Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Podsumowanie

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Streszczenie

Progranulina (PGRN), znana również jako prekursor granuliny i epiteliny (GEP), jest autokrynnym czynnikiem wzrostu składającym się z 593 aminokwasów. Znane jest, że PGRN odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i chorobowych, w tym we wczesnej embriogenezie, gojeniu ran ¹, stanach zapalnych ^{2, 3} oraz w mechanizmach odporności organizmu ⁴. PGRN pełni również funkcję czynnika neurotroficznego ⁵, a mutacje w genie PGRN prowadzące do częściowej utraty białka PGRN wywołują otępienie czołowo-skroniowe ^{6, 7}. Nasze niedawne badania doprowadziły do wykazania, że PGRN jest istotnym regulatorem rozwoju i degradacji chrząstki ^8-11. Chociaż PGRN, odkryty niemal dwie dekady temu, odgrywa kluczową rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, wysiłki zmierzające do wykorzystania działania PGRN i zrozumienia zaangażowanych w to mechanizmów były znacznie utrudnione przez brak możliwości zidentyfikowania jego receptora lub receptorów wiążących. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę dwuhybrydową drożdżową (MY2H), opartą na najczęściej stosowanym systemie dwuhybrydowym z wykorzystaniem GAL4. W porównaniu z konwencjonalnym przesiewem dwuhybrydowym w drożdżach, MY2H drastycznie skraca proces selekcji i zmniejsza liczbę fałszywie dodatnich klonów. Ponadto podejście to jest powtarzalne i niezawodne; z sukcesem wykorzystaliśmy ten system do izolacji białek wiążących dla różnych przynęt, w tym kanałów jonowych ¹², białek macierzy pozakomórkowej ^{10, 13} oraz czynników wzrostu¹⁴. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedurę eksperymentalną MY2H na przykładzie PGRN, która doprowadziła do zidentyfikowania TNFR2 jako pierwszego znanego receptora powiązanego z PGRN ^{14, 15}.

Protokół

1. Informacje wprowadzające

System drożdżowy dwuhybrydowy jest potężną techniką genetyczną wykorzystywaną do wykrywania oddziaływań białko-białko ^{16, 17}. W sprzedaży dostępnych jest kilka rodzajów systemów dwuhybrydowych, takich jak systemy oparte na lexA, system rekrutacji Sos oraz systemy dwuhybrydowe oparte na komórkach bakteryjnych lub ssaków; niniejsza praca koncentruje się konkretnie na modyfikacjach najczęściej stosowanego drożdżowego systemu dwuhybrydowego opartego na GAL4. W skrócie, metoda ta opiera się na właściwościach białka GAL4 drożdży, które składa się z rozdzielnych domen odpowiedzialnych za wiązanie DNA i aktywację transkrypcyjną. Białko przynęty (bait) jest wyrażane jako fuzja z domeną wiążącą DNA białka GAL4 (DNA-BD), podczas gdy białka ofiary (prey) są wyrażane jako fuzje z domeną aktywacyjną GAL4 (AD). Oddziaływanie między fuzyjnymi białkami przynęty i ofiary prowadzi do aktywacji transkrypcyjnej miejsc wiązania GAL4 zawierających geny reporterowe zintegrowane z genomem drożdży. Zasada działania Y2H została przedstawiona na Rys. 1, a procedura eksperymentalna została podsumowana na Rys. 2.

