Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Podsumowanie

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL^® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Streszczenie

Poszukiwane są nowe techniki i metody, aby spróbować wygrać walkę z komarami. Ostatnie postępy w technikach molekularnych doprowadziły do opracowania nowych i innowacyjnych metod kontroli komarów opartych na technice sterylnych owadów (SIT)^1-3. Metoda kontroli znana jako RIDL (uwalnianie owadów przenoszących dominujący gen letalny)⁴ opiera się na SIT, ale wykorzystuje metody genetyczne, aby wyeliminować konieczność sterylizacji radiacyjnej^5-8. Szczep RIDL  Ae. aegypti został pomyślnie przetestowany w warunkach terenowych na Wielkim Kajmanie^9,10; dalsze zastosowania terenowe są planowane lub w toku w innych krajach na całym świecie.

Masowa hodowla owadów została opracowana dla wielu gatunków i osiąga poziomy liczone w miliardach osobników tygodniowo. Jednak w przypadku komarów hodowla była zazwyczaj prowadzona na znacznie mniejszą skalę, a większość wielkoskalowych przedsięwzięć miała miejsce w latach 70. i 80. XX wieku. W programie RIDL pożądane jest uwalnianie jak najmniejszej liczby samic, ponieważ kąsają one i przenoszą choroby. W programie masowej hodowli wyróżnia się kilka etapów produkcji samców przeznaczonych do wypuszczenia: produkcję jaj, hodowlę jaj aż do przepociwienia oraz sortowanie samców od samic przed wypuszczeniem. Samce te są następnie wykorzystywane w programie kontroli RIDL , uwalniane jako poczwarki lub osobniki dorosłe^11,12.

Aby zredukować populację komarów przy użyciu RIDL , konieczne jest wyhodowanie dużej liczby wysokiej jakości osobników dorosłych płci męskiej^13,14. Poniżej opisano metody masowej hodowli OX513A, szczepu RIDL  Ae. aegypti ⁸, przeznaczonego do wypuszczenia, a także techniki niezbędne do produkcji jaj i masowej hodowli samców RIDL  na potrzeby programu kontroli.

Wprowadzenie

Komary przenoszą wiele patogenów, które mogą wywoływać szereg chorób u ludzi, a walka z tymi owadami trwa od stuleci. Strategie kontroli owadów oparte na metodach chemicznych i biologicznych odniosły pewne znaczące sukcesy, jednak w wielu przypadkach kontrola ta nie była zrównoważona w dłuższej perspektywie czasowej. Na przykład Brazylia osiągnęła eradykację Ae. aegypti w latach 50., lecz w ciągu ostatnich 40-50 lat komar ten ponownie zainfekował te tereny. Można to przypisać wielu przyczynom, w tym oporności na insektycydy, zniszczeniu środowiska, wadliwemu wdrażaniu programów kontrolnych ^15-20 oraz szybkiej reinwazji przy braku odpowiedniego monitoringu lub reakcji.

Poszukiwane są nowe techniki i metody, aby spróbować wygrać tę walkę z komarami.  Ostatnie postępy w technikach molekularnych doprowadziły do opracowania nowych i innowacyjnych metod kontroli komarów opartych na technice sterylizacji owadów (SIT)^1-3. Metoda kontroli znana jako RIDL (uwalnianie owadów niosących dominujący gen letalny)⁴ opiera się na SIT, ale wykorzystuje metody genetyczne, aby wyeliminować konieczność sterylizacji radiacyjnej. Linie RIDL skonstruowano dla kilku gatunków szkodników, w tym Ae. aegypti ^5-8, linia RIDL  Ae. aegypti została z sukcesem przetestowana w warunkach polowych na Wielkim Kajmanie^9,10; dalsze zastosowania polowe są planowane lub realizowane w innych krajach na świecie.  Tłumienie populacji komarów przy użyciu RIDL  będzie wymagało hodowli licznej populacji wysokiej jakości dorosłych samców^3,14.

W przypadku programu SIT za pożądane uważa się wypuszczanie wyłącznie samców; samice komarów kąsają i przenoszą choroby. Ponadto wypuszczone sterylne samce mogą być „rozpraszane” przez wypuszczone samice, co obniża skuteczność programu . W dużych eksperymentach polowych z napromieniowanymi muszkami śródziemnomorskimi wykazano, że wypuszczanie wyłącznie samców było od 3 do 5 razy skuteczniejsze niż wypuszczanie osobników obu płci²¹.

W programie masowej hodowli RIDL proces produkcji samców do wypuszczenia składa się z kilku etapów.  Pierwszym z nich jest wytworzenie jaj niezbędnych dla pokolenia przeznaczonego do wypuszczenia (Rycina 1). Następny etap obejmuje hodowlę jaj aż do stadium poczwarek lub osobników dorosłych, z oddzieleniem larw od poczwarek oraz poczwarek samców  od poczwarek samic. Masowa separacja samców od samic wymaga istnienia różnic między płciami na konkretnym etapie rozwoju, które umożliwiają sortowanie na dużą skalę²². U Ae. aegypti (oraz innych gatunków komarów) występuje znaczna różnica w wielkości między poczwarkami samców a samic, co można wykorzystać w technikach separacji płci. Posortowani  samce RIDL są następnie uwalniani w ramach programu kontroli w stadium poczwarki lub osobnika dorosłego^11,12.

