Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Streszczenie

Istnieje duże zainteresowanie peptydami, które łatwo przenikają przez błony komórkowe bez udziału receptorów błonowych¹. Wiele z nich określa się mianem peptydów penetrujących komórki, które często wskazuje się jako potencjalne wektory dostarczania leków^1-3. Ponadto rośnie zainteresowanie peptydami przeciwdrobnoustrojowymi, które działają poprzez niemembranowe mechanizmy lityczne^4,5, w szczególności tymi, które przenikają przez błony bakteryjne bez wywoływania lizy komórkowej i zabijają komórki poprzez zakłócanie procesów wewnątrzkomórkowych^6,7. W rzeczywistości autorzy coraz częściej wskazują na związek między peptydami penetrującymi komórki a peptydami przeciwdrobnoustrojowymi^1,8. Dogłębne zrozumienie procesu translokacji przez błony oraz związku między strukturą peptydu a jego zdolnością do translokacji wymaga skutecznych i powtarzalnych testów translokacji. Kilka grup zaproponowało metody pomiaru translokacji do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych (LUVs)^9-13. LUVs stanowią użyteczne modele błon komórkowych bakterii i eukariontów i są często wykorzystywane w badaniach fluorescencyjnych peptydów^14,15. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie metody opracowanej pierwotnie przez Matsuzakiego i współpracowników do badania peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak magainina i buforyna II^16,17. Oprócz przedstawienia protokołu tej metody, prezentujemy również proste podejście do analizy danych, które pozwala ilościowo określić zdolność do translokacji przy użyciu tego testu. Zaletą tego testu translokacji w porównaniu z innymi jest potencjalna możliwość uzyskania informacji o szybkości translokacji przez błonę oraz brak konieczności dodawania znacznika fluorescencyjnego, który może zmieniać właściwości peptydów¹⁸, w przypadku peptydów zawierających tryptofan. W skrócie, zdolność do translokacji do pęcherzyków lipidowych jest mierzona jako funkcja transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) między natywnymi resztami tryptofanu a dansylowaną fosfatydyloetanolaminą, gdy białka są związane z zewnętrzną błoną LUV (Rycina 1). Peptydy penetrujące komórki są rozszczepiane w momencie zetknięcia z nieinhibowaną trypsyną zamkniętą w LUVs, co prowadzi do dysocjacji z błony LUV i spadku sygnału FRET. Spadek sygnału FRET obserwowany dla peptydu translokującego jest znacznie większy niż ten obserwowany dla tego samego peptydu, gdy LUVs zawierają zarówno trypsynę, jak i inhibitor trypsyny, lub gdy peptyd, który nie przenika samoistnie przez błony lipidowe, jest wystawiony na działanie LUVs zawierających trypsynę. Ta zmiana fluorescencji zapewnia bezpośrednią kwantyfikację translokacji peptydu w czasie.