2. Wymagane materiały i roztwory

1. Pożywka wzrostowa YPD (mieszanina peptonu, ekstraktu drożdżowego i dekstrozy w optymalnych proporcjach do hodowli większości szczepów Saccharomyces cerevisiae).
2. Minimalne bazy SD (minimalne syntetyczne bazy zdefiniowane (SD) zawierają azotową bazę drożdżową, siarczan amonu oraz źródło węgla – dekstrozę. Do minimalnej bazy SD można dodać suplementy Dropout (DO), aby przygotować syntetyczną, zdefiniowaną pożywkę pozbawioną określonych składników odżywczych).
3. Suplement Dropout (DO) Leu/-Trp (zawierający wszystkie niezbędne aminokwasy z wyjątkiem leucyny i tryptofanu)
4. Suplement Dropout (DO) -His/-Leu/-Trp/-Ura (zawierający wszystkie niezbędne aminokwasy z wyjątkiem leucyny, tryptofanu, histydyny i uracylu)
5. Pożywka Luria (LB) (trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, NaCl 5 g/L)
6. Roztwór X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktopiranozyd): przygotowany jako roztwór stokowy o stężeniu 20 mg/ml w N, N-dimetyloformamidzie
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, autoklawowany)
8. DNA z plemników śledzia lub łososia poddane sonikacji, zagotowane (10 mg/ml)
9. 10X LiAc (1 M octan litu, autoklawowany)
10. 50% roztwór PEG-3350, sterylizowany przez filtrowanie
11. 3-amino-1, 2, 4-triazol (3AT)
12. Kanamycyna
13. Ampicylina
14. Komórki ELECTROMAX DH5α
15. Bufor Z: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (lub 8,52 g bezwodnego), 5,5 g NaH2PO4 H2O (lub 4,8 g bezwodnego), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (lub 0,12 g bezwodnego), rozpuszczone w 1 L autoklawowanej wody destylowanej i doprowadzone do pH 7,0.

3. Generowanie przynęty (pDBLeu-PGRN)

Fragment cDNA kodujący PGRN pozbawiony peptydu sygnałowego (a.a.21-588) został sklonowany kierunkowo do miejsc Sal I-Not I wektora pDBLeu (system dwuhybrydowy ProQuest, Invitrogen), zachowując tę samą ramkę odczytu translacyjnego co domena wiążąca DNA białka GAL4, w celu otrzymania pDBLeu-PGRN.

1. Wzmacniać fragment cDNA PGRN opisany powyżej za pomocą PCR, używając starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych tak, aby zawierały miejsca restrykcyjne (Sal I na końcu 5′ oraz Not I na końcu 3′), co umożliwi fuzję w ramce odczytu.
2. Oczyścić produkt PCR z żelu, a następnie poddać trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi Sal I i Not I.
   Przygotować wektor DB pDBLeu poprzez podwójne trawienie tymi samymi endonukleazami restrykcyjnymi.
3. Ligować restrykcjonowany fragment PGRN do zlinearyzowanego wektora pDBLeu i przeprowadzić transformację do szczepu DH5α z selekcją na podłożu LB z kanamycyną w stężeniu 25 μg/ml.
4. Zweryfikować poprawność konstruktu za pomocą sekwencjonowania DNA.

4. Małoskalowa transformacja plazmidu przynęty

1. Zaszczep 5 ml pożywki YPD kolonią Mav203 (Invitrogen) i inkubuj z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 30°C.
2. Rozcieńcz kulturę nocną w 50 ml pożywki YPD. Hoduj przez kolejne 2-4 godziny.
3. Zwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 3000 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Resuspenduj osad w 40 ml autoklawowanej wody destylowanej.
4. Ponownie zwirować komórki. Resuspenduj w 2 ml roztworu I i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min.
   Roztwór I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H₂O
5. Rozdziel DNA do probówek: 2-3 μl pDBLeu-PGRN (0,25μg/μl) oraz 10 μl zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA sperm plemników łososia (10μg/μl). Dodaj 100μl komórek drożdży i dobrze wymieszaj.
6. Dodaj 700μl roztworu II i dobrze wymieszaj. Inkubuj w temperaturze 30°C przez 30 min. Roztwór II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350.
7. Przeprowadź szok termiczny w temperaturze 42°C przez 15 min.
8. Zwirować przez 2 min. Odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 200 μl autoklawowanej wody destylowanej.
9. Wysiej zawiesinę na płytki SD-Leu z rozcieńczeniami seryjnymi. Inkubuj płytkę w temperaturze 30°C przez 2-3 dni.

5. Walidacja przynęty

Przed przeprowadzeniem przesiewu metodą dwuhybrydową drożdżami, należy przetestować pDBLeu-PGRN pod kątem samoaktywacji oraz określić bazowe poziomy ekspresji genu reporterowego HIS3. Test ten pozwala ustalić, czy białka przynęty aktywują transkrypcję oraz czy samoaktywacja może zostać zneutralizowana przez inhibitory. 3-amino-1,2,4-triazol (3-AT) jest konkurencyjnym inhibitorem produktu genu HIS3 i może być wykorzystany do miareczkowania minimalnego poziomu ekspresji HIS3 wymaganego do wzrostu na pożywkach pozbawionych histydyny.

