$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Konstrukcja mikronapędu
Wszystkie napędy są zbudowane z tych samych podstawowych elementów: części ruchomej, która przenosi elektrodę, oraz części stałej, przymocowanej do czaszki. Idealny mikronapęd umożliwia płynny, lecz wystarczająco długi ruch elektrody w wielu małych krokach, jest na tyle wytrzymały, aby zapobiec przypadkowemu przesunięciu elektrody, łatwy w obsłudze przez eksperymentatora bez zakłócania zachowania zwierzęcia, a także niewielki i lekki. W wyniku tych przeciwstawnych wymagań różne rodzaje napędów są dostosowane do różnych zastosowań.
Do budowy naszego podstawowego napędu potrzebne są tylko 4 elementy: mosiężna śruba z płaskim łbem, dopasowana nakrętka, plastikowy mostek wykonany z pojedynczego rzędu listwy pinów oraz dwie mosiężne płytki docięte na zamówienie.
- Odłam 3-pinowy fragment listwy z pinami
- Ostrożnie wyciągnij środkowy pin.
- Powiększ otwór, wiercąc w nim wiertłem o rozmiarze #55.
- Nawierć gwint za pomocą gwintownika 00-90.
- Wytnij dwa elementy z mosiężnej płytki.
- Wygładź krawędzie płytek za pomocą narzędzia Dremel.
- Wywierć otwór na środku obu elementów, używając wiertła o rozmiarze #65.
- Złóż elementy napędu tak, aby mosiężne płytki dotykały pinów. W tym celu przełóż mosiężną śrubę kolejno przez mosiężną płytkę, otwór w gwintowanym pinie listwy, drugą mosiężną płytkę i nakrętkę. Delikatnie dokręć śrubę, aby zespół stał się stabilny.
- Przylutuj końce pinów do mosiężnych płytek.
- Opiłuj wystający koniec śruby.
- Przylutuj nakrętkę do śruby. Należy uważać, aby nie przylutować nakrętki do mosiężnej płytki.
- Przetestuj ruch napędu: obróć śrubę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby unieść plastikowy mostek.
2. Przygotowanie sondy krzemowej
Przed zamocowaniem sondy do napędu należy nałożyć dodatkową izolację na obszar połączeń sondy, aby zapobiec powstawaniu zwarć spowodowanych obecnością płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) lub wilgoci:
- Odważyć i wymieszać składniki elastomeru Sylgard w stosunku 10:1.
- Za pomocą zaostrzonego aplikatora bawełnianego nanieść Sylgard na górną końcówkę sondy.
- Suszyć w piekarniku wstępnie nagrzanym do 60°C przez 2 godziny.
Aby upewnić się, że miejsca rejestracji są wolne od zanieczyszczeń, należy oczyścić końcówki sond:
- Przygotować 4% roztwór detergentu Contrad.
- Moczyć sondę w detergencie w temperaturze 63°C przez co najmniej 2 godziny.
- Wypłukać detergent, wielokrotnie zanurzając sondę w wodzie destylowanej.
Przed przymocowaniem sondy do napędu należy sprawdzić impedancję każdego miejsca rejestracji:
- Zanurz sondę w 0,9% soli fizjologicznej i podłącz ją do impedancjometru. Jeśli zbyt wiele miejsc rejestracji wykazuje nieprawidłową impedancję, powtórz kroki 2.4-2.6 lub rozważ użycie innej sondy. W tym przypadku wykorzystano moduł kondycjonowania impedancji Impedance Conditioning Module firmy Frederick Haer, Co. (FHC) w połączeniu z własnoręcznie wykonanym selektorem kanałów. Alternatywnie, urządzenie niPOD firmy NeuroNexus, Inc. lub NanoZ firmy Neuralynx, Inc. umożliwia jednoczesne monitorowanie impedancji wszystkich kanałów sondy.
3. Mocowanie sondy do mikrosnapowca
- Za pomocą żyletki należy naciąć wiele rowków na mostku, aby stworzyć chropowatą powierzchnię.