Protokół

1. Przygotowanie dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych (LUVs)

1. Przygotować LUV, które będą służyć jako imitacje błon komórkowych w analizie¹⁹.
2. Zmieszać fosfatydylocholinę (POPC, 760,10 g/mol), fosfatydyloglicerol (POPG, 770,99 g/mol) oraz 5-dimetylaminonaftalen-1-sulfonyl fosfatydyloetanolaminę (DNS-POPE, 994,350 g/mol) (Avanti Polar Lipids) rozpuszczone w chloroformie w stosunku 50:45:5. Ponieważ każda analiza wymaga oddzielnego przygotowania LUV eksperymentalnych i kontrolnych, należy przygotować dwie fiolki z osadem lipidowym. 0,376 mg całkowitej masy lipidów (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG i 0,019 mg DNS-POPE) jest zazwyczaj wystarczające do otrzymania liczby pęcherzyków niezbędnej do jednej próby translokacji.
3. Odparować chloroform za pomocą strumienia gazu N₂.
4. Suszyć osad lipidowy przez 9–14 godzin w deskatorze próżniowym.
5. Przygotować roztwór buforu HEPES 10 mM (10 mM HEPES, 238,3 g/mol, 45 mM NaCl, 58,44 g/mol, 1 mM EDTA, 372,24 g/mol, pH 7,4). Bufor HEPES przechowywać w temperaturze 4°C.
6. Przygotować roztwór treściwy trypsyny wieprzowej (23,3 kg/mol) o stężeniu 0,4 mM w powyższym buforze HEPES 10 mM. Trypsynę przechowywać w temperaturze -20°C; w naszej praktyce zazwyczaj nie poddaje się ona więcej niż 2 cyklom zamrażania i rozmrażania przed użyciem.
7. Przygotować roztwór treściwy inhibitora trypsyny Bowmana-Birka (8 kg/mol) o stężeniu 4,0 mM w buforze HEPES 10 mM i przechowywać w temperaturze -20°C. W naszej praktyce zapas ten jest uzupełniany co miesiąc i zazwyczaj nie poddaje się więcej niż 3 cyklom zamrażania i rozmrażania przed ponownym przygotowaniem.
8. Rekonstytuować eksperymentalne pęcherzyki wielowarstwowe (MLV) w roztworze trypsyny 0,2 mM, dodając do wysuszonego osadu lipidowego równą objętość roztworu treściwego trypsyny 0,4 mM oraz buforu HEPES 10 mM. Dla pojedynczej próbki o zawartości 0,376 mg całkowitego lipidu wystarczająca jest mieszanina 150 μL roztworu trypsyny i 150 μL buforu HEPES.
9. Rekonstytuować kontrolne MLV w roztworze zawierającym 0,2 mM trypsyny i 2,0 mM inhibitora trypsyny Bowmana-Birka, dodając do wysuszonych osadów lipidowych równą objętość roztworu treściwego trypsyny 0,4 mM i inhibitora trypsyny 4,0 mM. Dla pojedynczej próbki o zawartości 0,376 mg całkowitego lipidu wystarczająca jest mieszanina 150 μL roztworu trypsyny i 150 μL inhibitora trypsyny.
10. Przenieść roztwory MLV z fiolek szklanych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.
11. Poddać roztwory MLV 5 cyklom zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie.
12. Przygotować ekstruder lipidowy (Avanti Polar Lipids), umieszczając dwa zwilżone buforem HEPES wsporniki filtrów na każdym teflonowym elemencie ekstrudera. Pomiędzy dwoma teflonowymi elementami ekstrudera umieścić membranę Nuclepore z trawionymi kanałami o średnicy porów 0,1 μm (Whatman, Wielka Brytania), a następnie umieścić elementy ekstrudera w metalowym kanistrze ekstrudera. Przed dokręceniem metalnej górnej części kanistra ekstrudera i umieszczeniem go w uchwycie, nałożyć pierścieniową przekładkę na oba elementy ekstrudera.
13. Wypełnić wolną przestrzeń w ekstruderze 500 μL buforu HEPES 10 mM za pomocą szklanej strzykawki 250 μL, aby zapobiec utracie próbki pęcherzyków.
14. Wprowadzić każdą próbkę MLV do ekstrudera i przepchnąć próbkę przez membranę co najmniej 21 razy, aby zapewnić jednolity rozmiar pęcherzyków jednowarstwowych. LUV otrzymuje się z roztworu MLV po ekstruzji.
15. Przechowywać LUV w temperaturze 4°C i zużyć w ciągu 48 godzin.

2. Oznaczanie stężenia LUV

1. Stężenie LUV określono poprzez wyznaczenie całkowitej zawartości fosforu w próbce²⁰.
2. Przygotować 8,9 N H₂SO₄ w wodzie nanopure i przechowywać w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować 2,5% w/v roztwór molibdanu amonu(VI) (588,04 g/mol) w wodzie nanopure. Przygotować 10% w/v roztwór kwasu askorbinowego (176,1 g/mol) w wodzie nanopure. Chronić roztwór kwasu askorbinowego przed światłem, owijając probówkę folią. Oba roztwory przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące.
4. Przygotować roztwór buforu fosforanowego 0,65 mM (bezwodny fosforan sodu jednopodstawowy, 120 g/mol).
5. Przygotować sześć probówek ze wzorcami. Standardy powinny zawierać odpowiednio 0,0 μL, 50 μL (0,0325 μmoli), 100 μL (0,065 μmoli), 175 μL (0,114 μmoli), 250 μL (0,163 μmoli) lub 350 μL (0,228 μmoli) roztworu fosforu.
6. Przygotować próbki LUV w trzech powtórzeniach. Każda probka z próbką powinna zawierać około 0,1 μmoli LUV. Stężenia LUV dla próbek doświadczalnych i kontrolnych należy mierzyć oddzielnie.
7. Aby skorygować wpływ ewentualnych wysuszonych soli fosforanowych w proszku inhibitora Bowmana-Birka, należy przygotować próbę ślepą LUV. Próba ślepa powinna zawierać taką samą objętość roztworu trypsyny 0,2 mM/inhibitora Bowmana-Birka 2,0 mM, jaka została dodana do kontrolnej probki LUV.
8. Do każdej z probówek z próbkami, wzorcami i próbami ślepymi wlać 450 μL 8,9 N H₂SO₄.
9. Nagrzewać próbki, wzorce i próby ślepe przez 25 minut w temperaturze 175-210 °C w piecu.
10. Wyjąć wszystkie probówki i pozwolić im ostygnąć. Do każdej z probówek dodać 150 μL 30% H₂O₂.
11. Nagrzewać próbki, wzorce i próby ślepe przez 30 minut w temperaturze 175-210 °C.
12. Zdjąć próbki, wzorce i próby ślepe z ogrzewania. Jeśli którykolwiek z roztworów nie jest jeszcze bezbarwny, dodać 50 μL H₂O₂ do wszystkich probówek i nagrzewać przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 175-210 °C.
13. Do każdej probówki dodać 3,9 mL nanopure H₂O, 0,5 mL roztworu molibdanu amonu i 0,5 mL roztworu kwasu askorbinowego.
14. Nagrzewać wszystkie probówki przez 5-7 minut w kąpieli wodnej o temperaturze wrzenia.
15. Zmierzyć absorbancję każdego wzorca i próbki przy 820 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis Agilent 8453. Probówkę zawierającą 0,0 mmoli fosforu należy wykorzystać jako próbę ślepą dla wszystkich wzorców i doświadczalnych próbek LUV. Probówkę zawierającą roztwór trypsyny 0,2 mM/inhibitora Bowmana-Birka 2,0 mM należy wykorzystać jako próbę ślepą dla kontrolnej próbki LUV.
16. Na podstawie wyników można sporządzić liniową krzywą wzorcową zależności absorbancji od zawartości fosforu, a następnie obliczyć całkowitą zawartość fosforu oraz stężenie LUV w próbkach.