Poniżej opisano metody masowej hodowli OX513A, szczepu RIDL  Ae. Aegypti, przeznaczonego do wypuszczenia na wolność. Opisane metody obejmują techniki niezbędne do produkcji jaj oraz samców RIDL  na potrzeby programu kontroli populacji.

Protokół

Wymagania dotyczące insekterium

1. Przegląd

1. Masowa hodowla składa się z kilku faz, z których każda jest przeprowadzana w oddzielnej strefie jednostki hodowlanej. Rysunek 1 przedstawia główne fazy hodowli oraz miejsca, w których odbywają się one w zakładzie masowej hodowli.

2. Kwestie bezpieczeństwa biologicznego w insekterium

1. Projekt został zatwierdzony przez komisję etyki badań nad zwierzętami Uniwersytetu w São Paulo w Brazylii, a wszystkie niezbędne zezwolenia i zgody zostały uzyskane. 
2. System RIDL wykorzystuje letalność warunkową; suplement diety (tetracyklina) zapobiega ekspresji systemu RIDL , umożliwiając masową hodowlę owadów; bez tetracykliny komary giną. Tetracyklina nie występuje w naturalnych miejscach rozrodu Ae. aegypti, więc żadne potomstwo powstałe z osobników, które uciekły, nie przeżyje.  Zapewnia to dodatkowy poziom bezpieczeństwa w porównaniu do stosowania owadów typu dzikiego (WT) sterylizowanych innymi metodami (np. radiacją).
3. W insekterium należy stosować wejście z podwójnymi drzwiami, tabliczki „Wstęp tylko dla osób upoważnionych” oraz siatki przeciw owadom. Wszelkie okna powinny być uszczelnione, aby uniknąć zanieczyszczenia kolonii owadami typu WT i pomóc zapobiec ucieczkom z wnętrza insekterium.
4. Lokalne przepisy i organy nadzorcze mogą mieć specyficzne dodatkowe lub alternatywne wymagania. Należy skontaktować się z odpowiednimi organami w celu uzyskania informacji/wytycznych na wczesnym etapie i uzyskać wszystkie niezbędne zezwolenia i zgody przed wprowadzeniem szczepu RIDL do insekterium.
5. Insekterium do hodowli masowej powinno być wykorzystywane wyłącznie do hodowli RIDL . Nie powinny w nim przebywać żadne inne szczepy ani owady. Ma to na celu uniknięcie zanieczyszczenia szczepu RIDL oraz kontaminacji patogenami, które mogą wpływać na kondycję i przeżywalność, obniżając produktywność i skuteczność wypuszczanych samców.

3. Projekt insektarium

1. Rysunek 2 przedstawia plan insekterium wykorzystywanego w Biofábrica Moscamed w Brazylii.
2. Temperatura we wszystkich pomieszczeniach wynosiła 26 °C ± 2) przy wilgotności względnej około 70-80% i cyklu światło:ciemność 12:12 h z zastosowaniem świetlówek.
3. Ten projekt może być modyfikowany zgodnie z konkretnymi wymaganiami przestrzennymi, np. skala wypuszczeń określi całkowity rozmiar. Jednak produkcja jaj, hodowla i sortowanie, kontrola jakości (QC) oraz wypuszczenia powinny być podzielone na cztery odrębne obszary: kolonię produkcji jaj, generację wypuszczaną, QC oraz magazyn dorosłych osobników do wypuszczenia.
4. Pomieszczenie kolonii produkcji jaj (około 20 m²) służy do produkcji jaj dla generacji wypuszczanej.
5. Obszar kontroli jakości to miejsce, w którym przeprowadza się eksperymenty w celu sprawdzenia procedur i sprawności linii RIDL , w tym pomiarów wskaźnika wyklucia, liczby poczwarek, wielkości poczwarek oraz pomiaru skuteczności sortowania i usuwania samic. Przeprowadzane są również testy na kontaminację WT poprzez sprawdzanie obecności markera fluorescencyjnego i fenotypu przy użyciu testów przesunięcia mierzących śmiertelność.
6. Pomieszczenie generacji wypuszczanej (około 36 m²) wymaga odpowiedniej przestrzeni na tace oraz sortowanie larw i poczwarek. Tace umieszczane są w specjalnie zaprojektowanych aluminiowych regałach. Do hodowli i sortowania wymagany jest duży obszar roboczy i zlewozmywak, a inny duży zlewozmywak jest niezbędny do mycia tac i klatek. W odpływie ścieków ze zlewozmywaków zamontowano pułapkę z filtrem, aby ograniczyć ucieczkę żywych komarów do kanalizacji. 
7. Woda zużywana do tac jest odprowadzana przez odpływ, który posiada komorę z siatką zapobiegającą ucieczce owadów na każdym etapie rozwoju.
8. Wymagany jest obszar do przechowywania dorosłych osobników do wypuszczenia (Magazyn dorosłych osobników do wypuszczenia, Rysunek 2) zawierający regały do przechowywania urządzeń wypuszczających, podczas gdy osobniki dorosłe dojrzewają przed wypuszczeniem.

Metody produkcji dla masowej hodowli RIDL:

Kolonia Produkcji Jaj produkuje jaja, które są wykorzystywane w Generacji Uwalniania (Rysunek 1) do uzyskania osobników dorosłych. Istnieje wiele podobieństw między obiema metodami hodowli, ale występują również wyraźne różnice. Procesy hodowlane, które są identyczne dla obu procedur, opisano wyłącznie w sekcji Kolonia Produkcji Jaj.

