Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Podsumowanie

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Streszczenie

Tradycyjnie migrację komórek badano na sztywnych, dwuwymiarowych powierzchniach plastikowych. Jednak podczas istotnych procesów biologicznych, takich jak gojenie ran, regeneracja tkanek czy przerzuty nowotworowe, komórki muszą przemieszczać się przez złożoną, trójwymiarową macierz zewnątrzkomórkową. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy stojące za tymi procesami biologicznymi, ważne jest zbadanie roli białek odpowiedzialnych za napędzanie migracji komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół badania mechanizmów migracji komórek z wykorzystaniem linii komórek nabłonkowych (MDCK) oraz trójwymiarowej, włóknistej, samopolimeryzującej się macierzy jako układu modelowego. Ta optycznie przejrzysta macierz zewnątrzkomórkowa łatwo nadaje się do badań obrazowania żywych komórek i lepiej naśladuje fizjologiczne środowisko tkanek miękkich. Niniejsze opracowanie prezentuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji i dynamiki białek oraz odkształceń otaczającej trójwymiarowej macierzy.

Badanie lokalizacji i dynamiki białek podczas procesów komórkowych dostarcza kluczowych informacji na temat funkcji białek. Genetycznie kodowane znaczniki fluorescencyjne stanowią unikalną metodę obserwacji lokalizacji i dynamiki białek. Dzięki tej technice możemy w czasie rzeczywistym analizować subkomórkową akumulację kluczowych, generujących siłę komponentów cytoszkieletu podczas przemieszczania się komórki przez macierz. Dodatkowo, wykorzystując wiele znaczników fluorescencyjnych o różnych długościach fal, możemy jednocześnie badać lokalizację wielu białek, co pozwala nam sprawdzić na przykład, czy różne białka pełnią podobne czy odmienne role. Ponadto dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie można ilościowo określić za pomocą analizy fluorescencyjnego odzyskiwania po fotoblaknięciu (FRAP). Pomiar ten pozwala ocenić mobilność białek oraz stabilność ich wiązania z siecią cytoszkieletu.

Łącząc obrazowanie żywych komórek z zastosowaniem inhibitorów funkcji białek, możemy w czasie rzeczywistym badać zmiany w rozmieszczeniu białek oraz morfologii migrujących komórek. Ponadto łączymy obrazowanie żywych komórek z użyciem fluorescencyjnych cząsteczek znacznikowych osadzonych w macierzy, aby wizualizować odkształcenia macierzy podczas migracji komórek. Dzięki temu możemy zaobserwować, w jaki sposób migrująca komórka rozmieszcza białka generujące siłę i w których miejscach siły trakcyjne są przykładane do otaczającej macierzy. Stosując te techniki, możemy uzyskać cenne informacje na temat roli konkretnych białek i ich udziału w mechanizmach migracji komórek.

Protokół

1. Generowanie stabilnej linii komórkowej (np. komórek MDCK)

1. Wysiać komórki w naczyniu p35 do osiągnięcia 80-90% konfluencji. Nie dopuszczać do powstania 100% konfluentnej monowarstwy, co obniżyłoby wydajność transfekcji.
2. Przeprowadzić transfekcję komórek wybranym plazmidem przy użyciu Lipofectamine 2000. Warunki transfekcji zoptymalizować zgodnie z protokołem producenta.
3. Następnego dnia przenieść komórki do dwóch szalek Petri p150. Zaleca się użycie dużych szalek, aby zapewnić odpowiedni odstęp między koloniami stabilnymi.
4. Następnego dnia wymienić medium i dodać 500 μg/ml G418 do każdej szalki. Stężenie G418 należy zoptymalizować dla poszczególnych linii komórkowych.
5. Wymieniać medium co drugi dzień przez około 2 tygodnie. Po 2 tygodniach powinny zacząć tworzyć się kolonie oporne na G418, widoczne gołym okiem.
6. Za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego zidentyfikować kolonie dodatnie pod kątem GFP. Zaznaczyć te kolonie na szalce za pomocą pisaka permanentnego.
7. Aby selektywnie trypsynizować kolonie z naczynia do hodowli tkankowej, odessać medium i dwukrotnie przemyć komórki PBS lub roztworem trypsyny. Podczas drugiego przemywania nie odsysać całego roztworu. Pozostawić cienką warstwę cieczy na dnie szalki, aby zapobiec wysychaniu komórek.
8. Dla każdej zaznaczonej kolonii: użyć wysterylizowanego patyczka z watą, aby przetrzeć obszar jak najbliżej krawędzi kolonii. Stworzy to „wyspę” wilgotnego obszaru zawierającą kolonię komórek. Nanieść pipetą 10 μl trypsyny na kolonię. Powtórzyć czynność dla każdej kolonii i postępować szybko, aby uniknąć wysychania. Doświadczony badacz jest zazwyczaj w stanie wyizolować ok. 12 kolonii z szalki p150.
9. Inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż komórki oddzielą się od szalki i przybiorą okrągły kształt.
10. Dla każdej kolonii: nanieść pipetą 10 μl trypsyny na kolonię, a następnie kilka razy pipetować roztwór w górę i w dół, aby oderwać komórki od szalki. Następnie przenieść wszystkie komórki z kolonii do pojedynczego dołka w płytce 24-dołkowej.
11. Po wyrośnięciu kolonii stabilnych analizuje się ekspresję białka w każdej z nich za pomocą standardowego western blotu oraz immunofluorescencji. Roznamnażać te linie komórkowe do dalszych analiz.

