Spektrometria mas MALDI-TOF została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania wymiany wodoru/deuteru w wiązaniach amidowych podczas aktywacji kinazy białkowej Pak2.
Artykuł metodologiczny
Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wymiana wodoru na deuter (wymiana H/D) w grupach amidowych sprzężona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana do analizy powierzchni oddziaływań białko-białko, zmian konformacyjnych białek, dynamiki białek oraz oddziaływań białko-ligand. Wymiana H/D w pozycjach amidowych szkieletu białkowego jest wykorzystywana do pomiaru szybkości deuteracji mikroregionów w białku za pomocą spektrometrii mas1,2,3. Rozdzielczość tej metody zależy od trawienia pepsyną deuterowanego białka docelowego do peptydów, które zazwyczaj obejmują od 3 do 20 reszt. Chociaż rozdzielczość wymiany H/D mierzonej spektrometrią mas jest niższa niż rozdzielczość pojedynczej reszty uzyskiwana metodą Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) w NMR, pomiar spektrometrią mas w wymianie H/D nie jest ograniczony rozmiarem białka4. Wymiana H/D jest przeprowadzana w roztworze wodnym, który utrzymuje konformację białka. Przedstawiamy metodę wykorzystującą MALDI-TOF do detekcji2 zamiast systemu HPLC/ESI (jonizacja przez rozpylanie)-MS5,6. MALDI-TOF dostarcza dokładne dane o intensywności masy dla peptydów trawionego białka, w tym przypadku kinazy białkowej Pak2 (zwanej również γ-Pak). Proteoliza Pak 2 jest przeprowadzana w ramach offline’owego trawienia pepsyną. Ta alternatywna metoda jest stosowana, gdy użytkownik nie ma dostępu do układu HPLC i kolumny z pepsyną połączonych ze spektrometrem mas lub gdy kolumna z pepsyną w układzie HPLC nie daje optymalnej mapy trawienia, na przykład w przypadku wydzielanej fosfolipazy A2 (sPLA2) z licznymi mostkami dwusiarczkowymi. Wykorzystując tę metodę, z sukcesem monitorowaliśmy zmiany w poziomie deuteracji podczas aktywacji Pak2 poprzez cięcie przez kaspazę 3 oraz autofosforylację7,8,9.
Protokół
1. Aktywacja Pak2
- Do 20 μl Pak2 o stężeniu 12 mg/ml w buforze A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl oraz 2 mM DTT przy pH 7,5) dodać odpowiednią, uprzednio przetestowaną ilość kaspazy 3 i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 min, aby całkowicie rozciąć i aktywować Pak2.
- Produkty rozcięcia przeanalizować metodą SDS-PAGE (10 %) i barwienia błękitem Coomassie.
- Rozcięty Pak2 przenieść do buforu aktywacyjnego B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) o pH 7,5 w objętości 20 μl do stężenia końcowego 10 mg/ml Pak2, a następnie inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 min, aby w pełni aktywować Pak2 poprzez autofosforylację w 8 miejscach.
- Całkowite rozcięcie Pak2 potwierdzić na podstawie migracji fragmentów p34 i p27 w analizie SDS-PAGE10. Prawidłową weryfikację warunków autofosforylacji przeprowadza się w osobnym eksperymencie za pomocą autoradiografii z użyciem (32P)ATP lub spektrometrii mas w celu wykrycia fosfopeptydów.
2. Identyfikacja fragmentów Pak2 po trawieniu pepsyną
- Dodaj 1 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) o pH 2,5, aby dwukrotnie przemyć kulki agarozowe przed użyciem. Następnie odwiruj próbki przez 15 s przy 2 000 x g, aby usunąć kulki.
- Dodaj Pak2 (20 μg w 2 μl 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl i 2 mM DTT o pH 7,5) do 100 μl 0,1% TFA i inkubuj próbkę przez 5 min z 30 μl kulki agarozowe sprzężone z pepsyną.
- Urównoważ kolumnę HPLC C18 w odwróconej fazie, stosując główny układ rozpuszczalników składający się z 0,1% TFA o pH 2,5. Trawienie pepsyną (50 μl) jest eluowane przy użyciu liniowego 100-minutowego gradientu 0 - 80% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA przy szybkości przepływu 0,2 ml/min. Frakcje są zbierane co 2 min.
- Osusz frakcje HPLC w wirówce próżniowej (3 h) i resuspenduj próbki w roztworze acetonitrylu (5 μl) i 0,1% TFA (5 μl) o pH 2,5.
- W pierwszej kolejności każdą frakcję przesiewano pod kątem obecności peptydów przy użyciu MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).
- 16 frakcji zawierających peptydy poddano tandemowej spektrometrii mas z wykorzystaniem spektrometru mas Q-TOF oraz QSTAR XL oMALDI MS/MS w celu identyfikacji fragmentów.
