Hodowlane komórki mięśniowe są niewystarczającym modelem do odtworzenia unerwionego mięśnia in vivo. Funkcjonalną jednostkę motoryczną można odtworzyć in vitro poprzez unerwienie zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych przy użyciu eksplantatów rdzenia kręgowego embrionu szczura. Niniejszy artykuł opisuje sposób tworzenia kokultur eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie pierwotne komórki mięśniowe hodowane aneuralnie w monowarstwie rzadko kurczą się spontanicznie, ponieważ wobec braku komponentu nerwowego różnicowanie komórek jest ograniczone i brakuje stymulacji neuronów ruchowych1. Ograniczenia te utrudniają badanie wielu chorób nerwowo-mięśniowych in vitro w hodowlach komórek mięśniowych. Co istotne, ograniczenia eksperymentalne związane z monowarstwowymi hodowlami komórek mięśniowych można pokonać poprzez funkcjonalną innerwację włókien mięśniowych eksplantami rdzenia kręgowego w kokulturach.
W niniejszej pracy przedstawiamy poszczególne etapy niezbędne do uzyskania efektywnej i prawidłowej innerwacji ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych, prowadzącej do pełnego różnicowania i skurczu włókien zgodnie z metodą opracowaną przez Askanasa2. W tym celu komórki mięśniowe są współhodowane z eksplantami rdzenia kręgowego embrionów szczura w dniu ED 13.5, przy czym ziarenka zwojów rdzeniowych pozostają przytwierdzone do skrawków rdzenia kręgowego. Po kilku dniach włókna mięśniowe zaczynają się kurczyć i ostatecznie stają się poprzecznie prążkowane w wyniku innerwacji przez funkcjonalne neuryty wyrastające z eksplantów rdzenia kręgowego i łączące się z komórkami mięśniowymi. Strukturę tę można utrzymać przez wiele miesięcy, stosując regularną wymianę pożywki hodowlanej.
Zastosowania tego nieocenionego narzędzia są liczne, ponieważ stanowi ono funkcjonalny model dla wielodyscyplinarnych analiz rozwoju i unerwienia mięśni ludzkich. W rzeczywistości w szalce hodowlanej dochodzi do pełnej instalacji złącza nerwowo-mięśniowego de novo, co pozwala na łatwy pomiar wielu parametrów na każdym etapie, w kontekście fundamentalnym i fizjologicznym.
Przywołując zaledwie kilka przykładów, badania genomiczne i/lub proteomiczne można przeprowadzać bezpośrednio na ko-kulturach. Ponadto efekty presynaptyczne i postsynaptyczne mogą być oceniane w sposób specyficzny i oddzielny w obrębie złącza nerwowo-mięśniowego, ponieważ oba komponenty pochodzą od różnych gatunków, odpowiednio od szczura i człowieka. Ko-kulturę nerwu i mięśnia można również prowadzić z ludzkimi komórkami mięśniowymi wyizolowanymi od pacjentów cierpiących na choroby mięśni lub choroby nerwowo-mięśniowe3, dzięki czemu może ona służyć jako narzędzie przesiewowe dla potencjalnych leków. Wreszcie, do odtworzenia funkcjonalnej jednostki motorycznej w szalce hodowlanej nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt, a jedynie standardowe laboratorium BSL2. Metoda ta jest zatem cenna zarówno dla społeczności badającej mięśnie, jak i złącza nerwowo-mięśniowe, w zakresie fizjologicznych i mechanistycznych badań funkcji nerwowo-mięśniowej w kontekście prawidłowym oraz chorobowym.
Protokół
1. Przygotowanie pierwotnej hodowli ludzkich komórek mięśniowych
- Utworzyć kultury ludzkich komórek mięśniowych zgodnie z techniką eksplantacji-reeksplantacji4. Najpierw usunąć tkankę pozamięśniową z biopsji. Następnie osadzić eksplanty mięśni o wielkości 1 mm3 w koagulum osocza, co umożliwi wyjście fibroblastów z eksplantów.
- Osadzone eksplanty przenieść na płytkę pokrytą żelatyną z osocza i pozostawić do wzrostu w zwykłej pożywce wzrostowej (MEM uzupełniony o 25% medium 199, 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 1% penicyliny/streptomycyny, 10 μg/ml insuliny, 10 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu naskórka [EGF], 12,5 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów [FGF]) w monowarstwie. Komórki, które wyłaniają się z eksplantów w tych warunkach, są komórkami mięśniowymi. Komórki te będą nadal rosnąć w monowarstwie po usunięciu eksplantów.
- Hodować komórki bezunerwione na płytkach pokrytych 0,1% żelatyną w zwykłej pożywce wzrostowej. Komórki mogą być hodowane bezunerwione i namnażane w razie potrzeby. Do tworzenia kokultur najlepiej używać komórek mięśniowych z pasażu od 3 do 8. Kluczowe jest unerwienie młodych miotub; po tym etapie kokultury są obarczone wysokim ryzykiem niepowodzenia. Ponadto miotuby nie powinny być zbyt duże i zbyt grube.