2. Modyfikacja powierzchni szalki z szklanym dnem dla optymalnego wiązania kolagenu (Opcjonalnie)

1. Aby przeprowadzić silanizację szkła, nanieś pipetą 300 μl 2% roztworu 3-aminopropylotrimetoksysilanu na szklaną część każdej szalki p35 z otworem 10 mm. Schemat silanizacji i sieciowania przedstawiono na Rysunku 1. 3-Aminopropylotrimetoksysilan jest rozpuszczony w wodzie filtrowanej.
2. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Odsącz roztwór 3-aminopropylotrimetoksysilanu i przemyj wodą filtrowaną trzykrotnie, po 10 minut za każdym razem.
4. Odsącz wodę i umieść szalki na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C na 1,5 godziny. Połóż pokrywki szalek lekko uchylone, aby wilgoć mogła odparować z wnętrza szalki.
5. Zdejmij szalki z płyty grzejnej i pozostaw do ostygnięcia.
6. Nanieś pipetą 300 μl 2% roztworu glutaraldehydu na szklaną część każdej szalki. Glutaraldehyd jest rozpuszczony w PBS.
7. Inkubuj przez 1 godzinę.
8. Odsącz roztwór glutaraldehydu i przemyj szalki PBS trzykrotnie, po 10 minut za każdym razem.
9. Sterylizuj szalki poprzez naświetlanie promieniami UV przez 1 godzinę. Zsilanizowane szalki można przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie trójwymiarowego żelu kolagenowego z cząstkami znacznikowymi

1. Przemyć fluorescencyjne cząsteczki znacznikowe, wirując 100 μl roztworu zapasowego cząsteczek znacznikowych (10¹⁰ particles/ml) w wirówce przy 15,000 rpm przez 5 minut, odessać ciecz i dodać 500 μl pożywki. Powtórzyć 5 razy. Po ostatnim przemyciu resuspendować cząsteczki w 30 μl pożywki.
2. Poddać komórki wykazujące ekspresję GFP trypsynizacji w sposób rutynowy.
3. Resuspendować osad komórkowy do stężenia około 2 x 10⁶ cells/ml.
4. Pipetować 240 μl pożywki wzrostowej do probówki typu Eppendorf.
5. Dodać 12,6 μl 1M Hepes, 20 μl filtrowanej wody, 50 μl zawiesiny komórkowej, a następnie 10 μl fluorescencyjnych cząsteczek.
6. Na koniec dodać 167 μl roztworu kolagenu typu I z skóry bydlęcej (aby uzyskać stężenie robocze 1 mg/ml).
7. Dokładnie wymieszać roztwór, a następnie pipetować 80 μl roztworu na szklaną część silanizowanego naczynia z szklanym dnem.
8. Umieścić naczynie w inkubatorze i pozwolić żelowi spolimeryzować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Typowy żel kolagenowy w naczyniu p35 z szklanym dnem przedstawiono na rysunku 1A.
9. Ostrożnie dodać 2 ml pożywki wzrostowej do każdego naczynia.

4. Procedura akwizycji obrazów w odstępach czasu

1. Włącz kontrolę temperatury obudowy mikroskopu i pozwól komorze mikroskopu ustabilizować się do stałej temperatury 37 °C. Przykład systemu do obrazowania żywych komórek przedstawiono na Rysunku 2.
2. Wymień medium na nowe, uzupełnione o 25 mM Hepes w celu utrzymania neutralnego pH. W przypadku obrazowania DIC wymień górną część naczynia na taką, która posiada szklane dno. Za pomocą cienkiego paska parafilmu zakryj bok naczynia, aby zapobiec odparowywaniu medium.
3. W przypadku zastosowania obiektywu imersyjnego naolejowego nanieś jedną kroplę płynu imersyjnego na obiektyw.
4. Umieść naczynie zawierające żel kolagenowy na stole mikroskopu i upewnij się, że naczynie styka się z płynem imersyjnym.
5. Ustaw ostrość próbki i wyszukaj interesujące komórki do obrazowania. Aby zminimalizować dryft stołu, pozwól naczyniu ustabilizować się przez około 45 minut przed rozpoczęciem długiej sesji akwizycji.
6. Określ parametry akwizycji obrazu. Zminimalizuj ekspozycję laserową, która mogłaby uszkodzić komórki, modulując moc lasera, czas ekspozycji, częstotliwość oraz czas trwania akwizycji. Rzeczywiste parametry będą różnić się w zależności od systemu mikroskopowego i typu komórek.
7. Podczas akwizycji time-lapse można dodać inhibitor. W przypadku eksperymentu z dodaniem inhibitora nie zaklejaj naczynia parafilmem.
   1. Przygotuj medium uzupełnione o Hepes z lekiem w żądanym stężeniu roboczym.
   2. Przed dodaniem leku do medium wstrzymaj akwizycję obrazu i ostrożnie zdejmij górną część naczynia, nie poruszając nim.
   3. Odsuń medium z naczynia za pomocą aspiratora i pipetą dodaj do naczynia medium zawierające lek. Następnie ostrożnie załóż górną część naczynia.
   4. Próbka może stracić ostrość w wyniku dodania nowego medium; ponownie ustaw ostrość.
   5. Wznowij akwizycję, a następnie monitoruj proces przez kolejne 30 minut i w razie potrzeby ponownie koryguj ostrość. Przykład eksperymentu z dodaniem leku przedstawiono na Rysunku 4.

5. Procedura i analiza FRAP

1. Konfiguracja FRAP różni się w zależności od systemu; należy postępować zgodnie z instrukcją producenta.
2. Ustaw parametry obrazowania żywych komórek.
3. Ustaw parametry fotowybielania. Użyj mocy lasera wystarczającej do fotowybielenia sygnału fluorescencyjnego bez uszkodzenia komórki. Przetestuj te parametry na komórkach próbnych.
4. Rozpocznij akwizycję obrazów i zarejestruj co najmniej 5 klatek przed fotowybieleniem obszaru zainteresowania.
5. Kontynuuj akwizycję; czas regeneracji powinien być wystarczający do uchwycenia pełnego powrotu fluorescencji. Przykład eksperymentu FRAP przedstawiono na Ryc. 5.
6. Przeanalizuj regenerację fluorescencji, mierząc średnią intensywność fluorescencji obszaru fotowybielonego (przed i po fotowybielaniu) w czasie. Używając oprogramowania do analizy statystycznej (np. Excel), dopasuj krzywą regeneracji do równania wykładniczego: I=I_f(1-e^-kt), gdzie I to intensywność, I_f to intensywność końcowa, t to czas, a τ_½ to czas potrzebny do osiągnięcia połowy wartości końcowej: τ_½=ln(2)/k. Czas połowowy jest miarą szybkości mobilności białka.
7. Wyznacz parametry czasu połowicznego i intensywności końcowej z krzywej dopasowania wykładniczego. Oblicz frakcję mobilną, wyznaczając stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład obrazowania żywych, zdrowych komórek nabłonkowych w macierzy przedstawiono na rysunku 3. Zdrowe komórki charakteryzują się gładką, ciągłą błoną oraz wyraźnym jądrem, podczas gdy komórki niezdrowe często mają uszkodzoną błonę i nadmierną liczbę wakuol. W macierzy 3D pojedyncze komórki nabłonkowe migrują¹, a w ciągu kilku dni tworzą w niej trójwymiarowe, sferyczne, wielokomórkowe cysty². Komórki są również bardzo dynamiczne i migrują w obrębie cysty (rysunek 3). Deformację macierzy wynikającą z sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki analizuje się poprzez przemieszczenie cząsteczek znacznika osadzonych w otaczającej macierzy (rysunek 4). Ruchy cząsteczek znacznika są przedstawione jako obraz maksymalnej projekcji z różnych punktów czasowych, a każdy punkt czasowy jest pseudo-kolorowany w celu wskazania czasu (rysunek 4B). Alternatywnie, obrazy pojedynczej cząsteczki znacznika są prezentowane w formie montażu, aby pokazać ruch cząsteczki znacznika w czasie (rysunek 4C). Cała analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania ImageJ. Te jakościowe oceny deformacji macierzy, a tym samym sił wywieranych przez migrujące komórki, stanowią przydatne pierwsze przybliżenie rozkładu sił trakcyjnych. Ilościowa ocena sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki w 3D wykracza poza zakres niniejszego protokołu i jest opisana w innych publikacjach^3,4.

Typowy eksperyment odzyskiwania fluorescencji po fotobleachingu przedstawiono na rysunku 5. Obszar zainteresowania musi zostać poddany fotobleachingowi przy użyciu zoptymalizowanych ustawień lasera w taki sposób, aby intensywność fluorescencji była widocznie zmniejszona w porównaniu do poziomów tła (w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu), przy jednoczesnym zachowaniu zdrowych i nieuszkodzonych komórek. Optymalne ustawienia muszą zostać określone empirycznie, ponieważ każda konfiguracja FRAP jest inna (np. FRAP z wykorzystaniem konfokalnego systemu skaningowego).

Czas ekspozycji i odstępy czasowe podczas akwizycji obrazów po FRAP muszą być starannie kontrolowane, aby uniknąć fotoblaknięcia tła. Zastosowanie mniejszej mocy lasera, krótkiego czasu ekspozycji, czułej kamery oraz wysokowydajnej optyki jest niezbędne dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania FRAP. Jeśli fotoblaknięcie fluorescencji podczas akwizycji obrazu jest znaczące, to zanikanie tła musi zostać określone ilościowo i znormalizowane względem obserwowanej intensywności powrotu fluorescencji. Ze względu na trójwymiarowy charakter środowiska, komponent z osi z podczas powrotu intensywności fluorescencji może stać się istotny. Dlatego ważne jest zdefiniowanie objętości poddanej fotoblaknięciu poprzez wykonanie obrazów stosu 3D obszaru fotoblaknięcia przed i po procedurze. Dalsza analiza i modelowanie powrotu fluorescencji omówiono w innych opracowaniach^5,6.

Wyjątkowe połączenie technik obrazowania żywych komórek: GFP do śledzenia dynamiki białek cytoszkieletu, czerwonych fluorescencyjnych cząsteczek znacznikowych do monitorowania deformacji macierzy oraz dodania inhibitorów, może być stosowane jednocześnie do analizy dynamiki białek, sił trakcyjnych i szlaków molekularnych.

Rysunek 1. Przygotowanie żelu kolagenowego. A) Zpolimeryzowana matryca kolagenowa w naczyniu z szklanym dnem. Różowy kolor żelu wynika z obecności zatopionych cząsteczek fluorescencyjnych. B) Procedura obróbki naczyń z szklanym dnem w celu sieciowania żelu kolagenowego z powierzchnią szkła. Najpierw naczynie z szklanym dnem poddaje się działaniu roztworu 3-aminopropyltrimetoksysilanu, a następnie roztworu glutaraldehydu, który sieciuje matrycę kolagenową ze szkłem.

Rysunek 2. Schemat konfiguracji mikroskopu konfokalnego/FRAP. Mikroskop konfokalny bazuje na systemie Zeiss AxioObserver z kamerą CCD CoolSnap HQ II i jest całkowicie zautomatyzowany przez oprogramowanie Slidebook (Intelligent Imaging Innovations). Jednostka konfokalna została zaprojektowana na zamówienie w oparciu o jednostkę z wirującym dyskiem Yokogawa CSU10 oraz dwa lasery półprzewodnikowe (488 nm o mocy 50 mW oraz 561 nm o mocy 40 mW) z akustooptycznym filtrem przestrajalnym (AOTF), umożliwiającym przełączanie między laserami w czasie milisekund. Filtry emisyjne to 525/50 nm oraz 620/60 nm (#118661 i #118085, Chroma Technology), a lustro dichroiczne to 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). Zastosowane obiektywy to obiektyw C-Apochromat 40x o dużej odległości roboczej z NA 1.1 i odległością roboczą 0.62 mm oraz obiektyw Plan-Apochromat 63x z NA 1.4 i odległością roboczą 0.19 mm. Mikroskop zawiera również system fotoablacji FRAP, który składa się z barwnikowego lasera pompowanego światłowodowo, komputerowo sterowanej pozycji i intensywności wiązki oraz ograniczonej dyfrakcyjnie wielkości plamki. Ponadto mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stół x-y z enkoderami liniowymi o rozdzielczości 0.1 mikrona na każdej osi. Podczas obrazowania time-lapse temperatura otoczenia jest utrzymywana za pomocą specjalnie zaprojektowanej komory mikroskopowej i grzałki z układem sprzężenia zwrotnego kontroli temperatury. Aby wyeliminować szum i wibracje, cały system mikroskopowy został umieszczony na stole antywibracyjnym.

Rysunek 3. Obrazowanie żywych komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję GFP-aktyny. Komórki te utworzyły cystę po 4 dniach hodowli w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Niektóre komórki poruszają się wzdłuż powierzchni cysty (żółta grot strzałki), podczas gdy inne migrują wewnątrz cysty (czerwona grot strzałki). Pasek skali 10 μm, czas podany w godzinach.

Rycina 4. Wpływ inhibicji kinazy Rho na siłę trakcyjną. A) Obraz DIC migrującej komórki MDCK wykazującej ekspresję jądrowego markera z tagiem GFP. Obraz wykonano bezpośrednio przed podaniem inhibitora kinazy Rho Y-27632. Pasek skali 10 μm. B) Przesunięcie cząsteczek wynikające z dodania Y-27632. Pozycje cząsteczek w różnych punktach czasowych (0 - 52 min) zostały pseudo-pokolorowane zgodnie ze skalą intensywności, a następnie rzutowane na jeden obraz. Biały obszar to jądro dodatnie pod kątem GFP w migrujących komórkach. Pasek skali 10 μm. Czas w minutach. C) Ruch cząsteczek przy krawędzi tylnej komórki (patrz strzałka w B). Gwiazdka oznacza ostatnią klatkę zarejestrowaną przed dodaniem Y-27632. Cząsteczka znacznika poruszała się w kierunku krawędzi tylnej migrującej komórki przed dodaniem Y-27632 oraz oddalała się od niej po jego dodaniu. Pasek skali 1 μm.

Rycina 5. Analiza FRAP komórki migrującej w macierzy trójwymiarowej, wykazującej ekspresję GFP-aktyny. A) Obrazy z lapse-time komórki wykazującej ekspresję GFP-aktyny przed i po fotoblaknięciu. Mały obszar GFP-aktyny nagromadzonej w tylnej części komórki został poddany fotoblaknięciu (czerwona strzałka) w punkcie czasowym 0. Czas w sekundach, pasek skali 5 μm. B) Średnia intensywność fluorescencji obszaru poddanego fotoblaknięciu (linia ciągła) oraz dopasowanie wykładnicze powrotu fluorescencji (kółka) przedstawione w funkcji czasu. Intensywność fluorescencji znormalizowano do wartości początkowej przed fotoblaknięciem.

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania obrazowania żywych komórek do badania mechanizmów migracji komórek w macierzy trójwymiarowej. Skuteczność tej techniki zależy od uzyskania „dobrych” klonów stabilnie eksponujących białka znakowane GFP. Niski poziom białek GFP wymaga nadmiernej ekspozycji na wzbudzenie, co pogarsza stan zdrowia komórek, natomiast zbyt wysoki poziom GFP wywołuje niepożądane skutki uboczne w komórce. W związku z tym istotny jest wybór wektora do transfekcji genów do komórek (np. promot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen wołowy, typ I	BD Biosciences	354231	Roztwór stokowy ok. 3 mg/ml
3-aminopropylotrimetoksysilan	Sigma-Aldrich	281778	Rozcieńczyć w wodzie
glutaraldehyd	Sigma-Aldrich	340855	Rozcieńczyć w PBS
1M Hepes	Invitrogen	15630-080
Mikrosfery polistyrenowe Fluospheres 1 μm, fluorescencja czerwona (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticyna (G418)	Invitrogen	11811-031
DMEM	Invitrogen	31600-034
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S115500
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Kanamycyna	Invitrogen	15160-054