających geny reporterowe zintegrowane z genomem drożdży. Zasada działania Y2H została przedstawiona na Rys. 1, a procedura eksperymentalna została podsumowana na Rys. 2.

2. Wymagane materiały i roztwory

1. Pożywka wzrostowa YPD (mieszanina peptonu, ekstraktu drożdżowego i dekstrozy w proporcjach optymalnych dla wzrostu większości szczepów Saccharomyces cerevisiae).
2. Minimalne bazy SD (minimalne syntetyczne bazy zdefiniowane (SD) zawierają bazę azotową dla drożdży, siarczan amonu oraz źródło węgla – dekstrozę. Do minimalnej bazy SD można dodać suplementy typu dropout (DO), aby otrzymać syntetyczną, zdefiniowaną pożywkę pozbawioną określonych składników odżywczych).
3. Suplement Leu/-Trp Dropout (DO) (zawiera wszystkie niezbędne aminokwasy z wyjątkiem leucyny i tryptofanu)
4. Suplement -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) (zawiera wszystkie niezbędne aminokwasy z wyjątkiem leucyny, tryptofanu, histydyny i uracylu)
5. Bulion Luria (LB) (Trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, NaCl 5 g/L)
6. Roztwór X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranosyd): przygotowany jako roztwór zapasowy 20 mg/ml w N, N-dimetyloformamidzie
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, autoklawowany)
8. DNA z plemników śledzia lub łososia poddane sonikacji, zagotowane (10 mg/ml)
9. 10X LiAc (1 M octanu litu, autoklawowany)
10. 50% roztwór PEG-3350, sterylizowany przez filtr
11. 3-amino-1, 2, 4-triazol (3AT)
12. Kanamycyna
13. Ampicylina
14. Komórki ELECTROMAX DH5α
15. Bufor Z: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (lub 8,52 g bezwodnego), 5,5 g NaH2PO4 H2O (lub 4,8 g bezwodnego), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (lub 0,12 g bezwodnego), rozpuszczone w 1 L autoklawowanej, destylowanej wody i doprowadzone do pH 7,0.

3. Generowanie przynęty (pDBLeu-PGRN)

Fragment cDNA kodujący PGRN pozbawiony peptydu sygnałowego (a.a.21-588) został sklonowany kierunkowo do miejsc Sal I-Not I wektora pDBLeu (system dwuhybrydowy ProQuest, Invitrogen), z zachowaniem tej samej ramki odczytu translacyjnego co domena wiążąca DNA białka GAL4, w celu otrzymania pDBLeu-PGRN.

1. Należy przeprowadzić amplifikację opisanego powyżej fragmentu cDNA PGRN metodą PCR, używając starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych tak, aby zawierały miejsca restrykcyjne (Sal I na końcu 5′ i Not I na końcu 3′), co umożliwi fuzję w odpowiedniej ramce odczytu.
2. Produkt PCR należy oczyścić za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie poddać trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi Sal I i Not I.
   Wektor DB pDBLeu należy przygotować poprzez podwójne trawienie tymi samymi endonukleazami restrykcyjnymi.
3. Fragment PGRN po trawieniu należy ligować do zlinearyzowanego wektora pDBLeu, a następniey przeprowadzić transformację szczepu DH5α z selekcją na podłożu LB z kanamycyną w stężeniu 25 μg/ml.
4. Poprawność konstruktu należy zweryfikować za pomocą sekwencjonowania DNA.

4. Transformacja plazmidu przynęty w małej skali

1. Zaszczepić 5 ml pożywki YPD kolonią szczepu Mav203 (Invitrogen) i inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 30°C.
2. Rozcieńczyć nocną kulturę w 50 ml pożywki YPD. Hodować przez dodatkowe 2-4 godziny.
3. Odwirować komórki przy 3000 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej. Resuspendować osad w 40 ml autoklawowanej, destylowanej wody.
4. Ponownie odwirować komórki. Resuspendować w 2 ml roztworu I i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
   Roztwór I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H₂O
5. Do probówek odmierzyć DNA: 2-3 μl pDBLeu-PGRN (0,25μg/μl) oraz 10 μl denaturowanego, fragmentowanego DNA z pleców łososia (10μg/μl). Dodać 100μl komórek drożdży i dokładnie wymieszać.
6. Dodać 700μl roztworu II i dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 30°C przez 30 min. Roztwór II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350.
7. Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42°C przez 15 min.
8. Odwirować przez 2 min. Odlać nadosad. Resuspendować osad w 200 μl autoklawowanej, destylowanej wody.
9. Wysiać zawiesinę na płytki SD-Leu wraz z rozcieńczeniami seryjnymi. Inkubować płytki w temperaturze 30°C przez 2-3 dni.

