Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naszym celem jest uzyskanie kompleksowego opisu procesów molekularnych zachodzących w błonach komórkowych w różnych funkcjach biologicznych. Dążymy do scharakteryzowania złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczych cząsteczek poprzez opracowanie narzędzi analitycznych dedykowanych śledzeniu pojedynczych cząstek (Single-Particle Tracking, SPT) przy wysokiej gęstości: śledzeniu wielu celów (Multiple-Target Tracing, MTT)1. Wideomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca rozdzielczość milisekundową i nanometryczną1-11, pozwala na szczegółowe przedstawienie organizacji błony12-14 poprzez dokładne mapowanie deskryptorów, takich jak lokalizacja, mobilność, ograniczenie przestrzenne lub oddziaływania receptorów komórkowych.
Ponownie przeanalizowaliśmy SPT, zarówno pod kątem eksperymentalnym, jak i algorytmicznym. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację układu i znakowania komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie jak najwyższej gęstości znakowania, aby uzyskać dynamiczny obraz dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Kwestie algorytmiczne dotyczyły każdego etapu rekonstrukcji trajektorii: detekcji szczytów, ich estymacji i łączenia, co rozwiązano za pomocą specyficznych narzędzi analizy obrazu15,16. Zaimplementowanie deflacji po detekcji pozwala na odzyskanie szczytów początkowo przesłoniętych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zauważyć, że poprawa detekcji bezpośrednio wpływa na łączenie trajektorii poprzez redukcję przerw w ich przebiegu. Wydajność została oceniona przy użyciu symulacji Monte-Carlo dla różnych wartości gęstości znakowania i poziomu szumu, które zazwyczaj stanowią dwa główne ograniczenia dla pomiarów równoległych o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.
Dokładność nanometryczna17 uzyskiwana dla pojedynczych cząsteczek, przy użyciu następczego przełączania fotoaktywacyjnego on/off lub optyki nieliniowej, pozwala na przeprowadzenie wyczerpujących obserwacji. Stanowi to podstawę metod nanoskopii17, takich jak STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 lub STED22,23, które często wymagają obrazowania próbek utrwalonych. Kluczowym zadaniem jest detekcja i estymacja ograniczonych dyfrakcyjnie pików pochodzących od pojedynczych cząsteczek. Zatem, przy zastosowaniu odpowiednich założeń, takich jak przyjęcie stałej dokładności pozycyjnej zamiast ruchu Browna, MTT jest bezpośrednio odpowiednie do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być fundamentalnie stosowane w każdej skali: nie tylko dla cząsteczek, ale na przykład również dla komórek lub zwierząt. Tym samym MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowania w skalach molekularnej i komórkowej.
Protokół
W tym filmie przedstawiamy pełny eksperyment śledzenia pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem kropek kwantowych skierowanych przeciwko konkretnemu receptorowi błonowemu. Głównym celem tego eksperymentu jest rozróżnienie różnych typów zachowań dyfuzji molekularnej mierzonych w błonie plazmatycznej żywych komórek. Rzeczywiście, ruchy molekularne występujące w błonie mogą zazwyczaj odbiegać od dyfuzji Browna, będąc na przykład ukierunkowane liniowo lub ograniczone w obrębie nanodomen26-29. Naszym celem jest jednoczesne śledzenie tak wielu receptorów, jak to technicznie możliwe, aby uzyskać obraz różnorodności dynamiki zachodzącej w błonie żywej komórki. Oczekuje się, że w ostateczności pozwoli to na odczytanie mechanizmów regulujących sygnalizację receptorów powierzchni komórki.
1. Hodowla komórkowa
- Przygotować próbkę komórkową: wykorzystać adhezyjne komórki COS-7, które endogennie wykazują ekspresję receptora epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR)30. Podczas pracy z żywymi komórkami bez antybiotyków należy upewnić się, że nie występuje utajone, niewykrywalne zanieczyszczenie, stosując przez cały czas przygotowania odpowiednie techniki sterylne.
- Hodować komórki w pożywce kompletnej (DMEM z 10% serum cielęcego, 1% glutaminy, 1% HEPES i 1% pirogronianu sodu, patrz tabela specyficznych odczynników poniżej), w temperaturze 37 °C przy 7% CO2, dbając o to, aby znajdowały się one w fazie wzrostu wykładniczego przed osiągnięciem pełnej konfluencji, przed wysianiem ich do Lab-Tek.