Kolonia produkująca jaja

4. Produkcja larw

Kolonia Produkcji Jaj generuje homozygotyczne jaja RIDL OX513A⁸ przeznaczone do Generacji Uwolnienia. Ścisła kontrola jakości zapewnia żywotność, kondycję oraz integralność szczepu dostarczanych jaj.

1. Bodźcem do wyklucia jest zanurzenie w wodzie o niskim poziomie rozpuszczonego tlenu. Aby obniżyć poziom tlenu w wodzie, należy zagotować wodę, a następnie niezwłocznie przelać 400 ml do szklanych słoików o pojemności 500 ml (obwód otworu 74 mm), szczelnie zakręcić i pozostawić w temperaturze pokojowej na kilka godzin do wystygnięcia.
2. Do słoika z przegotowaną wodą należy włożyć 1 g jaj, ponownie zamknąć i odczekać godzinę. Zawartość należy przenieść do kuwety z 2 L wody i pozostawić na noc w warunkach insektarium.
3. Wyklute larwy należy przenieść do znanej objętości wody i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego z mieszadełkiem przez czas wystarczający do pobrania alikwotów; intensywne lub przedłużone mieszanie uszkadza larwy i powinno być ograniczone do minimum. Standardowa objętość stosowana do wykluwania larw to 1 L, jednak zagęszczenia przekraczające 300 larwy/ml są trudne do przeliczenia i mogą być szkodliwe. Dlatego nie należy wykluwać więcej niż około 300 000 jaj/L wody.
4. Wskaźnik wyklucia należy określić, pobierając trzy alikwoty po 1 ml i umieszczając je na arkuszu papieru chłonnego z siatką kwadratów 1 cm, położonym na chłonnej gąbce w celu wchłonięcia nadmiaru wody.  Należy policzyć liczbę jaj wyklutych i niewyklutych w trzech kwadratach, szukając brakującej pokrywki wyklutego jaja. Oczekiwany wskaźnik wyklucia wynosi około 80-90%.
5. Należy pobrać cztery alikwoty po 1 ml każdy i umieścić je w czterech czarnych łódkach wagowych (larwy są białe, zatem są lepiej widoczne na czarnym tle), a następnie wzrokowo policzyć liczbę żywych larw; zaleca się użycie licznika. Średnia liczba larw na ml jest następnie wykorzystywana do obliczenia objętości wody, którą należy dodać do każdej kuwety, aby uzyskać pożądaną liczbę larw na kuwetę.
6. Między szczepami i gatunkami mogą występować duże różnice w zagęszczeniu, przy którym można hodować larwy. Pożądane jest również porównanie wielkości dorosłych samców RIDL z samcami typu dzikiego; idealnie jest uzyskać samce RIDL o wielkości zbliżonej lub większej, które mogą skutecznie konkurować z samcami dzikimi. W związku z tym dla każdego szczepu RIDL należy określić optymalne zagęszczenie larw, co stanowi kompromis między ograniczeniami przestrzeni hodowlanej a skalą produkcji. Zagęszczenia w zakresie 0,1-2,5 larwy/ml okazały się  dobrym połączeniem wydajności produkcji i jakości; kwestię tę omówił również Medici²³.
7. Larwy należy przenieść do kuwet. W naszej placówce stosujemy kuwety o wymiarach około 53 cm x 37 cm  x 8 cm (D x Sz x W) i dodajemy wymaganą ilość wody, aby osiągnąć zagęszczenie larw niezbędne do produkcji.
8. Do kuwet należy dodać roztwór stokowy tetracykliny (3 mg/ml w wodzie) w rozcieńczeniu 1:100, aby uzyskać wymaganą stężenie końcowe 30 µg/ml.
9. Larwy należy codziennie karmić pokarmem dla ryb w płatkach (www.sera.de), który został rozkruszony na drobny proszek. Tabela 1 przedstawia typowy schemat żywienia w mg pokarmu na larwę na dzień. Larwy należy karmić aż do odpowiedniego dnia sortowania w warunkach insektarium opisanych powyżej.