- Przyłóż sondę do mostka napędu. Procedurę tę najlepiej przeprowadzić pod mikroskopem operacyjnym, trzymając napęd w zacisku i regulując sondę za pomocą mikromanipulatora w taki sposób, aby trzpienie były idealnie równoległe do śruby napędowej. Zapewnia to, że podczas wprowadzania trzpienie sondy wnikają w tkankę mózgową, nie „rozcinając” jej. Na tym etapie należy określić dokładną głębokość końcówek sondy względem podstawy napędu, biorąc pod uwagę głębokość struktury docelowej od powierzchni czaszki.
- Następnie sondę mocuje się do mostka za pomocą cementu grip.
- Opcjonalnie: w celu wizualizacji toru sondy w mózgu, na tym etapie do tylnej części sondy można nanieść roztwór DiI (1-2% rozcieńczony w etanolu).
4. Przygotowanie czaszki
Przed operacją przygotowuje się elektrody referencyjną i uziemiającą oraz elementy klatki Faradaya zakładanej na głowę:
- Odetnij dwa odcinki drutu miedzianego o długości 2" i przylutuj końcówkę każdego izolowanego drutu miedzianego na około 1 mm.
- Za pomocą igły zeskrob powłokę z łba śruby ze stali nierdzewnej 00-90, 1/8", a następnie przylutuj do niej jeden odcinek drutu miedzianego. Lutowanie takich uziemiających elektrod ze śrub ze stali nierdzewnej wymaga zastosowania odpowiedniego topnika (np. N-3 All purpose flux firmy La-Co) oraz wysokiej temperatury grota lutownicy. Należy uważać, aby lut nie dostał się do rowka śruby. Element ten będzie służył jako elektroda uziemiająca. Powtórz czynność z drugą śrubą i drutem miedzianym, aby przygotować elektrodę odniesienia.
- Wytnij trapezoidalne kawałki z siatki miedzianej. Elementy te zostaną zmontowane w celu ochrony stopnia wejściowego wzmacniacza.
Instrumenty chirurgiczne i przygotowanie są takie same, jak w przypadku wielu operacji u małych zwierząt. Cały zabieg przeprowadzono w głębokiej anestezji izofluranem, w warunkach aseptycznych, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi NIH. Należy pamiętać, że operacja (pozorna) pokazana w tym filmie służy wyłącznie celom demonstracyjnym. Ze względu na odpowiednią widoczność i potrzeby filmowania, niektóre kroki przygotowawcze, środki ostrożności chirurgiczne oraz procedury pooperacyjne nie zostały pokazane/nie są widoczne lub nie zostały omówione.
Przed operacją wszystkie komponenty i materiały powinny zostać poddane sterylizacji zgodnie z odpowiednimi procedurami (patrz: Wytyczne dotyczące operacji na gryzoniach w celu ich przeżycia; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Podczas zabiegu przygotowuje się sterylne pole na czaszce, które następnie izoluje się za pomocą jałowych obłożeniami. Po zakończeniu operacji miejscowo podaje się antybiotyk o szerokim spektrum działania, a domięśniowo lek przeciwbólowy o przedłużonym działaniu (np. buprenorfina, [Buprenex] 0,05 mg/kg). Dodatkowo w wodzie pitnej podaje się lek przeciwbólowy (np. ibuprofen) w dawce około 60 mg/kg/24 h przez 5 dni. W celu prawidłowego przeprowadzenia procedur chirurgicznych i anestezjologicznych należy skonsultować się z odpowiednimi źródłami12.
- Umieść zwierzę w aparacie stereotaksycznym, ogól i oczyść skórę głowy13.
- Nacinaj skórę wzdłuż linii środkowej i odsunij skórę głowy. Usuń okostną, a następnie oczyść i osusz czaszkę.
- Zmeasurej położenie i odległość między bregma a lambda, a następnie wyznacz odpowiednio współrzędne x i y miejsca implantacji sondy, korzystając z atlasu stereotaksycznego14. Zaznacz to miejsce, wydrapując skalpelem krzyżyk na czaszce.