- W dniu poprzedzającym eksperyment wysiać 5 000 komórek/studnię w komorach 8-studzienkowych (Lab-Tek) i inkubować przez noc. Odliczanie komórek zapewnia stałą gęstość komórkową, a tym samym powtarzalny stosunek kropek kwantowych na jedną komórkę.
2. znakowanie komórek
Przygotuj kropki kwantowe z odpowiednią powłoką. Kropki kwantowe są fluorescencyjnymi nanocząstkami zbudowanymi z półprzewodników. Nanocząstki te budzą duże zainteresowanie, ponieważ są bardzo jasne i fotostabilne w porównaniu z klasycznymi sondami fluorescencyjnymi31,32, co pozwala na osiągnięcie odpowiedniego stosunku sygnału do szumu (SNR) w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować fragmenty Fab przeciwko EGFR z linii komórkowej hybridoma (mAb 108, ATCC HB-9764) poprzez trawienie papainą, zgodnie z wcześniejszym opisem21.
- Należy skoniugować Fab z biotyną zgodnie z instrukcjami producenta (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, Rys. 1A).
- Należy zastosować kropki kwantowe funkcjonalizowane streptawidyną (Invitrogen), emitujące przy 605 nm (optymalna długość fali emisji dla jasności, detekcji i oddzielenia od autofluorescencji komórkowej).
- Należy przygotować roztwór znakujący w pełnej pożywce (patrz tabela specyficznych odczynników), aby nasycić streptawidyny obecne wokół kropek kwantowych, a także zapobiec agregacji i niespecyficznemu wiązaniu do komórek oraz do szkiełka podstawowego.
- Należy przygotować dwa roztwory pośrednie: jeden z kropkami kwantowymi-streptawidyną i drugi z biotynylowanym Fab, każdy w stężeniu 20 nM.
- Należy zmieszać równe objętości tych dwóch roztworów: zmieszać kropki kwantowe z Fab w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie robocze kompleksu Fab:kropki kwantowe wynoszące 10 nM. Zastosowanie stosunku ekimolarnego sprzyja tworzeniu kompleksów monofunkcjonalnych, składających się z jednej kropki kwantowej i jednego biotynylowanego fragmentu Fab. Sprzyja to znakowaniu monowalentnemu, ograniczając obserwację artefaktów wynikających z sieciowania receptorów33,34.
- Inkubować przez 15 minut w 25 °C, używając wytrząsarki przy 1 200 obrotach na minutę, aby zapobiec agregacji. Mieszanina jest następnie gotowa do użycia na żywych komórkach.
- Inkubować komórki w 100 μl mieszaniny przez 5 minut w 37 °C z 7% CO2.
- Przemyć komórki nieautofluorescencyjną pożywką do obrazowania (bufor HBSS, 1% HEPES, patrz tabela specyficznych odczynników) uprzednio ogrzaną do 37 °C.
- Ostrożnie usunąć nadmiar znaczników, aby zapobiec niepotrzebnemu pogorszeniu SNR przez niezwiązane, poza ogniskową kropki kwantowe, poprzez dokładne przemycie każdej studzienki pożywką do obrazowania, zazwyczaj 5 razy w temperaturze pokojowej, z co najmniej 5-minutową przerwą przed ostatnim płukaniem.
3. Układ optyczny
Układ wideomikroskopowy składa się z czterech głównych części:
- Mikroskop odwrócony z odpowiednim kostkami fluorescencyjnymi (filtry wzbudzenia FF01-457/50, dichroiczny FF495-Di02 oraz emisyjny FF01-617/73, Semrock) oraz obiektywem imersyjnym olejowym 100x o wysokiej aperturze numerycznej (1.3 lub 1.49).
- Lampa rtęciowa 100 W (połączona z mikroskopem za pomocą światłowodu, aby uniknąć zakłóceń w termoregulacji).
- Kamera EMCCD o wysokiej czułości i rozdzielczości 512 x 512 pikseli w celu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu (SNR).
- Inkubator do utrzymywania próbek biologicznych w temperaturze 37 °C podczas eksperymentu.
4. Akwizycja
- Wybierz odizolowane i dobrze rozprzestrzenione komórki. Sprzyja to powstawaniu ładnych, płaskich lamellipodiów, które najlepiej nadają się do obserwacji ruchu planarnego cząsteczek błonowych.