5. Sortowanie larw od poczwarek oraz rozdzielanie poczwarek męskich i żeńskich

1. 8 dni po wykluciu oddziel larwy od poczwarek. Następnie przeprowadź segregację poczwarek ze względu na płeć w celu wyselekcjonowania samców. Urządzenie znane jako separator płytowy^24,25 umożliwia oddzielenie larw od poczwarek samców oraz poczwarek samic. Rycina 3 ilustruje zastosowanie tego separatora płytowego do oddzielenia larw od poczwarek samców i samic.
2. Używając łyżki mierniczej z sitkiem na dnie, skalibruj ją przy użyciu 500 lub więcej poczwarek, a następnie wykorzystaj ją do przygotowania klatek i oszacowania całkowitej liczby wyprodukowanych poczwarek samców i samic.
3. W pierwszym dniu segregacji (dzień 8.) większość poczwarek to samce; należy zatem umieścić posegregowane larwy z powrotem w tacy i hodować je do następnego dnia, kiedy większość poczwarek to samice (Rycina 4).
4. Powtarzaj proces segregacji każdego dnia zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.3, aż wszystkie larwy przejdą w stadium poczwarki lub do końca tygodnia roboczego.
5. Umieść 1 000 poczwarek samców (używając łyżki mierniczej) w klatce, a w 9. dniu dodaj 3 000 poczwarek samic do tej samej klatki (stosujemy rury PVC o wysokości 30 cm i średnicy 30 cm, przystosowane za pomocą siatki na górze i otworu dostępowego z siatką, ale dostępne są również plastikowe klatki o wymiarach 30 cm x 30 cm x 30 cm firmy BugDorm).
6. Pozostaw dorosłe osobniki do kopulacji przez co najmniej 2 dni i zapewnij im dostęp do roztworu sacharozy (10%) na mokrej wacie ad libitum przed karmieniem krwią. Zbieraj jaja przez dwa tygodnie (~dwa cykle gonotroficzne) przy dwóch karmieniach krwią w tygodniu. Pozwala to uzyskać średnio 143 000 jaj z klatki zawierającej 3 000 samic (średnio 48 jaj/samicę). Aby uzyskać 4 miliony jaj tygodniowo, każdego tygodnia należy przygotować około 28 klatek.

6. Karmienie krwią

1. System podawania na płycie aluminiowej zapewnia dostarczanie krwi do klatek dwa razy w tygodniu. Po jednej stronie płyty aluminiowej (10 cm x 10 cm x 3 mm) tworzy się zbiorniczek z krwią za pomocą Parafilmu (Rycina 5). Aby pobudzić owady do żerowania, krew jest podgrzewana poprzez umieszczenie nagrzanego woreczka z ziarnami na górze podajnika. Woreczek składał się z około 250 g ziaren pszenicy w materiałowej osłonce, którą podgrzewano przez około 10 sec w kuchence mikrofalowej. Krew wykorzystywana do karmienia pochodzi z lokalnej rzeźni; ponieważ zwierzęta te (głównie kozy i owce) są przeznaczone do spożycia przez ludzi, przechodzą badania w celu wykluczenia obecności patogenów.
2. Trzy dni po karmieniu krwią udostępnia się samicom miejsce do składania jaj. Miejsce to stanowi okrągły plastikowy pojemnik wypełniony wodą do około ¼ wysokości, z papierem filtracyjnym pokrywającym wnętrze. Po dwóch dniach miejsce składania jaj jest usuwane. Aby uzyskać maksymalną produkcję jaj, należy upewnić się, że papier filtracyjny pokrywa całą dostępną powierzchnię wewnątrz pojemnika i pozostaje wilgotny.
3. Należy wyjąć papier z jajami i położyć go na papierze chłonnym do wyschnięcia w warunkach insektarium; jaja wymagają okresu kondycjonowania przy wysokiej wilgotności (powyżej 70%) przez co najmniej 48 hr po złożeniu. Jaja mogą pozostawać w insektarium do 3 miesięcy przy minimalnym spadku odsetka wylęgnięć, pod warunkiem utrzymania wysokiej wilgotności²⁵.
4. Kolonia produkcyjna musi być odpowiednio duża, aby zapewnić liczbę jaj wymaganą w ujęciu tygodniowym dla programu uwalniania. Opisana powyżej instalacja może wyprodukować około 4 milionów jaj przy zastosowaniu 28 klatek tygodniowo. Zaleca się przechowywanie zapasu jaj gwarantującego co najmniej 4 tygodnie dostaw dla Generacji Uwalnianej oraz Kolonii Produkcji Jaj.

Generowanie uwalniania

7. Produkcja larw

Procesy wylęgu, hodowli i sortowania dla generacji przeznaczonej do wypuszczenia są identyczne z wcześniej opisaną metodą stosowaną dla kolonii Produkcji Jaj. Jednak skala produkcji jest znacznie większa, co wymaga zastosowania większej liczby tacek i większego nakładu pracy.

8. Sortowanie larw, poczwarek samców i poczwarek samic

1. Sortowanie larw, poczwarek samców i poczwarek samic odbywa się w sposób identyczny z metodą opisaną dla sekcji Produkcja jaj.
2. Po posortowaniu poczwarek samców przed wypuszczeniem ważne jest sprawdzenie stopnia zanieczyszczenia samicami; ich udział nie powinien przekraczać 1%. Należy pobrać trzy alikwoty po 500 poczwarek (trzy losowe miarki do poczwarek) i policzyć liczbę obecnych poczwarek samic. Samice można zidentyfikować po tym, że są zazwyczaj większe od samców oraz po różnicach w kształcie płata genitalnego (Rycina 6)²⁷. Jeśli zawartość samic przekracza 1%, należy je ponownie posortować i sprawdzić raz jeszcze.
3. Do wypuszczenia należy używać wyłącznie samców z dnia 8. i 9.; pozostałe larwy i poczwarki należy poddać autoklawowaniu. W Brazylii odpady te muszą być traktowane tak samo jak odpady medyczne, jednak przepisy w innych krajach mogą być odmienne. Nie należy wykorzystywać poczwarek samic ani larw z generacji wypuszczanej do kolonii Produkcji jaj ze względu na różnice w kontroli jakości, hodowli oraz ryzyko zanieczyszczeń wynikające z większej liczebności i słabszej kontroli jakości.

