Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

DOI:

10.3791/3563

⸱

22 listopada 2011

 , 
1Pathobiological Sciences, Louisiana State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) płuc odgrywają fundamentalną rolę w wykrywaniu naciekających patogenów 1,2, a także w kontrolowaniu odpowiedzi tolerogennych 3 w drogach oddechowych. U myszy opisano co najmniej trzy główne podgrupy komórek dendrytycznych płuc: konwencjonalne DC (cDC) 4, plazmacytoidalne DC (pDC) 5 oraz produkujące IFN killer DC (IKDC) 6,7. Podgrupa cDC jest najliczniejszą podgrupą DC w płucach 8.

Powszechnie stosowanym markerem służącym do identyfikacji subpopulacji komórek DC jest CD11c, integryna transbłonowa typu I (β2), która jest również ekspresjonowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile i niektóre limfocyty B 9. W niektórych tkankach wykorzystanie CD11c jako markera do identyfikacji mysich komórek DC jest zasadne, jak na przykład w śledzionie, gdzie większość komórek CD11c+ reprezentuje subpopulację cDC wykazującą wysoką ekspresję głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC-II). Jednak płuca są tkanką bardziej heterogenną, w której obok subpopulacji DC występuje wysoki odsetek odrębnej populacji komórek wykazujących wysoką ekspresję CD11c, lecz niską ekspresję MHC-II. Na podstawie charakterystyki, a przede wszystkim ekspresji F4/80, markera makrofagów śledzionowych, populacja komórek płuc CD11chiMHC-IIlo została zidentyfikowana jako makrofagi płucne 10, a w nowszych badaniach jako potencjalny prekursor DC 11.

W przeciwieństwie do mysich pDC, badanie specyficznej roli cDC w płucnej odpowiedzi odpornościowej było ograniczone ze względu na brak specyficznego markera, który pomógłby w izolacji tych komórek. Dlatego w niniejszej pracy opisujemy procedurę izolacji wysoko oczyszczonych cDC z płuc myszy. Izolacja subpopulacji DC z płuc stanowi bardzo użyteczne narzędzie do poznania funkcji tych komórek w odpowiedzi na patogeny układu oddechowego, a także czynniki środowiskowe, które mogą wywołać odpowiedź odpornościową gospodarza w płucach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Perfuzja płuc i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

  1. Uśmierć mysz poprzez doszpryknięcie dootrzewnowe mieszaniny anestetyków ketaminy i ksylazyny (dawkowanie: ketamina 1,8 mg/mysz, ksylazyna 0,19 mg/mysz) oraz upuszczenie krwi przez żyłę udową
  2. Odsłoń jamę klatki piersiowej, rozcinając i delikatnie odsuwając zewnętrzną skórę otrzewnej. Następnie otwórz przeponę, przecinając klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca
  3. Delikatnie przepłucz płuca, używając strzykawki 5 ml wypełnionej EDTA-HBSS (1mM EDTA w HBSS wolnym od wapnia i magnezu). Podłącz igłę 25 G i wprowadź ją do prawej komory serca. Aby zapobiec wyciekom podczas wstrzykiwania, zabezpiecz tkankę mięśnia sercowego wokół igły za pomocą pęsety. Powoli wstrzykuj roztwór, utrzymując stałe ciśnienie. Prawidłowa perfuzja spowoduje nadmuchanie płuc i zmianę ich koloru na różowo-biały
  4. Usuń drenujące węzły chłonne, aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie z tej tkanki
  5. Pobierz tkankę płucną, przenieś ją do szalki Petriego na lodzie i posiekaj na małe kawałki za pomocą żyletki
  6. Przenieś rozdrobnioną tkankę do probówki gentleMACS C zawierającej 5 ml/płuco roztworu trawiennego z kolagenazą (kolagenaza typu 1A 0,5 mg/ml oraz bydlęca DNaza trzustkowa typu IV 20 μg/ml w HBSS zawierającym 5% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny)
  7. Użyj dysocjatora gentleMACS, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Wybierz program: m_lung_01. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wstrząsaj probówką co 5 minut, aby resuspenderć fragmenty tkanki. Następnie uruchom program m_lung_02
  8. Przenieś próbkę do stożkowej probówki 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4 °C. Po tym etapie wszystkie odczynniki i wirowania należy utrzymywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec spadkowi żywotności komórek
  9. Odlej nadsącz i poddaj pozostałe erytrocyty lizie, dodając 2 ml buforu lizującego ACK na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Przemyj komórki 13 ml zimnego PBS/0,5% BSA i wiruj przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4°C
  10. Odlej nadsącz, resuspenduj wszystkie komórki w 5 ml zimnego PBS/0,5%BSA i przefiltruj przez nylonowy siewnik 100 μm
  11. Oznacz całkowitą liczbę komórek, stosując metodę wykluczania barwnika trypan blue