1. Przetransformuj pDBLeu-PGRN do szczepu drożdży Mav203, wysiej transformaty na podłoża SD-Leu i inkubuj przez 48-72 h w temperaturze 30°C.
2. Przeniesie kolonie z każdej transformacji za pomocą autoklawowanych wykałaczek na podłoża SD-Leu-His zawierające 3-AT w stężeniach 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM i 100 mM. 3-AT jest konkurencyjnym inhibitorem enzymu HIS3 i tylko przynęty wykazujące samoaktywację będą zdolne do wzrostu w obecności 3-AT.
3. Szczepy z przynętami, które rosną na podłożach zawierających 100 mM 3-AT, nie nadają się do użycia w screeningu dwuhybrydowym. W przypadku przynęt, które można wykorzystać, należy zastosować najniższe stężenie 3-AT hamujące wzrost komórek. W wielu przypadkach do screeningu stosuje się 25 mM 3-AT.

6. Przesiewanie biblioteki cDNA

Plazmid pDBLeu-PGRN wprowadza się do szczepu MaV203 za pomocą małoskalowej transformacji, zgodnie z powyższym opisem. W celu wprowadzenia biblioteki pPC86 (Invitrogen) do MaV203 (pDBLeu-PGRN) zastosowanie opisanej poniżej procedury zazwyczaj pozwala uzyskać ~4 x 10⁴ kolonii przy użyciu 0,5 μg DNA plazmidowej biblioteki. Zatem uzyskanie 2,5 x 10⁶ transformantów drożdżowych będzie wymagało ~30,0 μg DNA plazmidowej biblioteki pPC86-cDNA, przeprowadzenia 25 transformacji oraz przygotowania pięćdziesięciu płytek 10-cm (SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT).

1. Przygotować odpowiednią liczbę 10-cm płytek SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT (50 dla poniższej procedury). Przygotować również co najmniej cztery 10-cm płytki SD-Leu-Trp do oszacowania liczby transformantów.
2. Przeprowadzić transformację biblioteki do szczepu MaV203 zawierającego pDBLeu-PGRN zgodnie z poniższą procedurą.
   1. Kilka wyizolowanych kolonii MaV203 (pDBLeu-PGRN) zawiesić w ~100μl autoklawowanej wody destylowanej i wysiać na 10-cm płytkę SD-Leu. Powtórzyć procedurę dla drugiej płytki SD-Leu. Inkubować obie płytki przez 18-24 h w temperaturze 30°C.
   2. Zeskrobać komórki i całkowicie zawiesić je w 10 ml autoklawowanej wody destylowanej. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do 500 ml płynnego podłoża YPD w kolbie, aby uzyskać OD₆₀₀ na poziomie ~0.1.
   3. Zweryfikować, czy po inokulacji OD wynosi ~0.1.
   4. Inkubować z wytrząsaniem w 30°C, aż OD₆₀₀ osiągnie ~0.4.
   5. Przygotować świeże roztwory:
      1. 110 ml 1X TE/LiAc, łącząc 11 ml 10X TE, 11 ml 10X LiAc i 88 ml autoklawowanej wody.
      2. 16 ml PEG/LiAc, łącząc 1.6 ml 10X TE, 1.6 ml 10X LiAc i 12.8 ml 50% PEG-3350.
   6. Zwirywać komórki przy 3000g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   7. Odlać nadsącz i ostrożnie resuspendować osad poprzez pipetowanie w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej w temperaturze pokojowej.
   8. Wirować przy 3000 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   9. Odlać nadsącz z odwirowanych komórek i resuspendować osad komórkowy w 50 ml roztworu 1X TE/LiAc.
   10. Wirować przy 3000 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   11. Usunąć nadsącz i resuspendować osad do końcowej objętości 2.5 ml roztworu 1X TE/LiAc.
   12. Przeprowadzić 25 transformacji. Połączyć 2.5 ml komórek, 125 μl (10μg/μl) zdenaturowanego, fragmentowanego DNA z plemni łososia oraz 30 μg biblioteki cDNA. Wymieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Dodać 15 ml roztworu PEG/LiAc i delikatnie wymieszać. Rozdzielić na 25 autoklawowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml, po 700 μl do każdej.
   13. Inkubować przez 30 min w kąpieli wodnej o temperaturze 30°C.
   14. Przeprowadzić szok termiczny przez 15 min w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C.
   15. Wirować przy 6,000 g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadsącz. Delikatnie resuspendować każdy osad w 400 μl autoklawowanej wody destylowanej poprzez pipetowanie.
3. Wysiać 200 μl mieszaniny transformacyjnej z każdej transformacji na pojedyncze 10-cm płytki SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT (stężenie 3AT: 25 mM), używając rozprowadzacza, tak aby z 25 autoklawowanych probówek 1.5-ml można było przygotować 50 płytek (SD-Leu-Trp-His-Ura +3AT).
4. Inkubować płytki przez 5-10 dni w temperaturze 30°C.
5. W celu oszacowania wydajności transformacji danej reakcji, rozcieńczenia seryjne jednej reakcji (1:40, 1:400 i 1:4000) wysiać na płytki SD-Leu-Trp. Po 3 dniach inkubacji w 30°C należy zliczyć liczbę kolonii i obliczyć całkowitą liczbę transformantów.