3. Przygotowanie roztworów peptydów

1. Rozpuścić peptyd w wodzie nanopure H₂O. Peptydy stosowane w tym teście, zgodnie z opisem, muszą zawierać jedną resztę tryptofanu.
2. Zmierzyć absorbancję roztworu peptydu przy 282 nm w trzech powtórzeniach. Obliczyć stężenie peptydu, korzystając ze współczynnika ekstynkcji molowej dla tryptofanu wynoszącego 5700 M^-1cm^-1.
3. Rozcieńczyć peptyd w wodzie nanopure do stężenia końcowego 30 μM. Przechowywać w temperaturze -20°C.

4. Kwantyfikacja translokacji

1. Przygotować próbki badawcze i kontrolne w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Do każdego roztworu dodać odpowiednią ilość LUV, aby uzyskać stężenie końcowe 250 μM. Dodać odpowiednią ilość roztworu inhibitora Bowmana-Birka, tak aby stężenie końcowe inhibitora było 10X wyższe niż stężenie trypsyny. Dodać odpowiednią ilość buforu HEPES 10 mM, aby doprowadzić końcową objętość roztworu do 450 μL.
2. Przenieść 50 μL roztworu peptydów do mikrokuwety kwarcowej fluorometru Starna. Stosunek LUV do peptydów jest na tyle wysoki, aby zapewnić, że niemal wszystkie nienaruszone peptydy znajdują się w wystarczającej bliskości grupy dansylowej, by generować sygnał FRET, nawet jeśli żaden z nich nie przeszedł do wnętrza pęcherzyka. Jest to zgodne z podobnym efektem FRET obserwowanym w warunkach kontrolnych dla peptydów, które translokują oraz tych, które nie translokują do pęcherzyków.
3. Dodać próbkę badawczą lub kontrolną do roztworu peptydów w kuwecie. Powinno to doprowadzić do uzyskania końcowego stężenia peptydów wynoszącego 3 μM.
4. Rozpocząć 25-minutowy eksperyment z kinetyki fluorescencji natychmiast po dodaniu badawczego lub kontrolnego roztworu LUV, wykonując pomiar fluorescencji co najmniej raz na sekundę. Ustawić długość fali wzbudzenia na 280 nm, długość fali emisji na 525 nm oraz temperaturę na 25 °C. Korzystając ze spektrofluorometru Cary Eclipse, ustawiono wysoką czułość PMT.