- Sekwencja każdego peptydu została zweryfikowana poprzez porównanie jonów produktowych generowanych w tandemowej spektrometrii mas z teoretycznymi stosunkami m/z na podstawie sekwencji pierwotnej Pak2, korzystając ze strony internetowej Protein Prospector (http://prospector.ucsf.edu/)11.
3. Pomiar wymiany H/D amidowej
- Wszystkie roztwory i odczynniki niezbędne do wymiany H/D należy utrzymać w temperaturze 25 °C w łaźni wodnej. ATP rozpuszcza się w wodzie, a przed użyciem dostosowuje pH do 7,0. Dodatkowe 4mM ATP w buforze D2O ma zapobiegać dysocjacji ATP z Pak2 po rozcieńczeniu.
- Wymianę H/D rozpoczyna się poprzez dodanie 18 μl buforowanego D2O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) do 2 μl (20 μg) Pak2 w buforze zawierającym 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 2 mM DTT, co daje stężenie Pak2 wynoszące 10 mg/ml i pH 7,0 w temperaturze 0°C.
- Próbki w trzech powtórzeniach inkubuje się w warunkach wymiany H/D przez 0, 0,5, 1, 3, 5 i 10 min lub 24 h.
- Proces wymiany H/D przerywa się (quench) poprzez dodanie 180 μl lodowatego 0,1% TFA o pH 2,2, co obniża pH do 2,5 w końcowej objętości 200 μl. W przypadku próbek zawierających ATP stosuje się 180 μl lodowatego 0,11% TFA o pH 2,2, aby utrzymać pH na poziomie 2,5 w warunkach przerwania reakcji.
- Alikwot (100 μl) każdej zatrzymanej próbki dodaje się do 30 μl aktywowanych kulek agarozowych sprzężonych z pepsyną. Trawienie pepsyną przeprowadza się na lodzie przez pięć min, mieszając próbki w vortexie co 30 s.
- Trawienie kończy się poprzez wirowanie próbki przez 15 s przy 5,000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia pepsyny.
- Próbki należy szybko zamrozić w ciekłym N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C nie dłużej niż przez 2 dni przed analizą MALDI-TOF.
- Matrycą do MALDI jest 5 mg/ml kwasu α-cyjano-4-hydroksycynnamowego (CHCA) rozpuszczonego w roztworze (1:1:1) acetonitrylu, etanolu i 0,1% TFA o pH 2,5, utrzymywanym w temperaturze 0 °C.
- Każdą próbkę należy szybko częściowo rozmrozić, zmieszać 1 μl próbki z 1 μl matrycy i nanieść na płytkę docelową MALDI w temperaturze 4 °C.
- Na płytkę należy przyłożyć umiarkowaną próżnię, aby wysuszyć plamki w ciągu 30 s przed analizą MALDI-TOF. Czas między rozmrożeniem próbki a uzyskaniem widma wynosi około 3 min.
- Widma mas MALDI-TOF należy zarejestrować za pomocą urządzenia PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Dane należy zbierać przy częstotliwości próbkowania 2 GHz, korzystając ze 100 000 kanałów danych, napięcia przyspieszającego 20 000 V i napięcia siatki 65% z zastosowaniem opóźnionej ekstrakcji z opóźnieniem impulsu 180 ns. Średnią wylicza się ze stu skanów w ciągu 2 min. Instrument MALDI-TOF nie musi być konkretnej marki ani korzystać z określonego oprogramowania.
- Do obliczenia stopnia deuterowania każdego fragmentu należy użyć programu komputerowego Data Explorer 4.0.
- Wymianę zwrotną oblicza się na podstawie stosunku rzeczywistej liczby wbudowanych deuteronów po 24 h wymiany H/D do wszystkich możliwych miejsc wymiany, którymi są amidy szkieletowe z wyjątkiem amidu N-końcowego (Rycina 1).
4. Reprezentatywne wyniki:
Rozszczepienie przez kaspazę oraz autofosforylację weryfikuje metoda SDS-PAGE z barwieniem Coomassie. Nieaktywne Pak2 tworzy pojedynczy prążek o masie 58 kDa. Rozszczepienie Pak2 przez kaspazę przebiega całkowicie i prowadzi do powstania dwóch fragmentów, p27 i p34, które migrują oddzielnie. Migracja autofosforylowanych fragmentów p27 i p34 wykazuje na żelu nakładanie się ze względu na spowolnioną migrację w pełni fosforylowanego fragmentu p27 (Rysunek 2).