- Oceń stan fizjologiczny komórki na podstawie jej wyglądu zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym: intensywny transport pęcherzykowy, brak oznak nekrozy lub apoptozy, niska autofluorescencja oraz średnio-silne znakowanie kropkami kwantowymi (zazwyczaj do 1 000 kropek kwantowych na komórkę, patrz Ryc. 1B, C).
- Wybierz wysoką gęstość znakowania, co jest krytyczne dla jednoczesnego monitorowania jak największej liczby receptorów. Jest to w rzeczywistości ograniczone zarówno przez parametry fizjologiczne (ekspresja powierzchniowa, dostępność epitopu, ruch lateralny), jak i algorytmiczne (niezachodzące na siebie funkcje rozproszenia punktu (PSF), nawet przy uwzględnieniu rozmycia wynikającego z ruchu, aby umożliwić prawidłową detekcję i ponowne połączenie).
- Dla każdej komórki wykonaj najpierw obraz w polu jasnym (preferencyjnie z użyciem DIC, jeśli jest dostępny), co pozwoli w dalszej kolejności sprawdzić wygląd komórki i granice przestrzenne lamellipodiów.
- Zapisz ten obraz, używając tej samej nazwy co stos wideo (na przykład cell1.tif i cell1.stk), w podfolderze o nazwie dic, ponieważ przy takich konwencjach algorytm może automatycznie odnaleźć pasujący obraz dla każdego stosu.
- Nagraj od 1 do 3 filmów na komórkę, w sposób ciągły, zazwyczaj z częstotliwością 36 ms, co jest najszybszym tempem osiągalnym w pełnej klatce przy użyciu tej kamery. Można jednak rejestrować z wyższymi częstotliwościami, do 1 ms, korzystając z dedykowanych matryc CCD o zwiększonej czułości i/lub mniejszej liczbie pikseli. Technologia transferu klatek zapewnia pomijalne opóźnienie między klatkami.
- Wzmocnienie mnożnika elektronowego powinno być zawsze ustawione na maksimum (tuż poniżej saturacji, jeśli dotyczy), aby umożliwić osiągnięcie czułości na poziomie pojedynczej cząsteczki, z wystarczającym SNR, co najmniej powyżej 20 dB (dla efektywnej detekcji piku1), zazwyczaj około 25-30 dB.
- Zazwyczaj rejestruje się 300 klatek na film, ponieważ trajektorie są rekonstruowane średnio z około 100 klatek, co jest głównie ograniczone przez długie zdarzenia mrugania. Częstotliwość i długość filmu mogą być dostosowane do konkretnego pomiaru, który mógłby wymagać na przykład dłuższych śladów.
5. Analiza MTT
- Wybierz ścieżkę do katalogu zawierającego pliki wideo, aby ocenić dany zestaw danych za pomocą programu Matlab lub Octave.
- Aby rozpocząć w pełni zautomatyzowaną analizę1,35, wpisz polecenie detect_reconnex23 w programie Octave lub MTT23i w programie Matlab. Program ten oznacza „wersję 2.3 z interfejsem użytkownika” i jest dostępny do pobrania wraz z poprzednią wersją 2.2. Najpierw wyświetla on interfejs graficzny z listą wszystkich użytych parametrów, jak pokazano na Rys. 2.
6. Reprezentatywne wyniki
MTT automatycznie analizuje każde nagranie wideo, aby dostarczyć ścieżki wykrytych i oszacowanych celów, uzupełnione o dalsze analizy, takie jak wykrywanie uwięzienia. Pozwala to w efekcie na nałożenie ścieżek na obrazy komórek (Rys. 1C i 3).
Opis MTT
Podstawowa analiza MTT jest przeprowadzana dla każdej klatki, obejmując 3 główne zadania (Ryc. 3):
- Detekcja obecności lub braku celu (kropki kwantowej) w obrębie przesuwającego się podregionu, kolejno centrowanego wokół każdego piksela, gdzie porównuje się dwie hipotezy: obecność sygnału, z PSF modelowanym jako dwuwymiarowy pik Gaussa, lub obecność samego szumu, przy zastosowaniu progu zapewniającego odpowiednio niski poziom fałszywych alarmów, z liczbą mniej niż jednej błędnej detekcji na klatkę. Prowadzi to do uzyskania mapy prawdopodobieństwa detekcji. Każde lokalne maksimum jest traktowane jako potencjalny cel, pod warunkiem, że jego poziom prawdopodobieństwa jest wyższy od wartości minimalnej, określonej zgodnie z pożądanym prawdopodobieństwem fałszywego alarmu (PFA). Limit ten jest ustawiony na poziomie na tyle niskim, aby skutecznie odróżnić sygnały od szumu, minimalizując liczbę błędnych detekcji (domyślnie PFA rzędu 10-6, aby zapewnić mniej niż jeden błąd w obrazach o wymiarach 512 x 512 pikseli), przy jednoczesnym zachowaniu wystarczająco wysokiego prawdopodobieństwa detekcji, osiągającego teoretycznie przewidziane optimum1. Należy zauważyć, że wymóg zastosowania podregionu sprawia, iż brzegi obrazu (3 piksele dla domyślnego okna o wymiarach 7 x 7 pikseli) nie mogą zostać poddane ocenie.