5. Obliczanie ilościowego współczynnika translokacji

1. Zdefiniuj początkową fluorescencję (F_o) jako odczyt fluorescencji po piętnastu sekundach zbierania danych. W naszej konfiguracji urządzenia ustalono, że pierwsze piętnaście sekund zgromadzonych danych fluorescencji jest niewiarygodnych ze względu na mieszanie, zamykanie komory z próbką oraz inne zakłócenia systemu podczas dodawania próbki. Podziel każdy kolejny odczyt przez F_o, aby uzyskać względną fluorescencję (F/F₀) dla każdego punktu czasowego.
2. Oblicz średnią ze wszystkich odczytów względnej fluorescencji z ostatniej minuty eksperymentu, aby uzyskać końcową średnią względną fluorescencję .
3. Podziel dla próbek kontrolnych przez dla próbek eksperymentalnych, aby uzyskać skorygowaną końcową wartość fluorescencji.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia wyniki tego testu dla reprezentatywnego peptydu, który wykazał silną translokację. Sygnał w tym doświadczeniu (czarna linia) wykazuje wyraźny spadek sygnału FRET w czasie. Należy jednak kontrolować potencjalną utratę sygnału FRET wynikającą z niepełnego hamowania trypsyny lub innych czynników niezwiązanych ze zdolnością do translokacji. W tym celu zawsze mierzymy również sygnał FRET pomiędzy peptydem a LUV zawierającymi zarówno trypsynę, jak i inhibitor trypsyny Bowmana-Birka (szara linia, Rysunek 2). W naszej praktyce kluczowe okazało się przeprowadzanie tej kontroli dla każdego peptydu przy każdym wykonaniu eksperymentu. Pozwala nam to precyzyjnie skorygować wszelkie zmiany sygnału wynikające z różnic między preparatami pęcherzyków lipidowych lub szumem aparatury, który może być znaczący w przypadku stosunkowo słabych sygnałów fluorescencyjnych typowo obserwowanych przy tych stężeniach.

Znaczenie eksperymentu kontrolnego z użyciem LUV zawierających inhibitor trypsyny zostało podkreślone przez dane przedstawione na Rysunku 3. W tym przypadku sygnał peptydowy zmalał w stopniu podobnym do tego z Rysunku 2 w próbce badawczej (czarna linia). Jednak w próbce kontrolnej obserwuje się szybszy spadek dla tego peptydu, w związku z czym jego netto translokacja jest niższa.

W sekcji 5 naszego protokołu opisano prostą metodę ilościowego oznaczania translokacji w tym eksperymencie. Wyższe współczynniki translokacji wskazują na peptydy, które translokują efektywnie; współczynnik translokacji dla peptydu przenikającego przez błony komórkowe pokazanego na rysunku 2 wynosi 1,16, podczas gdy peptydy słabo translokujące mają współczynniki translokacji bliższe 1. Z naszego doświadczenia wynika, że błąd standardowy dla trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych z użyciem różnych preparatów pęcherzyków mieści się w zakresie od 0,01 do 0,06.

Rysunek 1. Schemat testu translokacji. Eksperymentalne próbki LUV (A) są domieszkowane fluorescencyjnym dansylowym POPE (czarne paski) i zawierają enkapsulowaną trypsynę (nożyczki). Inhibitor trypsyny (czerwone koło) jest stosowany do hamowania trypsyny poza LUV. LUV są poddane działaniu peptydu (fioletowy). Asocjacja peptydu z błonami LUV generuje sygnał FRET (zielony), który maleje w miarę jak translokujące peptydy napotykają niehamowaną trypsynę wewnętrzną. Zarówno trypsyna, jak i inhibitor trypsyny są enkapsulowane w kontrolnych próbkach LUV (B) w celu zmierzenia spadków sygnału FRET niezwiązanych z translokacją.

Rysunek 2. Reprezentatywne dane dla peptydu przenikającego przez błony komórkowe. Reprezentatywny translokujący peptyd przeciwdrobnoustrojowy wykazuje znaczący spadek sygnału FRET w porównaniu z próbką kontrolną.

Rycina 3. Reprezentatywne dane podkreślające znaczenie kontroli. Niepełne hamowanie trawienia trypsynowego peptydu nietranslokującego prowadzi do spadku sygnału FRET w czasie zarówno w eksperymentalnych, jak i kontrolnych roztworach LUV. Ponieważ różnica między śladami kontrolnymi a eksperymentalnymi jest stosunkowo niewielka, mutant ten został określony jako peptyd słabo translokujący.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do oceny względnej zmiany stężenia peptydów wewnątrz i na zewnątrz pęcherzyków lipidowych. Zmiany te są związane ze zdolnością do translokacji. Protokół ten może służyć do identyfikacji peptydów przenikających przez błony komórkowe o potencjale jako wektory dostarczania leków. Wraz ze wzrostem zainteresowania peptydami przenikającymi przez błony, interesujące będzie obserwowanie, w jaki sposób metody bezpośrednio mierzące zdarzenie translokacji będą rozwijane i stosowane...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16:0-18:1 PG	Avanti Polar Lipid, Inc	840457C
1:18 Dansyl PE	Avanti Polar Lipid, Inc	810330C
16:0-18:1 PC	Avanti Polar Lipid, Inc	850457C
Trypsyna wieprzowa	Sigma-Aldrich	T-0303
Inhibitor trypsyny/chymotrypsyny Bowmana-Birka	Sigma-Aldrich	T-9777
Mini-ekstruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
Molibdan amonu (para)	Alfa Aesar	10811
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A1417
Nadtlenek wodoru, roztwór 30%	Mallinckrodt Baker Inc.	5240-05
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
NaCl	Sigma-Aldrich	S-9625
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S-0751