2. Izolacja magnetyczna i wzbogacanie populacji komórek CD11c+

  1. Odwirować zawiesinę pojedynczych komórek przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.
  2. Resuspender osad komórkowy w 400 μl buforu do separacji (PBS, 0,5% BSA i 2 mM EDTA) na każde 108 całkowitych komórek. Zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał zależne od receptorów Fc, stosując przeciwciało anty-CD16/CD32 (0,5 μg / 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć komórki 10 ml zimnego buforu do separacji i odwirować przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C. Resuspender komórki w 400 μl buforu do separacji.
  4. Dodać 100 μl CD11c MicroBeads na każde 108 całkowitych komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w lodówce (2-8 °C).
  5. Przemyć komórki 10 ml zimnego buforu do separacji, odwirować przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.
  6. Resuspender osad komórkowy w 3 ml zimnego buforu do separacji.
  7. Przeprowadzić separację magnetyczną przy użyciu separatora autoMACS ProTM, wybierając program posseld. Zebrać frakcję pozytywną (0,5 ml).

3. Izolacja konwencjonalnych komórek dendrytycznych (cDC)

  1. Inkubować zawiesinę wzbogaconą w komórki CD11c-dodatnie z przeciwciałami anty-CD11c PE-Cy7 oraz anty-I-A/I-E (MHC-II)-FITC przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Optymalne stężenie przeciwciał wynosi 0,5 μg/ 106 komórek.
  2. Przemyć komórki zimnym PBS/0,5% BSA i wirować przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4 °C. Resuspendować komórki w 0,5 ml PBS/0,5% BSA i przefiltrować je przez nylonowe sito o oczkach 40 μm.
  3. Przeprowadzić sortowanie komórek przy użyciu sortera komórkowego FACS Aria w trybie czystości (purity mode). Do probówek odbiorczych dodać 100 μl PBS/0,5% BSA, aby zapobiec uszkodzeniu oczyszczonych komórek. Przez cały proces sortowania utrzymywać komórki w temperaturze chłodniczej.

4. Alternatywny protokół otrzymywania zawiesiny pojedynczych komórek i wzbogacania populacji komórek CD11c+

  1. Zamiast dysocjatora gentleMACS, rozdrobnioną tkankę płuc z kroku 1.5 można przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml roztworu kolagenazy na jedno płuco i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Co 15 minut należy wymieszać komórki na wirówce typu vortex, aby resuspenderć fragmenty tkanki. Tkankę należy rozbić, przepuszczając próbkę 6-8 razy przez strzykawkę 3 ml z igłą 20 G. Podczas tego procesu należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza, w przeciwnym razie przeżywalność komórek zostanie obniżona. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek należy przejść do kroku 1.8.
  2. Zamiast separatora AutoMACSProTM, izolację magnetyczną w celu wzbogacenia populacji komórek CD11c można przeprowadzić, przepuszczając zawiesinę komórek ręcznie przez dwie kolumny MACS. Wybór odpowiednich kolumn zależy od wielkości próbki.

5. Reprezentatywne wyniki:

Konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC) płuc są identyfikowane jako populacja komórek CD11chi/MHC-IIhi. Jak pokazano na Rys. 1, cDC stanowią niewielki odsetek wynoszący 1,4% w porównaniu z niektórymi innymi tkankami, takimi jak śledziona (4,8%). Jednak w przeciwieństwie do śledziony, komórki płuc dodatnie pod względem CD11c wykazują różny poziom ekspresji MHC-II, w tym populację komórek inną niż cDC. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczych komórek, całkowita liczba uzyskanych komórek płuc wynosiła około 3,0 do 3,8 x 107 komórek/płuco przy żywotności na poziomie 60-70%, z czego nieco ponad 1% stanowił podzbiór cDC. Procent ten wzrósł po magnetycznej izolacji CD11c, gdzie całkowita liczba cDC płuc zwiększyła się około 10-krotnie (>16%) w stosunku do pierwotnego preparatu (Rys. 2A). Jednak komórki CD11c wykazujące niską ekspresję MHC-II (CD11chi/MHC-IIlo, makrofagi) stanowiły znaczną populację zanieczyszczeń (>70%), która była zmieszana z podzbiorem cDC płuc. Jak pokazano na Rys. 2B, komórki te zostały usunięte na etapie sortowania komórek, w wyniku czego czystość cDC osiągnęła poziom >96%. Typowa liczba uzyskanych cDC po całej procedurze wynosiła 5 x 104 komórek/płuco. Mikrofotografie przedstawiają cechy morfologiczne cDC jako komórki zaokrąglone z typowymi dendrytami (panel górny). Z kolei CD11chi/MHC-IIlo reprezentowały morfologicznie odmienny podzbiór wykazujący wypustki komórkowe typowe dla makrofagów (MΦ, panel dolny) 12.

Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję CD11c vs. MHC-II w analizie cDC z płuc i śledziony.
Rycina 1. Różnice w częstości występowania DC w płucach i śledzionie myszy. Tkankę płuc i śledziony myszy C57BL/6 pobrano i poddano działaniu kolagenazy. Po trawieniu kolagenazą komórki barwiono przeciwciałami anti-mouse CD11c-PE-Cy7 oraz anti-mouse I-A/I-E-FITC. Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiają procentowy udział cDC (CD11chi/MHC-IIhi) w płucach i śledzionie.

Schemat izolacji magnetycznej z wykresami cytometrii przepływowej CD11c/MHC-II, wynikami sortowania komórek oraz morfologią cDC.
Rysunek 2. Izolacja cDC z płuc myszy. Zawiesina pojedynczych komórek z płuc myszy została znakowana mikrocząsteczkami anty-CD11c i przepuszczona przez automatyczny separator komórek. A) Reprezentatywny wykres przedstawia procentowy udział populacji cDC (CD11chi/MHC-IIhi) oraz makrofagów (MΦ, CD11chi/MHC-IIlo) po wzbogaceniu w CD11c. Dalsze barwienie frakcji wzbogaconej przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-mysich CD11c-PE-Cy7 oraz anty-mysich I-A/I-E-FITC. Komórki podwójnie dodatnie zostały posortowane i przeanalizowane metodą cytometrii przepływowej. W celu oceny ich morfologii komórki poddano wirowaniu na szkiełku i zabarwiono zmodyfikowaną metodą Wright-Giemsa. B) Reprezentatywne wykresy pokazują procentowy udział cDC i MΦ po sortowaniu komórek. Mikrofotografie przedstawiają reprezentatywny obraz cDC i MΦ z płuc. Pasek skali = 20 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek dendrytycznych (DC) z płuc myszy jest istotną techniką w badaniu szerokiego zakresu bodźców oddechowych. Proces pozyskiwania tych komórek obejmuje krytyczne etapy, które zapobiegają utracie komórek, a także chronią ich żywotność i czystość. Perfuzja płuc przed pobraniem pomaga usunąć komórki obwodowe oraz zmniejszyć ilość zanieczyszczających erytrocytów. Zastosowanie automatycznej dysocjacji może być korzystne przy przetwarzaniu dużej liczby płuc; w przeciwnym razie można wybrać alternatywny protokół, pa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Marilyn Dietrich z LSU Flow Cytometry Core Facility za pomoc w sortowaniu komórek oraz Peterowi Mottramowi za pomoc w wykonaniu mikrofotografii. Praca ta była finansowana przez Flight Attendant Medical Research Institute, w ramach LSU-Competitive Research Program Award oraz z grantów NIH/NIAID P20 RR020159 i R03AI081171.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bufor lizujący ACKInvitrogenD6-0005DG
Przeciwciało przeciwko mysiemu CD11c (HL3)BD Biosciences5580979sprzężony z PE-Cy7
Przeciwciało przeciw mysiej I-A/I-E (269)BD Biosciences553623sprzężony z FITC
Kolagenaza typu 1ASigma-Aldrich9891-500MG
Sita do oddzielania komórekBD Biosciences352340, 352360
Mikrokule CD11c (N418)Miltenyi Biotec130-052-001
DNaza ISigma-AldrichD5025-150KU
Hank’zrównoważony roztwór soliInvitrogen14170
Roztwór buforu HepesInvitrogen15630
Szalki Petri 60 mmBD Biosciences351016
GentleMACS™ probówki CMiltenyi Biotec130-093-237
Gentle MACS dissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
AutoMACS-Pro™Miltenyi Biotec130-092-545
FASCS AriaBD Biosciences

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
  2. Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
  4. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
  5. Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
  6. Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
  7. Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
  8. Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
  9. Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
  10. Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
  11. Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
  12. Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
  13. Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
  14. Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

tkanka p uc myszytrawienie kolagenazmagnetyczna izolacja kom reksortowanie cytometrycznekom rki CD11c dodatniekonwencjonalne kom rki dendrytyczneMHC klasy IIzawiesina pojedynczych kom rekproces sortowania kom rek

Powiązane artykuły