- Estymacja odpowiednich parametrów dla każdego wykrytego celu, takich jak pozycja podpikselowa i intensywność sygnału. Dla każdego wykrytego celu przeprowadza się następnie dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów Gaussa-Newtona w celu oszacowania pozycji, szerokości i wysokości wykrytej funkcji Gaussa. Pozwala to w szczególności na wyznaczenie pozycji podpikselowej barwnika (dokładność od 10 do 20 nm dla typowych wartości SNR oraz barwników nieruchomych lub powoli dyfundujących, wzrastająca do ~100 nm dla barwników dyfundujących z prędkością 0,1 μm2/s).
- Rekoneksja nowych celów ze śladami zbudowanymi na podstawie poprzednich klatek. Zbiór nowych celów jest dopasowywany do zbioru poprzednich śladów. W tym celu, aby przypisać każdy cel do śladu (jeśli jest to możliwe), wykorzystuje się wszystkie dostępne informacje statystyczne uzyskane na etapie detekcji – nie tylko pozycję, ale także intensywność, szerokość, mruganie (blinking) oraz statystyki powiązane. Zatem cele nie są przypisywane jedynie do najbliższego śladu: w przypadku krzyżujących się śladów brane będą pod uwagę intensywność, prędkość, szerokość i mruganie. Pozwala to uzyskać statystycznie optymalny wynik rekoneksji. Strategia ta pozwala, w miarę możliwości, uniknąć faworyzowania najbliższych sąsiadów podczas procesu łączenia.
Wykryte piki mogą zostać odrzucone a posteriori, jeśli ich estymacja lub ponowne połączenie okażą się nieudane. Specjalny test obsługuje wykrywanie nowych pików, które inicjowałyby nowe ślady. Test ten wykorzystuje bardziej rygorystyczny PFA (10-7), ponieważ ponowne połączenie piku ze śladem może być interpretowane de facto jako walidacja jego istotności (kryterium to z definicji nie ma zastosowania w przypadku nowych pików).
Analiza trajektorii
W następnym kroku oceniono możliwe przejściowe ograniczenie (transient confinement) za pomocą funkcji odwrotnie proporcjonalnej do dyfuzji lokalnej24-29. Zastosowanie wartości progowej pozwala na zdefiniowanie epizodów ograniczenia lub ich braku. Poprzez iterację tych zdarzeń we wszystkich śladach można zmapować dynamikę błony pod kątem zdarzeń przejściowego ograniczenia/spowolnienia. Można to przedstawić alternatywnie, wykorzystując binarne lub dyskretne wartości tego indeksu ograniczenia.
Domyślnie MTT automatycznie wykonuje te zadania, zapisując 8 parametrów piku w pliku tekstowym: numer klatki, pozycję i oraz j, intensywność sygnału, promień, przesunięcie (offset) oraz mrugnięcie (blink), dla każdej klatki wideo (grupa 7 wierszy) i śladu (kolumna). Te parametry wyjściowe można ponownie załadować do programu Matlab lub Octave za pomocą skryptu fread_data_spt w celu dalszej analizy, np. śladów lub intensywności sygnału, co zilustrowano w skrypcie MTT_example w aneksie.
Dalsze analizy pozwalają na mapowanie śladów w każdej komórce (Ryc. 1C i 3) oraz na przedstawienie rozkładów histogramów dla istotnych parametrów (takich jak intensywności szczytów, SNR lub lokalne wartości dyfuzji). Dla każdego pliku średnia i odchylenie standardowe każdego parametru są zapisywane w pliku tekstowym wraz z obrazem histogramów. Rozkłady logarytmiczne, np. dla przesunięć kwadratowych r2, prowadzą do wyznaczenia średniej geometrycznej. Współczynnik dyfuzji D jest obliczany na podstawie dopasowania liniowego dla pięciu pierwszych punktów krzywej MSD. Wartości te zapewniają przegląd eksperymentu obejmującego na przykład kinetykę reakcji komórkowych lub zabiegi farmaceutyczne/enzymatyczne wpływające na organizację błony. Ponieważ MTT jest kodem otwartoźródłowym, aspekt ten można łatwo dostosować do dowolnych specjalistycznych badań.