Eksperymenty wymiany H/D prowadzi się wielokrotnie w przedziale od 0 do 10 min (Rysunek 3). Jako przykład, przebieg czasowy wbudowy deuteru w pik m/z 1697,85 nieaktywnego Pak2 składa się z wielu pików izotopowych, co obrazuje przesunięcie obwiedni masy w czasie.
Rycina 1. Równanie do obliczenia stopnia deuterowania.
Rysunek 2. Autofosforylacja i rozszczepienie Pak2 przez kaspazę. Pak2 rozszczepiony przez kaspazę (lewa ścieżka), nienaruszony nieaktywny Pak2 (środkowa ścieżka) oraz autofosforylowany Pak2 rozszczepiony przez kaspazę (prawa ścieżka) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. Adaptowano z Hsu, YH et al2.
Rycina 3. Widmo masowe przebiegu czasowego wbudowywania deuteru dla nieaktywnego Pak2. Nieaktywny Pak2 poddano wymianie H/D przez 0-10 min i analizowano za pomocą MALDI-TOF. Przedstawiono przykład powiększonego rozkładu izotopowego MALDI-TOF dla piku m/z 1697,85 w czasie przebiegu wymiany H/D. Czerwona przerywana linia oznacza średnią obwiedni masowej, a przesunięcie obwiedni masowej wskazuje na deuterację peptydu.
Dyskusja
Identyfikacja fragmentów strawionych pepsyną jest krytycznym etapem eksperymentu z wymiany H/D. Błędna identyfikacja peptydu może prowadzić do niewłaściwych wniosków. Pak2 strawiony pepsyną jest eluowany przez kolumnę C18 do HPLC w fazie odwróconej, aby uzyskać czyste tło. W naszych eksperymentach zebrano łącznie 40 frakcji, które poddano analizie MALDI-TOF. W każdej z frakcji można było zidentyfikować wiele peptydów. Peptydy te poddano tandemowej spektrometrii mas (Q-TOF MS/MS oraz oMALDI MS/MS) w celu zidentyfikowania ich sekwencji. Widma MS/MS peptydu powinny zawierać co najmniej trzy jony produktu, aby potwierdzić identyfikację peptydu.
Program komputerowy Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) służy do wstępnej korekcji linii bazowej i filtracji szumów. Każde widmo musi zostać skalibrowane na podstawie dwóch sekwencyjnych pików. Kalibracji widma dokonujemy za pomocą teoretycznej masy nieduerylowanego m/z, która wynosi 923,45 i 1697,84. Dokładność masy po kalibracji może osiągnąć 10 ppm. Po deuterowaniu monoizotop może przesunąć się w stronę wyższej masy. Jednostkowe przyrosty tych stosunków m/z prowadzą do zwiększenia masy związanej z deuterowaniem. Intensywność pików obwiedni masy nie wpływa na stopień deuterowania. Jednakże intensywność pików izotopowych w konkretnej obwiedni masy ma kluczowe znaczenie dla obliczenia masy średniej. Pierwszym krokiem obliczania wbudowanego deuteru jest odjęcie masy peptydu próbki nieduerylowanej od masy próbkiu deuterowanej. W obliczeniach należy dodatkowo uwzględnić trzy inne czynniki: rozcieńczenie D2O, pozostałe deutery w łańcuchach bocznych oraz wymianę wsteczną (Rysunek 1). Rozcieńczenie D2O to czynnik rozcieńczenia D2O po wymieszaniu próbki z buforem D2O w celu zainicjowania wymiany H/D. Należy odjąć pozostały deuter (4,5%) w łańcuchach bocznych peptydów trawionych pepsyną. Wymiana wsteczna to nieunikniona utrata deuterowania we wszystkich deuterowanych i trawionych pepsyną peptydach podczas procesu pomiaru masy.
Peptyd o największej dostępności dla rozpuszczalnika (m/z = 1105,60) po 24 godzinach wymiany H/D reprezentuje obszar pełnego deuterowania. Liczba wbudowanych deuteronów dla każdego z peptydów stanowi różnicę między centroidem peptydów peptycznych Pak2 deuterowanych i niedeuterowanych. Peptyd o najwyższym stopniu deuterowania m/z 1105 został wybrany do reprezentowania pełnego deuterowania w przypadku Pak2 po 24 h wymiany H/D. Współczynnik wymiany wstecznej (Back Exchange Ratio) obliczono poprzez podzielenie rzeczywistej liczby wbudowanych deuteronów po 24 h wymiany H/D przez wszystkie możliwe miejsca wymiany w peptydzie m/z 1105.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca jest częściowo finansowana z grantu National Institutes of Health GM-26738 (przyznanego J.A.T.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| kwas α-cyjanowy-4-hydroksycynnamowy | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Spektrometr mas Q-TOF | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Program komputerowy Data Explorer 4.0 | Applied Biosystems |
Bibliografia
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
Przedruki i uprawnienia