7. Analiza z X-gal

1. Przenieś kolonie na płytkę YPD; inkubuj w temperaturze 30°C przez noc.
2. Umieść okrągłą membranę nitrocelulozową na płytce YPD; upewnij się, że między membraną a płytką YPD nie ma pęcherzyków powietrza. Po 1-2 min upewnij się, że wszystkie kolonie zostały przeniesione na membrany (papier nitrocelulozowy).
3. Umieść membranę stroną z koloniami do góry w korytku wykonanym z folii aluminiowej.
4. Zanurz membranę w ciekłym azocie, odczekaj dwadzieścia sekund, a następnie pozostaw w ciekłym azocie przez kilka minut.
5. Wyjmij membranę, aby odtajała.
6. W tym czasie wymieszaj następujące odczynniki:
   1.5ml buforu Z
   20μl X-gal (20 mg/ml)
7. Nalej bufor Z/X-gal do szalki Petriego i połóż na nim papier Whatmana.
8. Ostrożnie umieść papier nitrocelulozowy na papierze Whatmana.
9. Inkubuj w temperaturze 37° aż do pojawienia się niebieskich kolonii.

8. Test retransformacji

Białka fuzyjne łupu (AD-Y) wyizolowane podczas przesiewania biblioteki powinny zachować interakcję z białkiem fuzyjnym przynęty (DB-X) w celu indukcji genów raportujących, a retransformacja klonów łupu i konstruktu przynęty do drożdży może dodatkowo wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie i ułatwić dalsze analizy.

1. Wyizoluj plazmidowe DNA ze szczepów drożdży, które potencjalnie zawierają oddziałujące białka.
2. Przeprowadź transformację DNA do komórek E. coli DH5α, wysiej transformanty na płytki LB z 100 μg/ml ampicyliny w celu selektywnego wyizolowania biblioteki pPC86-cDNA i inkubuj przez noc w 37°C.
3. Wybierz kilka kolonii z płytki i przenieś je do bulionu LB z 100 μg/ml ampicyliny.
4. Przygotuj miniprep DNA i poddaj analizie za pomocą podwójnego trawienia restrykcyjnego enzymami Sal I i Not I.
5. Przeprowadź kotransformację plazmidu prey i plazmidu bait do szczepu MaV203, wysiej mieszaniny transformacyjne na płytki SC-Leu-Trp i inkubuj przez 2-3 dni w 30°C.
6. Wybierz trzy różne kolonie z płytki SC-Leu-Trp i wykonaj test X-gal.

9. Sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna

Przeprowadź sekwencjonowanie DNA plazmidowego wyizolowanego z klonów prawdopodobnie będących prawdziwie dodatnimi, porównaj uzyskane sekwencje z sekwencjami w bazie GenBank przy użyciu programu BLAST i zidentyfikuj klony w systemie dwuhybrydowym, które odpowiadają znanym genom. Dane z sekwencjonowania wykazały, że dwa z 12 uzyskanych powyżej wyników dodatnich stanowił receptor TNFR2 powierzchni komórkowej (TNFRSF1B/CD120b; nr dostępu NM_130426). Ponadto interakcję między PGRN a TNFR zweryfikowano za pomocą różnych testów interakcji białko-białko, w tym in vitro testu wiązania w fazie stałej, koimmunoprecypitacji, analizy powierzchniowego rezonansu plazmonowego oraz analizy cytometrii przepływowej ¹⁴.

10. Reprezentatywne wyniki

Schemat blokowy procesu przesiewowego przedstawiono na Ryc. 3. Na tym etapie zazwyczaj uzyskuje się od 50 do 100 kandydatów na pozytywne klony. Początkowo wyizolowano 54 kandydatów na pozytywne klony spośród 2,5 miliona transformantów przebadanych z użyciem przynęty PGRN. Kandydaci na pozytywne klony zostali następnie zweryfikowani poprzez wykonanie testu X-gal. Zazwyczaj test X-gal pozwala na usunięcie około 50% fałszywie pozytywnych klonów. Na tym etapie dla przynęty PGRN uzyskano 23 kandydatów na pozytywne klony (Ryc. 4). Ponowna transformacja klonów ofiar oraz konstruktu przynęty do drożdży pozwala na dalszą eliminację wyników fałszywie pozytywnych; klony, które nadal aktywują geny reporterowe, prawdopodobnie reprezentują wyniki prawdziwie pozytywne. Zazwyczaj usuwanych jest około 50% kandydatów na pozytywne klony. Ostatecznie wyizolowano 12 pozytywnych klonów wchodzących w interakcję z PGRN w drożdżach.

Rycina 1. Zasada działania systemu drożdżowego dwuhybrydowego

Rycina 2. Schemat identyfikacji partnerów wiążących białka z wykorzystaniem systemu drożdżowego dwuhybrydowego

Rycina 3. Schemat blokowy przesiewania biblioteki dwuhybrydowej drożdżowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze.

Rycina 4. Analiza aktywności beta-galaktozydazy w pozytywnych kandydackich klonach. A, Pozytywne klony uzyskane z przesiewania biblioteki przeniesiono na płytkę YPD i inkubowano w 30°C przez noc; B, Wszystkie kolonie z płytki YPD przeniesiono na membrany nitrocelulozowe i przeprowadzono analizę aktywności beta-galaktozydazy.

Dyskusja

Przesiewy metodą dwuhybrydowej analizy drożdżowej okazały się skutecznym narzędziem w identyfikacji oddziaływań białkowych ^{16, 17}. W porównaniu z innymi podejściami do identyfikacji partnerów wiążących białka, takimi jak biochemiczna kopurowanie czy chipy białkowe, system dwuhybrydowy drożdży jest czułą metodą genetyczną, która może być wykorzystana do przesiewania bardzo dużych liczb sekwencji kodujących w stosunkowo prostym doświadczeniu; ponadto wykrywa on oddziaływania in vivo i nie wymaga skomplikowanego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System dwuhybrydowy ProQuest	Invitrogen	10835
Pożywka wzrostowa YPD	Clontech Laboratories	630409
Pożywka agarowa YPD	Clontech Laboratories	630410
Podstawa minimalnego agaru SD	Clontech Laboratories	630412
Suplement DO -Leu	Clontech Laboratories	630414
Suplement DO -Leu/-Trp	Clontech Laboratories	630417
Suplement DO -His/-Leu/-Trp/-Ura	Clontech Laboratories	630425
3-amino-1,2,4-triazol (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Pożywka Luria (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonikowany DNA sperm plodnia łososia	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Ampicylina	AMRESCO	0339
Siarczan kanamycyny	Invitrogen	11815-024
Komórki kompetentne Subcloning Efficiency™ DH5α™	Invitrogen	18265-017
Zasada Trizma®	Sigma-Aldrich	T6066
Octan litu	Sigma-Aldrich	L4158
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	ED
Membrana nitrocelulozowa	Bio-Rad	162-0115
Szalka Petri 10 cm	ITI Scientific	CT-903
Inkubator (30 °C)	ATR (Ecotron)