5. Walidacja przynęty

Przed przeprowadzeniem przesiewu w systemie dwuhybrydowym drożdżowym należy przetestować pDBLeu-PGRN pod kątem samoaktywacji oraz określić podstawowy poziom ekspresji genu reporterowego HIS3. Test ten pozwala ustalić, czy przynęty aktywują transkrypcję i czy samoaktywację można zneutralizować za pomocą inhibitorów. 3-amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) jest konkurencyjnym inhibitorem produktu genu HIS3 i może być wykorzystany do miareczkowania minimalnego poziomu ekspresji HIS3 wymaganego do wzrostu na pożywkach pozbawionych histydyny.

1. Przeprowadzić transformację pDBLeu-PGRN do szczepu drożdży Mav203, wysiać transformanty na płytki SD-Leu i inkubować przez 48-72 h w temperaturze 30°C.
2. Przenieść kolonie z każdej transformacji za pomocą autoklawowanych wykałaczek na płytki SD-Leu-His zawierające 3-AT w stężeniach 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM i 100 mM. 3-AT jest konkurencyjnym inhibitorem enzymu HIS3 i tylko te przynęty, które wykazują samoaktywację, będą zdolne do wzrostu w obecności 3-AT.
3. Szczepy przynęt rosnące na płytkach z 100 mM 3-AT nie nadają się do zastosowania w badaniu dwuhybrydowym. W przypadku przynęt nadających się do użycia należy wybrać najniższe stężenie 3-AT, które hamuje wzrost komórek. W wielu przypadkach do przesiewania stosuje się 25 mM 3-AT.

6. Przesiewanie biblioteki cDNA

Plazmid pDBLeu-PGRN wprowadza się do szczepu MaV203 za pomocą małoscale'owej transformacji zgodnie z powyższym opisem. W celu wprowadzenia biblioteki pPC86 (Invitrogen) do MaV203 (pDBLeu-PGRN), procedura opisana poniżej zazwyczaj pozwala uzyskać ~4 x 10⁴ kolonii przy użyciu 0,5 μg DNA biblioteki plazmidowej. W związku z tym uzyskanie 2,5 x 10⁶ transformantów drożdży wymaga użycia ~30,0 μg DNA plazmidowego biblioteki pPC86-cDNA, przeprowadzenia 25 transformacji oraz przygotowania pięćdziesięciu szalek o średnicy 10 cm (SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT).