- Wywierć otwory w czaszce za pomocą wiertła z okrągłym ostrzem (rozmiar ¼) i wkręć śruby stabilizujące (stal nierdzewna, 000-120, 1/16") do połowy w kość, w różnych płytkach kostnych na górze i po bokach czaszki. Śruby te posłużą jako kotwice do bezpiecznego przymocowania wysięgników do czaszki.
- Wywierć otwory nad móżdżkiem i wprowadź elektrody uziemiające oraz referencyjne przygotowane w kroku 4.2. W przypadku rejestracji lokalnych potencjałów polowych (LFP), wybór miejsca referencyjnego jest krytyczny. Miejsce to wybrano, ponieważ LFP móżdżku jest najniższe spośród wszystkich obszarów kory, a artefakty mięśniowe w tej lokalizacji na linii środkowej są minimalne.
- Nałóż aktywator dentynowy (zestaw Metabond) za pomocą małego pędzelka na całą powierzchnię czaszki. Przepłucz go 0,9% solą fizjologiczną.
- Nałóż cement dentystyczny (zestaw Metabond; mieszać zgodnie z instrukcją producenta) na czaszkę, starannie pokrywając śruby kotwiczące oraz elektrody uziemiające i referencyjne, pozostawiając jednak wolne miejsce implantacji sondy.
- Przymocuj cztery płaty z miedzianej siatki (przygotowane w kroku 4.3) do czaszki. W tym celu przyklej cementem wąską podstawę każdego z nich do przedniej, lewej, prawej i tylnej części czaszki. Miedź nigdy nie powinna mieć bezpośredniego kontaktu z kością, lecz zawsze być oddzielona warstwą cementu.
5. Przygotowanie powierzchni mózgu
- Używając wiertła o okrągłym ostrzu, wykonaj wiercenie wokół miejsca implantacji w wielu etapach, często nawadniając kość solą fizjologiczną.
- Ostrożnie usuń płat kostny i przepłucz powierzchnię mózgu.
- W celu wprowadzenia sondy wielołamowej należy usunąć większy fragment opony twardej. Do usunięcia opony twardej potrzebne są dwa narzędzia: skalpel oraz haczyk wykonany z igły entomologicznej (alternatywnie standardowa wolframowa mikroelektroda). Zegnij końcówkę igły, dociskając ją do twardej powierzchni (np. szkiełka przedmiotowego), a następnie przymocuj ją do uchwytu (w tym przypadku kawałka drewnianego patyczka higienicznego; alternatywnie można użyć uchwytu do igieł mikrodysekcyjnych).
- Podnieś oponę twardą za pomocą haczyka i przetnij ją skalpelem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opony miękkiej, naczyń krwionośnych oraz powierzchni neokory. Niewielkie krwawienie można opanować poprzez nawadnianie solą fizjologiczną. W przypadku wystąpienia silnego krwawienia lub jakiegokolwiek uszkodzenia neokory należy rozważyć przerwanie operacji i przygotowanie innego zwierzęcia.
6. Implantacja sondy
Na tym etapie dokładnie ocenia się gęstość i orientację naczyń powierzchni kory. Współrzędne stereotaktyczne należy skorygować, ponieważ sonda musi wniknąć do mózgu w obszarze wolnym od większych naczyń.
W celu implantacji zespół napędowy można utrzymać za pomocą klipsa krokodylka przymocowanego do uchwytu stereotaktycznego. Nieprzerwana widoczność powierzchni mózgu oraz końcówek sondy jest kluczowa dla prawidłowej penetracji.
- Powoli opuść sondę do wysokości około 1 mm nad zamierzonym celem, stale nawilżając miejsce kraniotomii solą fizjologiczną. W przypadku rejestracji z nowokory, końcówki sondy należy opuścić do kory na głębokość około 0,5 mm, a następnie podnieść z powrotem w okolice powierzchni.
- Uszczelnij otwór kraniotomii, nakładając za pomocą igły ciepłą, roztopioną mieszaninę wosku i oleju parafinowego (10-20 g wosku w 10 mL oleju parafinowego, podgrzewane do 65°C). Przed aplikacją schłodź mieszaninę do 30°C i sprawdź jej gęstość. Powinna być na tyle miękka, aby umożliwić swobodny ruch sondy. Aby zapewnić pełne pokrycie, mieszaninę można roztopić in situ, zbliżając końcówkę mikro-kauteryzatora do stwardniałego wosku.