Rycina 1. Monitorowanie dynamiki receptorów błonowych za pomocą MTT. (A) Komponenty błony, takie jak EGFR, są znakowane kropkami kwantowymi sprzężonymi z biotynowanymi fragmentami Fab (rysunek schematyczny z przybliżoną skalą każdej cząsteczki). (B) Typowy obraz fluorescencyjny uzyskany z żywej komórki COS-7, z czasem ekspozycji 36 ms, przedstawiający piki ograniczone dyfrakcyjnie, odpowiadające poszczególnym znakowanym receptorom. (C) Wynik analizy MTT przedstawiający zrekonstruowane trajektorie receptorów, nałożone na obraz komórki w jasnym polu.
Rysunek 2. Parametry wejściowe MTT. Uruchomienie MTT23i otwiera graficzny interfejs użytkownika wyświetlający wszystkie parametry wejściowe, nazwy i wartości domyślne, zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji1. W algorytmie parametry przestrzenne i czasowe (okna wyszukiwania, promień piku, maksymalna dyfuzja i migotanie) podane są w bezwymiarowych jednostkach standardowych: pikselach i klatkach. Kalibracje mogą być zastosowane a posteriori w celu przeliczenia wyników wyjściowych. Wartości domyślne, odpowiadające Cascade 512BFT z powiększeniem 100x, to rozmiar piksela: 156 nm/pxl oraz opóźnienie klatki: 36 ms/frame.
Badacze powinni zoptymalizować kilka krytycznych parametrów, takich jak maksymalny oczekiwany współczynnik dyfuzji („Diff max”) oraz maksymalny czas zaniku migotania („Toff”). Te dwa limity przestrzenne i czasowe są niemal jedynymi parametrami, które wymagają ponownego rozważenia dla danej warunki eksperymentalnej; pozostałe ustawione są na stabilne wartości domyślne. Na przykład, liczba fałszywych alarmów jest ustawiona bezpośrednio tak, aby zapewnić mniej niż jeden błąd na milion pikseli, a zatem mniej niż jeden na klatkę, co w większości przypadków jest satysfakcjonujące. Wszystkie parametry są zapisywane w pliku tekstowym w folderze wyjściowym, co pozwala użytkownikom na późniejszą weryfikację ustawień wykorzystanych do analizy.
Rycina 3. Główne etapy analizy MTT. Począwszy od eksperymentalnego stosu obrazów fluorescencyjnych, piki są sekwencyjnie i automatycznie wykrywane, szacowane za pomocą dopasowania Gaussa i ponownie łączone w ramach klatek (pierwszy zakres operacji, górna część schematu blokowego). Ślady mogą być następnie analizowane pod kątem domniemanego uwięzienia, co na koniec prowadzi np. do stworzenia mapy dynamicznej odpowiednich deskryptorów (drugi zakres operacji, dolna część).
Rycina 4. Walencyjność znakowania nie wpływa na MTT. Aby ocenić możliwe obciążenie wprowadzone przez artefakt wielowartościowego znakowania, przeprowadzono analizę MTT w celu śledzenia endogennego EGFR znakowanego za pomocą dwóch różnych schematów, aby wygenerować i przeanalizować mapy trajektorii. (A) Receptory zostały znakowane biotynيلowanymi fragmentami Fab oraz kropkami kwantowymi quantum-dots605-streptawidyną, zgodnie z opisem w protokole. W tym przypadku wielowartościowość kropek kwantowych i streptawidyn może prowadzić do sprzężenia kilku receptorów z jednym barwnikiem. (B) Receptory zostały znakowane fragmentami Fab bezpośrednio sprzężonymi z organicznym barwnikiem Atto647N. W tym przypadku jeden fragment Fab, a zatem jeden receptor, może być sprzężony z więcej niż jednym barwnikiem. (C) Krzywa średniego kwadratu przemieszczenia (MSD) została obliczona dla wszystkich śladów w każdej komórce, znakowanej albo kropkami kwantowymi, albo barwnikami Atto (odpowiednio wykresy lewy i prawy). Współczynniki dyfuzji obliczono za pomocą dopasowania liniowego dla pięciu pierwszych punktów MSD (czerwona przerywana linia). Każdy schemat znakowania doprowadził do podobnych wartości dyfuzji (wykres środkowy). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 komórek), Atto: Atto647N (n = 7 komórek), ns: brak istotności (wartość p testu t Studenta > 0,05).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W śledzeniu pojedynczych cząsteczek, poza aspektami dotyczącymi komórek i mikroskopii, analiza stanowi istotną część pracy. Dotyczy to algorytmu wykorzystywanego do wykonania trzech głównych zadań: detekcji, estymacji i ponownego łączenia pików w każdej klatce. Kolejnym aspektem tej pracy jest dopracowanie samego algorytmu, który może wymagać adaptacji do każdego nowego, dedykowanego badania, w szczególności w przypadku końcowych, dodatkowych kroków (takich jak określanie trybów ruchu, oddziaływań lub stechiometrii).
...Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom naszego zespołu, w szczególności MC Blache za pomoc techniczną, a także M Irla i B Imhof za wsparcie i owocne dyskusje. Ryciny dotyczące deflacji i ograniczenia przestrzennego (confinement) zostały powtórzone dzięki uprzejmości Nature Methods. Projekt ten jest wspierany przez granty instytucjonalne CNRS, INSERM i Uniwersytetu w Marsylii, a także przez specyficzne granty z Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI-0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) oraz Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z Ligue Nationale Contre le Cancer.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Linia komórkowa Cos-7 | ATCC | CRL-1651 | 5 000 komórek/dołek |
| HBSS bez Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0,05% Trypsyna EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| płytka Lab-tek 8-dołkowa | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| streptawidyna QDot-605 | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotynilowany fragment Fab (w celu syntezy fragmentów Fab należy zapoznać się z publikacją 21) | |||
| Fragment Fab przeciwciała monoklonalnego 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-biotyna | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Pożywka kompletna | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| pirowinian sodu | GIBCO, firmy Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Medium obrazujące | |||
| HBSS z Ca2+2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Mikroskop odwrócony | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Lampa fluorescencyjna | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| Obiektyw 100x o aperturze numerycznej (NA) 1,3 | Nikon Instruments | Obiektyw Plan Fluor 1,30 | |
| obiektyw 100x NA 1,49 | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Kamera | Roper Scientific | Kaskada 512 B | |
| Komora termostatowana | Usługi obrazowania żywych komórek | Pudełko | |
| Dodatek: przykładowy skrypt uzupełniającej analizy MTT | |||
| funkcja MTT_przykład(nazwa_pliku) Podstawowe przykłady pokazujące, jak odzyskać wyniki wyjściowe z MTT %%% aby wykreślić każdy ślad i sporządzić histogram %%% intensywności fluorescencji | |||
| jeśli nargin&<1 % brak podanej nazwy pliku? pliki = dir('*.stk'); jeśli isempty(files), disp('brak danych w bieżącym katalogu'), powrót, koniec file_name = files(1).name; % domyślnie: pierwszy plik stk disp(['używanie' file_name 'domyślnie']) Koniec | |||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % plik wyjściowy | |||
| %% Wczytaj dane cd('output23') % lub (‘wynik22'), zgodnie z używaną wersją % Zastrzeżenie: wersja 2.2 generuje tylko 7 parametrów, % w wersji 2.3 dodano dodatkowy parametr: szum (noise) | |||
| % Aby odczytać wszystkie parametry jednocześnie, w jednej tabeli % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... | |||
| % Aby odczytać wszystkie parametry (z wyjątkiem frame_number) w osobnych tabelach % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); | |||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % indeks wynosi 3, ponieważ jest to numer śladu &numer klatki, który nie dostarcza istotnych informacji, zostaje odrzucony! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); | |||
| %% Pętla dla śladów N_traces = size(tab_i,1); % Tabele mają N_traces wierszy i N_frames kolumn | |||
| dla itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % tylko etapy bez migotania plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (piksel)'), ylabel('j (piksel)') title(['ścieżka nr ' num2str(itrc)]) disp('Proszę nacisnąć dowolny klawisz, aby przejść do następnego śladu'), pause Koniec | |||
| %% Histogram fluorescencji N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % tylko kroki bez migotania hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % stosując 2sqrt(N) przedziałów xlabel('intensywność (a.u.)'), ylabel('częstotliwość występowania') tytuł('histogram intensywności fluorescencji cząstek') |
Bibliografia
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