1. Przygotować odpowiednią liczbę 10-cm płytek SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT (50 dla poniższej procedury). Przygotować również co najmniej cztery 10-cm płytki SD-Leu-Trp do oszacowania liczby transformantów.
2. Przeprowadzić transformację biblioteki do szczepu MaV203 zawierającego pDBLeu-PGRN zgodnie z poniższą procedurą.
   1. Resuspender kilka wyizolowanych kolonii MaV203 (pDBLeu-PGRN) w ~100μl autoklawowanej wody destylowanej i wysiać je na 10-cm płytkę SD-Leu. Powtórzyć procedurę dla drugiej płytki SD-Leu. Inkubować obie płytki przez 18-24 h w temperaturze 30°C.
   2. Zeskrobać i całkowicie resuspender komórki w 10 ml autoklawowanej wody destylowanej. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do 500 ml ciekłego medium YPD w kolbie, aby uzyskać OD₆₀₀ na poziomie ~0,1.
   3. Zweryfikować, czy po inokulacji OD wynosi ~0,1.
   4. Wstrząsać w temperaturze 30°C, aż OD₆₀₀ osiągnie wartość ~0,4.
   5. Przygotować świeże odczynniki:
      1. 110 ml 1X TE/LiAc, łącząc 11 ml 10X TE, 11 ml 10X LiAc oraz 88 ml autoklawowanej wody.
      2. 16 ml PEG/LiAc, łącząc 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml 10X LiAc oraz 12,8 ml 50% PEG-3350.
   6. Odwirować komórki przy 3000g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   7. Odlać nadsącz i delikatnie resuspender osad poprzez pipetowanie w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej w temperaturze pokojowej.
   8. Wirować przy 3000 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   9. Odlać nadsącz z odwirowanych komórek i resuspender osad komórkowy w 50 ml roztworu 1X TE/LiAc.
   10. Wirować przy 3000 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   11. Odlać nadsącz i resuspender osad w końcowej objętości 2,5 ml roztworu 1X TE/LiAc.
   12. Przeprowadzić 25 transformacji. Połączyć 2,5 ml komórek, 125 μl (10μg/μl) zdenaturowanego, rozszczepionego DNA z plemni łososia oraz 30 μg biblioteki cDNA. Wymieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Dodać 15 ml roztworu PEG/LiAc i delikatnie wymieszać. Rozdzielić do 25 autoklawowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml po 700 μl każda.
   13. Inkubować przez 30 min w kąpieli wodnej o temperaturze 30°C.
   14. Poddać szokowi termicznemu przez 15 min w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C.
   15. Wirować przy 6 000 g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadsącz. Delikatnie resuspender każdy osad w 400 μl autoklawowanej wody destylowanej poprzez pipetowanie.
3. Wysiać 200 μl mieszaniny transformacyjnej z każdej transformacji na pojedyncze 10-cm płytki SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT (stężenie 3AT: 25 mM) za pomocą rozpylacza, tak aby z 25 autoklawowanych probówek 1,5-ml można było przygotować 50 płytek (SD-Leu-Trp-His-Ura +3AT).
4. Inkubować płytki przez 5-10 dni w temperaturze 30°C.
5. W celu oszacowania wydajności transformacji reakcji, seryjne rozcieńczenia jednej reakcji (1:40; 1:400 oraz 1:4000) wysiać na płytkę SD-Leu-Trp. Po inkubacji przez 3 dni w temperaturze 30°C policzyć liczbę kolonii i obliczyć całkowitą liczbę transformantów.

7. Analiza X-gal

1. Przenieś kolonie na płytkę YPD; inkubuj w temperaturze 30°C przez noc.
2. Umieść okrągłą membranę nitrocelulozową na płytce YPD; upewnij się, że między membraną a płytką YPD nie ma pęcherzyków powietrza. Po 1-2 min upewnij się, że wszystkie kolonie zostały przeniesione na membrany (papier nitrocelulozowy).
3. Umieść membranę stroną z koloniami do góry w korytku wykonanym z folii aluminiowej.
4. Włóż membranę do ciekłego azotu, odczekaj dwadzieścia sekund, a następnie zanurz w ciekłym azocie na kilka minut.
5. Wyjmij membranę, aby odmarzła.
6. W międzyczasie wymieszaj następujące odczynniki:
   1,5ml buforu Z
   20μl X-gal (20 mg/ml)
7. Nalej bufor Z/X-gal do szalki Petriego, a na wierzch połóż papier Whatmana.
8. Ostrożnie umieść papier nitrocelulozowy na papierze Whatmana.
9. Inkubuj w temperaturze 37°C do pojawienia się niebieskich kolonii.

8. Test retransformacji

Białka fuzyjne ofiary (AD-Y) wyizolowane podczas przesiewania biblioteki powinny zachować interakcję z białkiem fuzyjnym przynęty (DB-X), aby indukować geny reporterowe; ponowna transformacja klonów ofiary i konstruktu przynęty do drożdży może dodatkowo wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie i ułatwić dalszą analizę.

1. Wyizoluj plazmidowe DNA z szczepów drożdży potencjalnie zawierających oddziałujące białka.
2. Przeprowadź transformację DNA do komórek E. coli DH5α, wysiej transformaty na płytki LB+100 μg/ml ampicyliny w celu selektywnego wyizolowania biblioteki pPC86-cDNA i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C.
3. Wybierz kilka kolonii z płytki i przenieś je do pożywki LB+100 μg/ml ampicyliny.
4. Przygotuj miniprep DNA i przeanalizuj go za pomocą podwójnego trawienia restrykcyjnego enzymami Sal I i Not I.
5. Przeprowadź kotransformację plazmidu prey i plazmidu bait do szczepu MaV203, wysiej mieszaniny transformacyjne na płytki SC-Leu-Trp i inkubuj przez 2-3 dni w temperaturze 30°C.
6. Wybierz trzy różne kolonie z płytki SC-Leu-Trp i wykonaj test X-gal.

9. Sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna

Wykonaj sekwencjonowanie DNA plazmidowego wyizolowanego z prawdopodobnych klonów prawdziwie dodatnich, porównaj te sekwencje z sekwencjami w bazie GenBank przy użyciu programu BLAST i zidentyfikuj klony dwuhybrydowe odpowiadające znanym genom. Dane z sekwencjonowania wykazały, że dwa z 12 uzyskanych powyżej wyników dodatnich to receptor TNFR2 powierzchni komórkowej (TNFRSF1B/CD120b; Accession #NM_130426). Ponadto interakcję między PGRN a TNFR zweryfikowano za pomocą różnych testów interakcji białko-białko, w tym in vitro testu wiązania w fazie stałej, koimmunoprecypitacji, analizy rezonansu plazmonowego oraz analizy cytometrycznej ¹⁴.

10. Reprezentatywne wyniki

Schemat blokowy procesu przesiewania przedstawiono na Rys. 3. Na tym etapie zazwyczaj uzyskuje się od 50 do 100 pozytywnych kandydatów na klony. Wstępnie wyizolowano 54 pozytywne kandydaty na klony spośród 2,5 miliona transformantów przesiewanych z użyciem przynęty PGRN. Pozytywne kandydaty na klony zostały następnie zweryfikowane poprzez wykonanie testu X-gal. Zazwyczaj za pomocą testu X-gal eliminuje się około 50% fałszywie pozytywnych klonów. Na tym etapie dla przynęty PGRN uzyskano 23 pozytywne kandydaty na klony (Rys. 4). Ponowna transformacja klonów ofiary oraz konstruktu przynęty do drożdży pozwala na dalszą eliminację wyników fałszywie pozytywnych; klony, które nadal aktywują geny reporterowe, prawdopodobnie reprezentują wyniki prawdziwie pozytywne. Zazwyczaj usuwanych jest około 50% pozytywnych kandydatów na klony. Ostatecznie wyizolowano 12 pozytywnych klonów oddziałujących z PGRN w drożdżach.

Rycina 1. Zasada działania systemu drożdżowego dwuhybrydowego

Rysunek 2. Procedura identyfikacji partnerów wiążących białka z wykorzystaniem systemu dwuhybrydowego drożdżowego

Rysunek 3. Schemat blokowy przesiewania biblioteki drożdżowego systemu dwuhybrydowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze.

Rycina 4. Analiza aktywności beta-galaktosydazy dla pozytywnych kandydatów klonalnych. A, Pozytywne klony uzyskane z przesiewu biblioteki przeniesiono na płytkę YPD i inkubowano przez noc w 30°C; B, Wszystkie kolonie z płytki YPD przeniesiono na membrany nitrocelulozowe i przeprowadzono analizę aktywności beta-galaktosydazy.

Dyskusja

Przesiewy metodą dwuhybrydowej analizy drożdżowej okazały się skutecznym narzędziem w identyfikacji oddziaływań białkowych ^{16, 17}. W porównaniu z innymi podejściami do identyfikacji partnerów wiążących białka, takimi jak biochemiczna kopurowanie czy chipy białkowe, system dwuhybrydowy drożdży jest czułą metodą genetyczną, która może być wykorzystana do przesiewania bardzo dużych liczb sekwencji kodujących w stosunkowo prostym doświadczeniu; ponadto wykrywa on oddziaływania in vivo i nie wymaga skomplikowanego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System dwuhybrydowy ProQuest	Invitrogen	10835
Pożywka wzrostowa YPD	Clontech Laboratories	630409
Pożywka agarowa YPD	Clontech Laboratories	630410
Podstawa minimalnego agaru SD	Clontech Laboratories	630412
Suplement DO -Leu	Clontech Laboratories	630414
Suplement DO -Leu/-Trp	Clontech Laboratories	630417
Suplement DO -His/-Leu/-Trp/-Ura	Clontech Laboratories	630425
3-amino-1,2,4-triazol (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Pożywka Luria (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonikowany DNA sperm plodnia łososia	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Ampicylina	AMRESCO	0339
Siarczan kanamycyny	Invitrogen	11815-024
Komórki kompetentne Subcloning Efficiency™ DH5α™	Invitrogen	18265-017
Zasada Trizma®	Sigma-Aldrich	T6066
Octan litu	Sigma-Aldrich	L4158
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	ED
Membrana nitrocelulozowa	Bio-Rad	162-0115
Szalka Petri 10 cm	ITI Scientific	CT-903
Inkubator (30 °C)	ATR (Ecotron)