Przechowywanie dorosłych osobników przed wypuszczeniem: Umieść samce w urządzeniach do uwalniania, aby mogły się wykluć i dojrzeć przed wypuszczeniem. Szczegóły dotyczące urządzeń do uwalniania nie zostały opisane w tej metodzie. Niemniej jednak pojemność stosowanych przez nas urządzeń do uwalniania wynosi około 1 000 samców. Szczegóły dotyczące metody uwalniania (urządzenie i system uwalniania) nie są opisane w tej metodzie.

Wyniki

Oczekiwane wyniki przepoczwarzenia dla produkcji przedstawiono na Rysunku 4. Samce przepoczwarzają się jako pierwsze, osiągając szczyt w 8. dniu, natomiast samice osiągają szczyt w 9. dniu po wykluciu. Ważne jest zmierzenie tej krzywej przepoczwarzenia, aby wyznaczyć optymalny czas oddzielenia samców od samic.

Wyniki z ponad 6 miesięcy sortowania poczek męskich i żeńskich wskazują, że zanieczyszczenie osobnikami żeńskimi wynosi średnio 0,02% (Rysunek 5; SEM = 0,004%). Ten poziom zanieczyszczenia odpowiada zaledwie 400 samicom wypuszczonym w ciągu miesiąca wypuszczania (ok. dwóch milionów samców). Obecna tygodniowa produkcja jaj wynosi 4 miliony. Z tej liczby 3,5 miliona jest wykluwanych na potrzeby kolonii jajowej i produkcji, a pozostałe są przechowywane jako zapas. Około 11% jaj jest wykorzystywanych do kolonii produkującej jaja, a reszta do generacji przeznaczonej do wypuszczenia. Średni procent wyklucia jaj wynosi 87,3% (SEM = 0,5%), a uzyski poczek męskich z larw L1 średnio 29,5% (SEM = 1,2). Co tydzień w kolonii generacji przeznaczonej do wypuszczenia hodowanych jest dwa miliony larw, co daje około 571 000 poczek męskich (SEM = 14 000). Średnia śmiertelność poczek i dorosłych osobników podczas wykluwania i wypuszczania wynosi 5%, co skutkuje wypuszczeniem około 543 000 (SEM = 13 000) dorosłych samców komarów tygodniowo. Przewiduje się, że obecna produkcja 4 milionów jaj/tydzień mogłaby zostać zredukowana do ~3 milionów/tydzień dzięki dalszej optymalizacji w celu ograniczenia strat wynikających z marnotrawstwa i przechowywania. Do opisanej produkcji potrzeba łącznie 6 pracowników: czterech pracujących przy generacji przeznaczonej do wypuszczenia i pozostałych dwóch przy kolonii jajowej.

Kontrola jakości

Kontrola jakości jest niezbędna dla utrzymania jakości osobników dorosłych, efektywności hodowli, nakładów pracy oraz kosztów.

Kontrola fenotypu transgenu

W celu weryfikacji ekspresji genu RIDL przeprowadza się dwie kontrole: najpierw sprawdzaną jest ekspresja markera fluorescencyjnego, a następnie ekspresja cechy letalności RIDL wywołanej brakiem tetracykliny. Wszystkie larwy powinny wykazywać ekspresję markera fluorescencyjnego. Aby sprawdzić, czy marker fluorescencyjny jest wyrażany zgodnie z oczekiwaniami, 2 000 larw pierwszego stadium rozwojowego poddaje się oględzinom pod stereomikroskopem Leica MZFLIII z filtrem DsRed2 (Texas Red) w celu ustalenia, czy występują osobniki niefluorescencyjne. Bez tetracykliny gen RIDL ulega ekspresji, co przekłada się na oczekiwaną przeżywalność do stadium imago na poziomie 3-4%⁸. Aby to zweryfikować, dla każdej partii wypuszczonej przygotowuje się dodatkową taczkę bez tetracykliny. Jedyną różnicą w stosunku do standardowej hodowli jest redukcja ilości pokarmu o 2/3 od 6. dnia, ponieważ nagromadzenie nadmiaru pokarmu w wyniku zamierania larw może prowadzić do nadmiernego wzrostu bakterii.

Kontrola hodowli

Cztery tacki z generacji wypuszczalnej są losowo wybierane do osobnego sortowania i przeliczania. Każdego dnia z każdej tacki zapisywana jest liczba poczek męskich i żeńskich (Rysunek 4). Jakiekolwiek odchylenie od oczekiwanej liczby samców i samic wskazuje na potencjalny problem, który mógłby wpłynąć na produkcję i/lub kondycję, i może być porównane z kolonią jaj w celu pomocy w ustaleniu źródła problemów.

Pomiary poczwarek

Wykazano, że rozmiar pocieczek jest skorelowany z rozmiarem osobników dorosłych²⁸. W ramach kontroli jakości rozmiaru dorosłych osobników mierzy się szerokość głowotułowia co najmniej 30 pocieczek samców dla każdego dnia sortowania z Generacji Uwalnianej; w przypadku Kolonii Produkcji Jaj mierzone są również pocieczki samic. Średnia szerokość głowotułowia wynosiła 1,05 mm (SEM 0,005) dla uwalnianych samców oraz odpowiednio 1,04 mm (SEM = 0,006) i 1,29 mm (SEM = 0,006) dla samców i samic w Kolonii Produkcji Jaj; podobne wyniki uzyskano podczas masowej hodowli Ae. albopictus²⁴.

