Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.
Artykuł metodologiczny
Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.
Komórki dendrytyczne (DC) płuc odgrywają fundamentalną rolę w wykrywaniu naciekających patogenów 1,2, a także w kontrolowaniu odpowiedzi tolerogennych 3 w drogach oddechowych. U myszy opisano co najmniej trzy główne podgrupy komórek dendrytycznych płuc: konwencjonalne DC (cDC) 4, plazmacytoidalne DC (pDC) 5 oraz produkujące IFN killer DC (IKDC) 6,7. Podgrupa cDC jest najliczniejszą podgrupą DC w płucach 8.
Powszechnie stosowanym markerem służącym do identyfikacji subpopulacji komórek DC jest CD11c, integryna transbłonowa typu I (β2), która jest również ekspresjonowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile i niektóre limfocyty B 9. W niektórych tkankach wykorzystanie CD11c jako markera do identyfikacji mysich komórek DC jest zasadne, jak na przykład w śledzionie, gdzie większość komórek CD11c+ reprezentuje subpopulację cDC wykazującą wysoką ekspresję głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC-II). Jednak płuca są tkanką bardziej heterogenną, w której obok subpopulacji DC występuje wysoki odsetek odrębnej populacji komórek wykazujących wysoką ekspresję CD11c, lecz niską ekspresję MHC-II. Na podstawie charakterystyki, a przede wszystkim ekspresji F4/80, markera makrofagów śledzionowych, populacja komórek płuc CD11chiMHC-IIlo została zidentyfikowana jako makrofagi płucne 10, a w nowszych badaniach jako potencjalny prekursor DC 11.
W przeciwieństwie do mysich pDC, badanie specyficznej roli cDC w płucnej odpowiedzi odpornościowej było ograniczone ze względu na brak specyficznego markera, który pomógłby w izolacji tych komórek. Dlatego w niniejszej pracy opisujemy procedurę izolacji wysoko oczyszczonych cDC z płuc myszy. Izolacja subpopulacji DC z płuc stanowi bardzo użyteczne narzędzie do poznania funkcji tych komórek w odpowiedzi na patogeny układu oddechowego, a także czynniki środowiskowe, które mogą wywołać odpowiedź odpornościową gospodarza w płucach.
1. Perfuzja płuc i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Izolacja komórek dendrytycznych (DC) z płuc myszy jest istotną techniką w badaniu szerokiego zakresu bodźców oddechowych. Proces pozyskiwania tych komórek obejmuje krytyczne etapy, które zapobiegają utracie komórek, a także chronią ich żywotność i czystość. Perfuzja płuc przed pobraniem pomaga usunąć komórki obwodowe oraz zmniejszyć ilość zanieczyszczających erytrocytów. Zastosowanie automatycznej dysocjacji może być korzystne przy przetwarzaniu dużej liczby płuc; w przeciwnym razie można wybrać alternatywny protokół, pa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Autorzy chcieliby podziękować Marilyn Dietrich z LSU Flow Cytometry Core Facility za pomoc w sortowaniu komórek oraz Peterowi Mottramowi za pomoc w wykonaniu mikrofotografii. Praca ta była finansowana przez Flight Attendant Medical Research Institute, w ramach LSU-Competitive Research Program Award oraz z grantów NIH/NIAID P20 RR020159 i R03AI081171.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| bufor lizujący ACK | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Przeciwciało przeciwko mysiemu CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | sprzężony z PE-Cy7 |
| Przeciwciało przeciw mysiej I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | sprzężony z FITC |
| Kolagenaza typu 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Sita do oddzielania komórek | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| Mikrokule CD11c (N418) | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNaza I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’zrównoważony roztwór soli | Invitrogen | 14170 | |
| Roztwór buforu Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Szalki Petri 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ probówki C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie