Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą śledzenia wielu celów (MTT)

Summary

Śledzenie wielu celów to domorosły algorytm opracowany do śledzenia indywidualnie znakowanych cząsteczek w błonie komórkowej żywych komórek. Skuteczne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie o dużej gęstości zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w nanoskali.

Abstract

Naszym celem jest uzyskanie wyczerpującego opisu procesów molekularnych zachodzących na błonach komórkowych w różnych funkcjach biologicznych. Naszym celem jest scharakteryzowanie złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczej cząsteczki, poprzez opracowanie narzędzi analitycznych dedykowanych do śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) przy dużej gęstości: Multiple-Target Tracing (MTT)¹. Wideomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca milisekundową i nanometryczną rozdzielczość^1-11, umożliwia szczegółowe odwzorowanie organizacji błony^12-14 poprzez dokładne mapowanie deskryptorów, takich jak lokalizacja, ruchliwość, uwięzienie lub interakcje receptorów komórkowych.

Ponownie przyjrzeliśmy się SPT, zarówno eksperymentalnie, jak i algorytmicznie. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację konfiguracji i znakowania komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie najwyższej możliwej gęstości znakowania, w celu zapewnienia dynamicznego obrazu dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Zagadnienia algorytmiczne dotyczyły każdego kroku wykorzystywanego do odbudowy trajektorii: wykrywania, szacowania i ponownego łączenia pików, rozwiązywanych za pomocą konkretnych narzędzi z analizy obrazu^15,16. Implementacja deflacji po wykryciu pozwala na uratowanie pików początkowo ukrytych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zauważyć, że poprawa wykrywania ma bezpośredni wpływ na ponowne połączenie, zmniejszając luki w trajektoriach. Wydajność została oceniona za pomocą symulacji Monte-Carlo dla różnych gęstości etykietowania i wartości szumu, które zazwyczaj reprezentują dwa główne ograniczenia dla równoległych pomiarów w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Nanometryczna dokładność¹⁷ uzyskana dla pojedynczych molekuł, przy użyciu kolejnych włączania/wyłączania fotoprzełączników lub optyki nieliniowej, może dostarczyć wyczerpujących obserwacji. Jest to podstawa metod nanoskopowych¹⁷, takich jak STORM¹⁸, PALM^19,20, RESOLFT²¹ lub STED^22,23, które często mogą wymagać obrazowania utrwalonych próbek. Głównym zadaniem jest wykrywanie i szacowanie ograniczonych dyfrakcją pików pochodzących z pojedynczych cząsteczek. W związku z tym, przy założeniu odpowiednich założeń, takich jak obsługa stałej dokładności pozycjonowania zamiast ruchu Browna, MTT doskonale nadaje się do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być zasadniczo stosowany w dowolnej skali: nie tylko w molekułach, ale także na przykład w komórkach lub zwierzętach. Dlatego MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowanie w skali molekularnej i komórkowej.

Protocol

W tym filmie prezentujemy pełny eksperyment śledzenia pojedynczych cząstek, używając kropek kwantowych skierowanych do konkretnego receptora błonowego. Głównym celem tego eksperymentu jest rozróżnienie różnych typów zachowań dyfuzji molekularnej mierzonych w błonie plazmatycznej żywych komórek. Rzeczywiście, ruchy molekularne powstające na błonie mogą zazwyczaj odbiegać od dyfuzji Browna, na przykład poprzez kierowanie liniowe lub ograniczanie się do nanodomen^26-29. Naszym celem jest jednoczesne śledzenie jak największej liczby receptorów, tak aby uzyskać obraz różnorodności powstającej w dynamice zachodzącej w błonie żywej komórki. Oczekuje się, że pozwoli to na rozszyfrowanie mechanizmów regulujących sygnalizację receptorów na powierzchni komórki.

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotuj próbkę komórkową: użyj przylegających komórek COS-7, które endogennie eksprymują receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)³⁰. Podczas pracy z żywymi komórkami bez antybiotyków należy upewnić się, że nie ma utajonych, niewykrywalnych zanieczyszczeń, stosując odpowiednie sterylne techniki przez cały czas przygotowania.
2. Hoduj komórki w kompletnym pożywce (DMEM z 10% surowicą cielęcą, 1% glutaminą, 1% HEPES i 1% pirogronianem sodu, patrz tabela konkretnych odczynników poniżej), w temperaturze 37 °C z 7% CO_{2 ,} uważając, aby miały one sub-konfluencyjny, wykładniczy wzrost przed rozprowadzeniem ich w Lab-Tek.
3. W dniu poprzedzającym eksperyment rozprowadź 5000 komórek/studzienkę w komorach 8-dołkowych (Lab-Tek) i inkubuj przez noc. Zliczanie komórek zapewnia stałą gęstość komórek, a tym samym powtarzalny stosunek kropek kwantowych na komórkę.

2. Etykietowanie komórek

Przygotuj kropki kwantowe ze specyficzną powłoką. Kropki kwantowe to fluorescencyjne nanocząstki zbudowane z półprzewodników. Nanocząstki te cieszą się dużym zainteresowaniem, ponieważ są bardzo jasne i fotostabilne w porównaniu z klasycznymi sondami fluorescencyjnymi^31,32, co pozwala na osiągnięcie odpowiedniego stosunku sygnału do szumu (SNR) dla obrazowania pojedynczych cząsteczek.

1. Przed eksperymentem należy wytworzyć fragmenty Fab przeciwko EGFR z linii komórkowej hybrydoma (mAb 108, ATCC HB-9764), poprzez trawienie z papainą, jak opisano wcześniej²¹.
2. Sprzężony Fab z biotyną, zgodnie z instrukcjami producenta (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotynylation Kit; Thermo Scientific, rys. 1A).
3. Użyj kropek kwantowych funkcjonalizowanych streptawidyną (Invitrogen) i emitujących przy 605 nm (optymalna długość fali emisji dla jasności, wykrywania i separacji od autofluorescencji komórkowej).
4. Przygotować roztwór do znakowania w kompletnym pożywce (patrz tabela określonych odczynników), w celu nasycenia streptawidyn obecnych wokół kropek kwantowych, jak również w celu zapobieżenia agregacji i niespecyficznemu wiązaniu się z komórkami i szkiełkiem nakrywkowym.
5. Przygotować dwa roztwory pośrednie: jeden z kropkami kwantowymi streptawidyną, a drugi z biotynylowanym Fab, każdy przy 20 nM.
6. Wymieszać równą objętość tych dwóch roztworów: zmieszać kropki kwantowe z Fab w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 10 nM kompleksu Fab:kropki kwantowe. Zastosowanie współczynnika równomolowego sprzyja tworzeniu monofunkcjonalizowanych kompleksów złożonych z jednej kropki kwantowej i jednego biotynylowanego fragmentu Fab. Sprzyja to znakowaniu monowalentnemu, ograniczając obserwacje artefaktów ze względu na sieciowanie receptorów^33,34.
7. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C, używając wytrząsarki z prędkością 1 200 obrotów na minutę, aby zapobiec agregacji. Mieszanka jest następnie gotowa do użycia na żywych komórkach.
8. Inkubować komórki w 100 μl mieszanki przez 5 minut w temperaturze 37 °C z 7% CO₂ .
9. Przemyć komórki nieautofluorescencyjnym podłożem do obrazowania (bufor HBSS, 1% HEPES, patrz tabela określonych odczynników) wstępnie ogrzanym w temperaturze 37 °C.
10. Ostrożnie usunąć nadmiar etykiet, aby zapobiec niepotrzebnemu zepsuciu sygnału do zmiany stosunku do szumu przez niezwiązane, nieostre kropki kwantowe, poprzez dokładne mycie każdej studzienki pożywką do obrazowania, zwykle 5 razy w temperaturze pokojowej, z co najmniej 5-minutowym opóźnieniem przed ostatnim praniem.

3. Konfiguracja optyczna

Zestaw wideomikroskopii składa się z czterech głównych części:

1. Mikroskop odwrócony ze specyficzną kostką fluorescencyjną (FF01-457/50 wzbudzenie, FF495-Di02 dichroiczne i FF01-617/73 filtry emisyjne, Semrock) i obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (1,3 lub 1,49) 100-krotnym zanurzeniem w oleju.
2. Lampa rtęciowa o mocy 100 W (sprzężona z mikroskopem za pomocą światłowodu, unikająca zakłóceń termoregulacji).
3. Kamera EMCCD o wysokiej czułości 512 x 512 pikseli, aby uzyskać wystarczający SNR.
4. Inkubator do utrzymywania próbek biologicznych w temperaturze 37 °C podczas eksperymentu.

4. Akwizycja

1. Wybierz izolowane i dobrze rozproszone komórki. Sprzyja to wydłużeniu ładnych, płaskich lamellipodiów, najlepiej przystosowanych do poszukiwania płaskiego ruchu cząsteczek błony.
2. Oceń stan fizjologiczny komórki na podstawie jej wyglądu zarówno w świetle przechodzącym, jak i we fluorescencji: intensywny ruch pęcherzykowy, brak objawów nekrotycznych lub apoptotycznych, niska autofluorescencja i średnio silne znakowanie kropkami kwantowymi (zwykle do 1,000 kropek kwantowych na komórkę, patrz ryc. 1B, C).
3. Wybierz wysoką gęstość znakowania, która ma kluczowe znaczenie dla jednoczesnego monitorowania jak największej liczby receptorów. W rzeczywistości jest to ograniczone zarówno przez parametry fizjologiczne (ekspresja powierzchni, dostępność epitopów, ruch boczny), jak i algorytmiczne (nienakładające się na siebie funkcje rozproszenia punktowego (PSF), nawet biorąc pod uwagę rozmycie spowodowane ruchem, aby umożliwić prawidłowe wykrycie i ponowne połączenie).
4. Dla każdej komórki najpierw uzyskaj obraz jasnego pola (najlepiej za pomocą DIC, jeśli jest dostępny), który może dodatkowo umożliwić sprawdzenie aspektu komórki i granic przestrzennych lamellipodiów.
5. Zapisz ten obraz pod tą samą nazwą, co stos wideo (na przykład cell1.tif i cell1.stk), w podfolderze o nazwie dic, ponieważ przy tych konwencjach algorytm może automatycznie znaleźć pasujący obraz dla każdego stosu.
6. Nagrywaj od 1 do 3 filmów na komórkę w sposób ciągły, zwykle z szybkością 36 ms, co jest najszybszą szybkością osiągalną w trybie pełnoklatkowym w tym aparacie. Można jednak rejestrować przy wyższych częstotliwościach, do 1 ms, za pomocą dedykowanego CCD o zwiększonej czułości i/lub mniejszej liczbie pikseli. Technologia przenoszenia ramek zapewnia znikome opóźnienie między klatkami.
7. Wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów powinno być zawsze ustawione na maksimum (nieco poniżej nasycenia, jeśli ma to zastosowanie), aby umożliwić osiągnięcie czułości pojedynczej cząsteczki, z wystarczającym SNR, co najmniej powyżej 20 dB (dla skutecznego wykrywania piku¹), zwykle około 25-30 dB.
8. Zazwyczaj uzyskuje 300 klatek na film, ponieważ trajektorie są rekonstruowane średnio w ciągu ~100 klatek, głównie ograniczonych długimi zdarzeniami mrugania. Częstotliwość i długość wideo można dostosować do danego pomiaru, co może wymagać na przykład dłuższych ścieżek.

5. Analiza MTT

1. Wybierz ścieżkę do katalogu zawierającego pliki wideo, aby ocenić dany zestaw danych za pomocą Matlaba lub Octave.
2. Aby rozpocząć w pełni zautomatyzowaną analizę^1,35, wpisz polecenie detect_reconnex23 w Octave lub MTT23i w Matlabie. Ten program oznacza "wersję 2.3, z interfejsem użytkownika" i jest dostępny do pobrania wraz z poprzednią wersją 2.2. Najpierw wyświetla interfejs graficzny z listą wszystkich użytych parametrów, jak pokazano na rys. 2.

6. Reprezentatywne wyniki

MTT automatycznie analizuje każdy obraz z rejestratora, aby dostarczyć ślady wykrytych i oszacowanych celów, uzupełnione dalszymi badaniami, takimi jak wykrywanie zamknięcia. Ostatecznie pozwala to na mapowanie śladów na obrazach komórek (rys. 1C i 3).

MTT Opis

Podstawowa analiza MTT jest wykonywana na każdej klatce, wywołując 3 główne zadania (Rys. 3):

1. Wykrywanie obecności lub braku celu (kropki kwantowej) w przesuwającym się podregionie kolejno wyśrodkowanym wokół każdego piksela, gdzie porównuje się dwie hipotezy: obecność sygnału, przy czym PSF jest modelowany jako dwuwymiarowy pik Gaussa, lub tylko szum, przy użyciu progu zapewniającego wystarczająco niski fałszywy alarm, z mniej niż jedną fałszywą detekcją na klatkę. W ten sposób powstaje mapa prawdopodobieństwa wykrycia. Każde lokalne maksimum jest traktowane jako przypuszczalny cel, zapewniając, że jego poziom prawdopodobieństwa jest wyższy niż wartość minimalna, ustawiona zgodnie z pożądanym prawdopodobieństwem fałszywego alarmu (PFA). Limit ten jest ustawiony na tyle nisko, aby skutecznie odróżniać sygnały od szumu, unikając w najlepszym razie fałszywych detekcji (PFA domyślnie ^10-6, aby zapewnić mniej niż jeden błąd w obrazach o rozdzielczości 512 x 512 pikseli), jednocześnie umożliwiając wystarczająco wysokie prawdopodobieństwo wykrycia, osiągając teoretycznie przewidywane optimum¹. Należy pamiętać, że wymóg użycia podregionu oznacza, że obramowania obrazu (3 piksele, dla domyślnego okna 7 x 7 pikseli) nie mogą być oceniane.
2. Oszacowanie, dla każdego wykrytego celu, odpowiednich parametrów, takich jak położenie subpikseli i intensywność sygnału. Dla każdego wykrytego celu wykonywane jest następnie dopasowanie Gaussa metodą najmniejszych kwadratów w celu oszacowania położenia, szerokości i wysokości wykrytego elementu Gaussa. Zapewnia to w szczególności subpikselowe położenie barwnika (dokładność od 10 do 20 nm dla typowych wartości SNR i nieruchomych lub wolno dyfuzyjnych barwników, wzrastająca do ~100 nm dla barwników dyfuzyjnych z prędkością 0,1 μm²/s).
3. Ponowne połączenie nowych celów ze śladami już utworzonymi w stosunku do poprzednich ramek. Zestaw nowych obiektów docelowych jest dopasowywany do zestawu poprzednich śladów. W tym celu, aby w miarę możliwości przypisać każdy cel do śladu, wykorzystuje się wszystkie dostępne informacje statystyczne uzyskane z etapu wykrywania, nie tylko pozycję, ale także intensywność, szerokość, mruganie i powiązane statystyki. W związku z tym cele nie są przypisywane tylko do najbliższej ścieżki: w przypadku przecinania śladów brana jest pod uwagę intensywność, prędkość, szerokość i mruganie. Zapewnia to statystycznie optymalny wynik ponownego połączenia. Ta strategia unika, jeśli to możliwe, uprzedzeń w kierunku najbliższych sąsiadów.

Wykryte piki mogą zostać a posteriori odrzucone, jeśli ich oszacowanie lub ponowne połączenie nie powiedzie się. Specjalny test zajmuje się wykrywaniem nowych pików, które inicjowałyby nowe ślady. W tym teście stosuje się bardziej rygorystyczny PFA (^10-7), ponieważ ponowne połączenie piku ze śladem może być de facto interpretowane jako potwierdzenie jego istotności (kryterium to z definicji nie ma zastosowania do nowych pików).

Analiza trajektorii

Możliwe przejściowe uwięzienie jest następnie oceniane przez funkcję odwrotnie proporcjonalną do lokalnej dyfuzji^24-29. Zastosowanie progu pozwala na zdefiniowanie epizodów ograniczonych lub nieograniczonych. Powtarzając je po wszystkich śladach, możemy zmapować dynamikę błony pod względem przejściowych zdarzeń związanych z uwięzieniem/spowolnieniem. Można to alternatywnie przedstawić za pomocą wartości binarnych lub dyskretnych tego indeksu ograniczenia.

Domyślnie, MTT automatycznie wykonuje te zadania, zapisując 8 parametrów szczytowych w pliku tekstowym: numer klatki, pozycja i i j, intensywność sygnału, promień, przesunięcie i mrugnięcie, dla każdej klatki wideo (grupa 7 wierszy) i ślad (kolumna). Te parametry wyjściowe można przeładować w Matlabie lub Octave za pomocą skryptu fread_data_spt do dalszej analizy, np. śladów lub intensywności sygnału, jak pokazano w skrypcie MTT_example w załączniku.

Dalsze analizy prowadzą do mapowania śladów na każdej komórce (Rys. 1C i 3) oraz do dostarczenia rozkładu histogramu dla odpowiednich parametrów (takich jak natężenia szczytów, SNR lub lokalne wartości dyfuzji). Dla każdego pliku średnia i odchylenie standardowe każdego parametru są zapisywane w pliku tekstowym wraz z obrazem histogramów. Rozkłady logarytmiczne, takie jak dla przemieszczeń kwadratowych r², prowadzą do średniej geometrycznej. Współczynnik dyfuzji D oblicza się na podstawie dopasowania liniowego w pięciu pierwszych punktach krzywej MSD. Wartości te stanowią przegląd eksperymentu obejmującego na przykład kinetykę reakcji komórkowych lub zabiegi farmaceutyczne/enzymatyczne wpływające na organizację błony. Ponieważ MTT jest kodem open-source, ten aspekt może być łatwo zaadaptowany do każdego dedykowanego dochodzenia.

Rysunek 1. Monitorowanie dynamiki receptorów błonowych za pomocą MTT. (A) Elementy błony, takie jak EGFR, są oznaczone kropkami kwantowymi sprzężonymi z biotynylowanymi fragmentami Fab (schematyczny rysunek z w przybliżeniu prawidłowym skalowaniem każdej cząsteczki). (B) Typowy obraz fluorescencyjny uzyskany z żywej komórki COS-7, z czasem ekspozycji 36 ms, przedstawiający piki ograniczone dyfrakcją odpowiadające indywidualnie znakowanemu receptorowi. (C) Dane wyjściowe analizy MTT przedstawiające odtworzone trajektorie receptorów, nałożone na obraz komórki w jasnym polu.

Rysunek 2. Parametry wejściowe MTT. Uruchomienie MTT23i otwiera graficzny interfejs użytkownika z listą wszystkich parametrów wejściowych, nazw i wartości domyślnych, zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji¹. W algorytmie parametry czasoprzestrzenne i przestrzenne (okna wyszukiwania, promień szczytu, maksymalna dyfuzja i mruganie) są wyrażone w bezwymiarowych jednostkach standardowych, pikselach i ramkach. Kalibracje mogą być stosowane a posteriori w celu konwersji wyników wyjściowych. Domyślne wartości, odpowiadające Cascade 512BFT ze 100-krotnym powiększeniem, to rozmiar piksela: 156 nm/pxl i opóźnienie klatki: 36 ms/klatkę.

Badacze powinni zoptymalizować kilka krytycznych parametrów, takich jak maksymalny oczekiwany współczynnik dyfuzji ("Diff max") i maksymalne zanik mrugania ("_{T off}"). Te dwa limity przestrzenne i czasowe są prawie jedynymi, które muszą być ponownie rozważone dla danego warunku eksperymentalnego, pozostałe są ustawione na solidne wartości domyślne. Na przykład liczba fałszywych alarmów jest ustawiona bezpośrednio tak, aby zapewnić mniej niż jeden błąd na milion pikseli, a więc mniej niż jeden na klatkę, co w większości przypadków jest zadowalające. Wszystkie parametry są zapisywane w pliku tekstowym w folderze wyjściowym, dzięki czemu użytkownicy mogą później zweryfikować, które ustawienia zostały użyte do analizy.

Rysunek 3. Główne etapy analizy MTT. Zaczynając od eksperymentalnego stosu obrazów fluorescencyjnych, piki są sekwencyjnie i automatycznie wykrywane, szacowane przez dopasowanie Gaussa i ponownie łączone w klatkach (pierwszy zakres operacji, górna część schematu blokowego). Ślady mogą być dalej analizowane pod kątem domniemanego zamknięcia, na przykład co ostatecznie prowadzi do dynamicznej mapy odpowiednich deskryptorów (drugi zakres operacji, dolna część).

Rysunek 4. Wartościowość etykietowania nie ma wpływu na MTT. Aby ocenić możliwe odchylenie wprowadzone przez artefaktowe znakowanie wielowartościowe, przeprowadzono analizę MTT w celu śledzenia endogennego EGFR oznaczonego przy użyciu 2 różnych schematów, w celu wygenerowania i przeanalizowania map trajektorii. (A) Receptory oznaczono biotynylowanym Fab i streptawidyną w kropkach kwantowych605, zgodnie z opisem w protokole. W tym przypadku wielowartościowość kropek kwantowych i streptawidyn może skutkować sprzężeniem kilku receptorów z jednym barwnikiem. (B) Receptory zostały oznaczone Fab bezpośrednio sprzężonym z organicznym barwnikiem, Atto647N. W tym przypadku jeden Fab, a więc jeden receptor, może być sprzężony z więcej niż jednym barwnikiem. (C) Krzywa przemieszczenia średniokwadratowego (MSD) została obliczona dla wszystkich śladów dla każdej komórki, oznaczonych barwnikami kropkami kwantowymi lub Atto (odpowiednio wykres po lewej i prawej). Współczynniki dyfuzji obliczono na podstawie dopasowania liniowego w pięciu pierwszych punktach MSD (czerwona linia przerywana). Każdy schemat etykietowania prowadził do podobnych wartości dyfuzji (wykres centralny). Qdot: kropki kwantowe605 (n = 5 komórek), Atto: Atto647N (n = 7 komórek), ns: nieistotne (wartość p testu t Studenta > 0,05).

Discussion

W śledzeniu pojedynczych cząstek, obok aspektów komórkowych i mikroskopowych, analiza stanowi istotną część pracy. Dotyczy to algorytmu używanego do wykonywania trzech głównych zadań: wykrywania, szacowania i ponownego łączenia pików w każdej klatce. Jednak konsekwentny aspekt tej pracy polega na opracowaniu samego algorytmu, który może wymagać dostosowania do każdego nowego dedykowanego badania, zasadniczo do ostatnich, dodatkowych kroków (takich jak rozszyfrowywanie trybów ruchu, interakcji lub stechiometrii).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linia komórkowa Cos-7	ATCC	CRL-1651	5,000 komórek/studzienkę
HBSS bez Ca2+	GIBCO, firmy Life Technologies	14175	1 ml
0,05% trypsyny EDTA	GIBCO, firmy Life Technologies	25300	1 ml
8-dołkowy Lab-tek	Nalge Nunc international	155441	1
QDot-605 streptawidyna	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (synteza Fab, patrz odniesienie 21)
Fab z mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μ g
NHS-Biotyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21435	18.5 Μ g
Complete medium
DMEM	GIBCO, firmy Life Technologies	41965	500 ml
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F7524	50 ml
L-Glutamina	GIBCO, firmy Life Technologies	25030	5 ml
HEPES	GIBCO, firmy Life Technologies	15630	5 ml
Sód Pirogronian	GIBCO, firmy Life Technologies	11360	5 ml
Pożywka do obrazowania
HBSS z Ca2+	GIBCO, firmy Life Technologies	14025	25 ml
HEPES	GIBCO, firmy Life Technologies	15630	250 μ l
Mikroskop odwrócony	Instrumenty Nikon	Zaćmienie TE2000U
Lampa fluorescencyjna	Nikon Instruments	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x	obiektyw Nikon Instruments	Plan Fluor 1.30
NA 100x	Aparat
	Roper Scientific	Cascade 512 B
Termostatyzowane pudełko	Usługi obrazowania życia	The Box
Dodatek: przykładowy skrypt uzupełniającej analizy MTT
function MTT_example/strong(file_name) %%% Podstawowe przykłady pokazujące, jak odzyskać wyniki wyjściowe MTT %%%%, aby wykreślić każdy ślad i zbudować histogram %%% fluorescencji intensywności
if nargin< 1 % nie podano file_name? files = dir('*.stk'); if isempty(pliki), disp('brak danych w bieżącym katalogu'), return, end file_name = files(1).name; % domyślnie: pierwszy plik stk disp(['używanie' file_name 'domyślnie']) end
file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % pliku wyjściowego
%% Załaduj dane cd('output23') % lub (‘ output22'), w zależności od używanej wersji % Zastrzeżenie: wersja 2.2 generuje tylko 7 parametrów, % w wersji 2.3 dodano dodatkowy parametr, szum
% Aby odczytać wszystkie parametry jednocześnie, w jednej tabeli % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:koniec, :); tab_j = ...
% Aby odczytać wszystkie parametry (z wyjątkiem frame_number) w osobnych tabelach % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % indeks wynosi 3, ponieważ liczba śladu i numer ramki, nieinformacyjne, są odrzucane! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Pętla po śladach N_traces = size(tab_i,1); % Tabele są N_traces wierszy według kolumn N_frames
for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)> 0; % tylko niemigające kroki plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (piksel)'), ylabel('j (piksel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Proszę uderzyć w dowolny, aby przejść dalej'), pauza end
%% Histogram fluo N_datapoints = sum(tab_blk(:)> 0); Tylko % kroków bez mrugania hist(tab_alpha(tab_blk> 0),2*sqrt(N_datapoints)) % przy użyciu pojemników 2sqrt(N) xlabel('intensywność (a.u.)'), ylabel('występowanie') title('histogram intensywności fluorescencji cząstek')