Rysunek 1. Etapy masowej hodowli komarów do zastosowania w programie RIDL/SIT. Kolonia Produkcji Jaj podlega wysokiemu poziomowi kontroli jakości, aby zapewnić jakość jaj dostarczanych do generacji uwalnianej. Jaja są hodowane do stadium poczwarki w kolonii uwalnianej, gdzie samce są oddzielane od samic. Dorosłe samce są następnie wykorzystywane w programie kontroli RIDL.

Rysunek 2. Schemat zaplecza hodowlanego do produkcji samców RIDL na potrzeby programu wypuszczania. W pomieszczeniu kolonii produkcji jaj odbywa się ciągła produkcja jaj wysokiej jakości, które następnie są hodowane do stadium poczwarki w pomieszczeniu generacji wypuszczanej. Następnie larwy i poczwarki są rozdzielane, a poczwarki sortowane pod kątem płci w celu wyselekcjonowania samców. Samce są następnie umieszczane w urządzeniach do wypuszczania i pozostawiane do osiągnięcia stadium imago w pomieszczeniu do przechowywania i wypuszczania dorosłych osobników.

Rysunek 3. Rozdzielanie larw, poczeku samców i poczeku samic przy użyciu separatora płytowego²⁶.  Separator płytowy wykorzystuje różnice w rozmiarach larw, poczeku samców i poczeku samic do sortowania tych trzech różnych stadiów rozwojowych; larwy są zazwyczaj mniejsze niż poczeku samców, które z kolei są mniejsze niż poczeku samic. Instrument składa się z dwóch szklanych płyt; jedna jest przymocowana do pochylonej metalowej ramy, a druga spoczywa na pierwszej płycie i może być przemieszczana względem niej za pomocą czterech śrub regulacyjnych (A). Cztery śruby regulacyjne pozwalają ustawić płytę zewnętrzną pod kątem względem płyty tylnej, tak aby między płytami powstała przestrzeń w kształcie klina, zwężająca się ku dołowi. Larwy i poczeku są wlewane pomiędzy szklane płyty (B) i delikatnie przemywane za pomocą węża wodnego (C). Poprzez regulację kąta nachylenia płyty można rozdzielić larwy, poczeku samców i poczeku samic (D). Przy ciągłym płukaniu i zwiększaniu kąta nachylenia płyty, w pierwszej kolejności można wypłukać larwy (do sita), następnie poczeku samców, a na koniec poczeku samic.

Rycina 4. Krzywe przepoczwarzenia dla masowo hodowanych Ae. aegypti RIDL.  Wykres ten przedstawia średni procent przepoczwarzenia dla masowo hodowanych poczwarek samców i samic RIDL podczas 23-tygodniowej obserwacji, przy odzyskaniu ok. 135 000 poczwarek tygodniowo. Słupki błędu = standardowy błąd średniej, n = 23. Podczas pierwszej kolekcji (dzień 8) odzyskano średnio 59% poczwarek samców i 30% poczwarek samic z całkowitej liczby poczwarek zebranych z tacek w ciągu 5 dni.

Rysunek 5. Średnie zanieczyszczenie osobnikami żeńskimi w posortowanych poczwarkach samców. Wykres przedstawia średni miesięczny procent zanieczyszczenia osobnikami żeńskimi podczas sortowania samców w 8. dniu po wykluciu w okresie sześciu miesięcy.

Rysunek 6. System zasilania krwią z płytką aluminiową. Płytka (B) jest pokryta Parafilmem (A), krew jest pipetowana do kieszeni, a następnie uszczelniana (D). Płytka jest umieszczana w klatce i ogrzewana poprzez położenie ogrzanej poduszki żelowej (C) na górze (E).

Rysunek 7. Rozróżnianie poczwarek samców i samic Ae. aegypti. Płeć poczwarek Ae. aegypti można wiarygodnie określić na podstawie różnic w kształcie płatów genitalnych (na końcu segmentów odwłoka poczwarki, tuż poniżej wiośieł). Dodatkowo samce mają tendencję do bycia mniejszymi od samic.

Tabela 1. Ogólny schemat karmienia larw Ae. aegypti RIDL (mg pokarmu na larwę na dobę). Aby obliczyć rzeczywistą ilość wymaganego pokarmu, należy pomnożyć tę wartość przez całkowitą liczbę larw w tacy.

Dyskusja

RIDL jest skuteczną i bezpieczną dla środowiska metodą zwalczania komarów^3,29-31. Technika ta znajduje zastosowanie w zintegrowanych programach zarządzania szkodnikami , a większość aktualnych metod kontroli, w tym larwicydy, ograniczanie miejsc lęgowych i adultycydy, jest z nią kompatybilna. Niniejsza metoda opisuje sposób produkcji do 570 000 poczwarek samców RIDL  tygodniowo do wykorzystania w zwalczaniu Ae. aegypti; z naszej wiedzą jest to pierwszy opis produkcji transgenicznych komarów na taką skalę. Niektóre porównywalne systemy produkcji opracowano dla dzikiego typu Ae. aegypti w latach 60. i 70.²⁵, jednak od tego czasu nie prowadzono produkcji o porównywalnej skali. W Brazylii od lutego 2011 do lutego 2012 roku wypuszczono około 11 milionów samców. Liczba samców wymagana do opanowania danego obszaru zależy od wielu czynników, w tym od wielkości populacji dzikiej, rozprzestrzeniania się wypuszczonych samców, ich przeżywalności i konkurencyjności w kojeniu po wypuszczeniu, a także od warunków środowiskowych.  Wcześniejsze badania wykazały, że RIDL  może zredukować populację komarów o co najmniej 80%⁹.