- Przymocuj dół napędu do czaszki za pomocą cementu dentystycznego (grip cement), dbając o to, aby nakrętka mogła się swobodnie obracać. Na tym etapie niezwykle ważne jest uniknięcie jakiegokolwiek przypadkowego uderzenia w napęd, w przeciwnym razie sonda uszkodzi korę. Po zabezpieczeniu napędu do czaszki należy zweryfikować płynność ruchu sondy.
- Przyklej część z konektorem sondy do czaszki.
7. Budowa klatki Faradaya montowanej na głowie
- Podnieść i złożyć miedziane siatkowe klapy w cylinder ochronny wokół sondy i napędu. Cylinder służy również jako ekran elektryczny przeciwko zakłóceniom środowiskowym oraz artefaktom wolnych fal generowanym przez naładowane wibrysy u zachowującego się zwierzęcia.
- Dostosować wysokość cylindra, odcinając nadmiar materiału tak, aby miedziana siatka znajdowała się na poziomie górnej krawędzi złącza sondy.
- Przylutować przewody ze śrub referencyjnej i uziemiającej do odpowiednich pinów złącza. Przylutować również do siebie sąsiednie klapy miedzianej siatki, aby zapewnić ciągłość elektryczną, a następnie przylutować przewód uziemiający do miedzianej siatki.
- Nałożyć warstwę kleju modelarskiego na miedzianą siatkę, aby ją wzmocnić i zapobiec bezpośredniemu kontaktowi metalu ze skórą zwierzęcia. Opcjonalnie można nałożyć warstwę żywicy epoksydowej w celu dodatkowego wzmocnienia opaski na głowę.
- Przetestować ruch śruby napędowej.
- Przykryć górną część opaski na głowę kawałkiem wyciętym z gumowej rękawiczki.
8. Rejestracja u zwierzęcia swobodnie poruszającego się
- Po zapewnieniu odpowiedniej opieki pooperacyjnej podłącz zwierzę do systemu rejestracji, używając przedwzmacniacza głowicowego o wysokiej impedancji oraz lekkiego, ultrelelastycznego kabla wielożyłowego. Zrównoważ wagę zestawu głowicowego.
- Codziennie testuj jakość rejestracji w klatce domowej. Położenie miejsc rejestracji ocenia się na podstawie wzorców wyładowań jednostek oraz kształtu lokalnych potencjałów polowych. Stopniowo obniżaj sondę, obracając śrubą o małe wartości (zazwyczaj od 1/8 do 1/4 obrotu na dobę, tj. 35-70 micrometers), aż do osiągnięcia docelowej struktury.
9. Reprezentatywne wyniki
Sygnały elektrofizjologiczne (potencjał pola lokalnego oraz aktywność jednostek) różnią się w zależności od rejestrowanej struktury i aktualnego zachowania zwierzęcia. Rysunek 1 przedstawia przykłady 32-kanałowych zapisów z obszaru CA1 hipokampa podczas eksploracji otwartej przestrzeni przez szczura. Należy zwrócić uwagę na wyraźną oscylację potencjału pola lokalnego o częstotliwości 8 Hz (pasmo theta) podczas eksploracji, z nałożonymi impulsami na wielu trzpieniach i w wielu miejscach (przykłady impulsów wskazane grotami strzałek). Aby przeanalizować aktywność jednostek neuronalnych, impulsy są wykrywane i sortowane na pojedyncze jednostki przy użyciu analizy skupień ich kształtów fal15-16.
Rycina 1. Rejestracje z obszaru CA1 hipokampa u szczura podczas zachowania z wykorzystaniem sondy krzemowej o układzie 4 shanks x 8 sites. Rejestracje są szerokopasmowe i próbkowane z częstotliwością 20 000 Hz, co pozwala na badanie zarówno oscylacji lokalnego potencjału polowego (np. rytmu 8 Hz w pasmie „theta”), jak i aktywności impulsowej neuronów.
Tabela 1. Alternatywy dla użytych odczynników i sprzętu. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