Konieczne jest zachowanie równowagi między optymalizacją masowej hodowli pod kątem skali produkcji i kosztów a jakością samców. Na przykład zwiększenie zagęszczenia larw może zwiększyć wydajność produkcji poprzez zmniejszenie wymaganej przestrzeni, nakładów pracy oraz czasu do przepocz워cenia³². Jednak zbyt wysokie zagęszczenie larw może prowadzić do uzyskania mniejszych i krócej żyjących samców o obniżonej zdolności do kopulacji^32,33. Jakość samców w kontekście programu SIT zostanie ostatecznie oceniona na podstawie zdolności wypuszczonych samców do kopulacji z samicami w terenie. Do oceny konkurencyjności w kopulacji w stosunku do osobników dzikich wymagane są rozległe badania terenowe^9,10. Często sprawia to, że niepraktyczne jest precyzyjne określenie, które czynniki decydują o tym, że komar jest samcem „wysokiej jakości”. Niemniej jednak utrzymanie spójnej produkcji i jakości (w zakresie, w jakim można ją rutynowo oceniać) w masowej hodowli na dużą skalę jest kwestią kluczową. Wymaga to wysokiego poziomu czujności i standaryzacji wszystkich procesów, gdyż niewielkie wahania mogą mieć znaczący wpływ na wynik. Podział larw L1 na porcje (alikwotowanie) jest krytycznym etapem i obrazuje tę kwestię. Przeniesienie prawidłowej liczby larw do tacek jest niezbędne dla uzyskania produkcji wysokiej jakości. System karmienia jest precyzyjnie dostosowany do konkretnej liczby larw. Zbyt mała lub zbyt duża liczba larw doprowadzi do przeżywienia lub niedożywienia, co wpływa na przeżywalność larw, wielkość pocieczek i czas do przepocz워cenia. Jeśli istnieje sekret sztuki masowej hodowli, polega on na zapewnieniu, że wiele małych kroków w cyklu produkcyjnym jest przeprowadzanych spójnie, precyzyjnie i z wysokim poziomem kontroli jakości, zgodnie z opisem w niniejszej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vipan Premium	Sera GmbH	190	sera vipan 3 Sera vipan 3 to specjalistyczny preparat do leczenia i zapobiegania infekcjom bakteryjnym u ryb ozdobnych. Jest to produkt szerokiego działania, przeznaczony do walki z szerokim spektrum bakterii patogennych, w tym z takimi jak *Aeromonas* czy *Pseudomonas*. Zastosowanie i działanie: Preparat jest skuteczny w przypadku objawów takich jak: - czerwone krawędzie płetw, - zapalenie pęcherza pławnego, - infekcje skóry i tkanek miękkich, - ogólne objawy chorób bakteryjnych. Sera vipan 3 działa bakteriobójczo, hamując namnażanie się patogenów i wspomagając procesy regeneracyjne organizmu ryb. Sposób użycia i dawkowanie: Przed zastosowaniem preparatu zaleca się wykonanie podmiany wody w akwarium. Dawkowanie: 250 mg preparatu na 10 litrów wody. Czas trwania kuracji: zazwyczaj od 3 do 5 dni. Po zakończeniu leczenia zaleca się ponowną podmianę wody. Ważne uwagi: - Stosować zgodnie z instrukcją na opakowaniu. - Przechowywać w suchym i chłodnym miejscu, poza zasięgiem dzieci. - Przed użyciem zapoznać się z pełnym składem i ostrzeżeniami zawartymi w ulotce dołączonej do produktu.
Tetracyklina	Sigma Aldrich	T7660	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|KLUCZ_MARKI&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Separator płytek	J.W. Hock	5412	Sepsarator 5412 Instrukcja obsługi WSTĘP Sepsarator 5412 jest wysokowydajnym, zautomatyzowanym systemem do separacji ciał stałych z cieczy, zaprojektowanym z myślą o zastosowaniach laboratoryjnych i przemysłowych. Urządzenie wykorzystuje siłę odśrodkową do szybkiego i efektywnego oddzielania zawiesin, osadów oraz innych cząstek stałych z próbek ciekłych, zapewniając wysoką czystość separatu. CECHY URZĄDZENIA • Precyzyjna kontrola prędkości obrotowej dla zoptymalizowanej separacji. • Wytrzymała konstrukcja odporna na korozję, odpowiednia do pracy z różnymi odczynnikami chemicznymi. • Intuicyjny panel sterowania z cyfrowym wyświetlaczem parametrów. • System automatycznego wyważania zapobiegający wibracjom podczas pracy. • Bezpieczniki ochronne i blokady pokrywy zapewniające bezpieczeństwo operatora. ZASADY BEZPIECZEŃSTWA Przed uruchomieniem urządzenia należy zapoznać się z poniższymi zasadami bezpieczeństwa: 1. Nigdy nie otwieraj pokrywy urządzenia podczas jego pracy. 2. Upewnij się, że wszystkie naczynia i próbki są prawidłowo rozmieszczone i wyważone. 3. Urządzenie musi być podłączone do uziemionego gniazda zasilania. 4. W przypadku wystąpienia nadmiernych wibracji lub nietypowych dźwięków należy natychmiast wyłączyć urządzenie. 5. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi. INSTRUKCJA OBSŁUGI 1. Przygotowanie próbek: Nalej ciecz z zawiesiną do odpowiednich naczyń separatora, dbając o to, aby poziom cieczy był zgodny ze specyfikacją producenta. 2. Załadunek: Umieść naczynia w rotorze w sposób symetryczny, aby zapewnić prawidłowe wyważenie układu. 3. Konfiguracja parametrów: Włącz urządzenie i za pomocą panelu sterowania ustaw pożądaną prędkość obrotową oraz czas separacji. 4. Uruchomienie: Zamknij i zablokuj pokrywę, a następnie naciśnij przycisk START. 5. Zakończenie pracy: Po upływie zaprogramowanego czasu rotor zatrzyma się automatycznie. Odczekaj do całkowitego zatrzymania, zanim otworzysz pokrywę. 6. Odzyskiwanie separatu: Ostrożnie usuń naczynia i oddziel klarowną ciecz od zgromadzonego osadu. KONSERWACJA I CZYSZCZENIE • Po każdym użyciu należy oczyścić komorę urządzenia z ewentualnych rozlanej cieczy za pomocą wilgotnej szmatki i łagodnego detergentu. • Regularnie sprawdzaj stan uszczelek i elementów ruchomych pod kątem zużycia. • Rotory i naczynia odporne na autoklawowanie powinny być sterylizowane zgodnie z procedurami laboratoryjnymi. • Przeglądy techniczne i kalibracja powinny być przeprowadzane okresowo przez autoryzowany serwis. ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW Problem: Urządzenie nie uruchamia się. Możliwa przyczyna: Pokrywa nie jest domknięta lub zablokowana. Rozwiązanie: Sprawdź blokadę pokrywy i upewnij się, że jest ona całkowicie zamknięta. Problem: Nadmierne wibracje podczas pracy. Możliwa przyczyna: Nieprawidłowe wyważenie próbek w rotorze. Rozwiązanie: Wyłącz urządzenie, sprawdź rozmieszczenie naczyń i upewnij się, że masy próbek są identyczne. Problem: Błąd wyświetlacza. Możliwa przyczyna: Błąd systemowy lub awaria czujnika. Rozwiązanie: Zrestartuj urządzenie; jeśli problem nie ustąpi, skontaktuj się z serwisem technicznym. SPECYFIKACJA TECHNICZNA Prędkość obrotowa: [Wartość] obr./min Pojemność maksymalna: [Wartość] ml Napięcie zasilania: [Wartość] V / [Wartość] Hz Wymiary: [Wartość] x [Wartość] x [Wartość] mm Masa: [Wartość] kg
Parafilm M	Wypełnienie plastikowe Pechiney	PM-996	www.parafilm.com
Kuwety hodowlane dla generacji przeznaczonej do wypuszczenia (53 cm x 38 cm x 8 cm)	Pleion	0757	http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1
Mikroskop fluorescencyjny	Leica Microsystems	MZ FLIII	Szybka i łatwa w obsłudze metoda do analizy tkanek Zapewnij sobie pewność i powtarzalność wyników dzięki systemowi do cięcia tkanek Leica MZ FLIII. Przeznaczony do cięcia tkanek w temperaturze zamrażania, system Leica MZ FLIII to wszechstronne narzędzie do preparatyki histologicznej, które łączy w sobie najwyższą precyzję z łatwością obsługi. Właściwości urządzenia: * Możliwość cięcia w temperaturze zamrażania (kryostatyka) i w temperaturze pokojowej. * Wbudowana komora chłodząca z regulacją temperatury. * Precyzyjny mechanizm posuwu dla zapewnienia powtarzalności grubości przekrojów. * Intuicyjny panel sterowania ułatwiający szybką zmianę parametrów. * Ergonomiczna konstrukcja zapewniająca komfort pracy użytkownika. * Wysoka stabilność i sztywność konstrukcji eliminująca drgania podczas cięcia. Zastosowania: System Leica MZ FLIII idealnie nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań w laboratoriach patomorfologicznych, ośrodkach badawczych i jednostkach akademickich, w tym do: * Szybkiego przygotowywania skrawków tkanek do diagnostyki śródoperacyjnej. * Analizy tkanek utrwalonych w materiale mrożonym. * Badania struktur komórkowych i tkankowych z zachowaniem wysokiej morfologii. * Przygotowywania próbek do immunohistochemii i innych metod barwienia specyficznego. Zalety systemu: * Wysoka jakość skrawków: Minimalizacja artefaktów i zniekształceń tkanek dzięki precyzyjnemu prowadzeniu noża. * Elastyczność: Szybkie przejście między różnymi trybami pracy i temperaturami. * Niezawodność: Wykorzystanie wysokiej klasy materiałów odpornych na korozję i zużycie. * Bezpieczeństwo: Zastosowanie osłon i blokad chroniących operatora przed ostrym ostrzem. Leica Microsystems – partner w precyzyjnej analizie obrazu i preparatyce tkanek.
Klatki dla osobników dorosłych	BugDorm	DP1000	Klatka do hodowli owadów, 30x30x30 cm, opakowanie 1 szt.
Papier filtracyjny	CELAB		http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html