- Na dwa dni przed planowanym unerwieniem wysiać komórki mięśniowe na 35 mm płytki do hodowli tkankowej (lub płytki 6-dołkowe) z gęstością 500 000 komórek na płytkę w zwykłej pożywce wzrostowej. Przy tej gęstości komórki osiągają odpowiednią konfluencję, aby następnego dnia rozpocząć fuzję, a dzień później przeprowadzić unerwienie. W tych warunkach miotuby znajdują się we właściwym stadium dla optymalnego unerwienia, a w konsekwencji późniejszego skurczu włókien.
- Następnego dnia zastąpić zwykłą pożywkę wzrostową pożywką do fuzji składającą się z MEM uzupełnionego o 25% medium 199, 5% FBS, 10 μg/ml insuliny i 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Izolacja eksplantów rdzenia kręgowego zarodka szczura
Cała procedura izolacji eksplantów rdzenia kręgowego jest przeprowadzana pod mikroskopem binokularnym w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS, Gibco/Invitrogen ref 14170) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Kluczowe jest, aby zarodki szczura znajdowały się między 13. a 14. dniem embrionalnym (ED 13 i 14), ponieważ inny stopień rozwoju mógłby zagrozić całej procedurze. Uśmierć ciężarną samicę za pomocą CO2 i pobierz cały łańcuch zarodków do medium HBSS. Wyizoluj każdy zarodek i dokonaj dekapitacji w celu eutanazji.
- Wypreparuj rdzeń kręgowy zarodka z reszty ciała w jednym kawałku, usuwając otaczające mięśnie i tkankę łączną. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zwoje korzeni grzbietowych (DRGs) pozostały przytwierdzone do rdzenia kręgowego, co zapewni funkcjonalną innerwację.
- Przekrój każdy rdzeń kręgowy poprzecznie w taki sposób, aby każdy eksplant zawierał co najmniej 2 przytwierdzone do niego DRG (eksplanty o objętości 1 mm3).
3. Innerwacja ludzkich komórek mięśniowych za pomocą eksplantów rdzenia kręgowego embriona szczura
- Usunąć medium do fuzji z hodowli komórek mięśniowych, pozostawiając na monowarstwie cienką warstwę medium.
- Ostrożnie umieścić eksplantaty na warstwie komórek mięśniowych, w liczbie pięciu równomiernie rozmieszczonych eksplantatów na szalkę 35 mm.
- Bardzo powoli, kroplami, dodawać medium do fuzji na każdy eksplantat. Konieczne jest dodanie medium, aby komórki mięśniowe przeżyły, jednak w ilości niewystarczającej do tego, by eksplantaty zdążyły najpierw przywrzeć i nawiązać kontakt z komórkami. Jeśli medium nie zostanie dodane prawidłowo (zbyt silnym strumieniem lub w zbyt dużej ilości), eksplantaty będą pływać i nie dojdzie do unerwienia komórek mięśniowych.
- Gdy eksplantaty zaczną przywierać, uzupełnić medium do fuzji do objętości 2 ml na szalkę 35 mm i bardzo ostrożnie umieścić szalki z powrotem w inkubatorze.
4. Utrzymywanie heterologicznych kokultur nerwowo-mięśniowych
- Wymieniaj medium do fuzji dwa razy w tygodniu.
5. Reprezentatywne wyniki
Już dwa dni po unerwieniu można zaobserwować neuryty wyłaniające się z każdego eksplantu i nawiązujące kontakty z komórkami mięśniowymi, co objawia się obecnością struktur przypominających wypustki (Rys 1).
Już 4-6 dni po unerwieniu kilka pojedynczych włókien zacznie się kurczyć.
Skurcze utrzymują się przez wiele miesięcy, a ich trwałość jest zapewniona poprzez prostą wymianę pożywki dwa razy w tygodniu.
Po około 2 tygodniach sam eksplant rdzenia kręgowego ulega degeneracji, jednak unerwienie zostaje zachowane. Jest to zjawisko normalne. Cienka warstwa komponentów nerwowych pozostaje na powierzchni warstwy komórek mięśniowych. Ta sieć nerwowa jest wystarczająca do utrzymania funkcjonalności jednostki motorycznej.
Jeśli eksplanty pływają w pożywce w dniu następującym po unerwieniu, nigdy nie przywrą do podłoża. Dzieje się tak, gdy warstwa komórek mięśniowych nie jest wystarczająco konfluentna lub gdy pożywka została dodana zbyt gwałtownie. Czasami eksplant przylega, ale nie powstają neuryty. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem przytwierdzonego do niego zwoju korzenia tylnego (DRG). W takim przypadku unerwienie również nie zostanie ustanowione. W pierwszym tygodniu należy manipulować szalkami bardzo ostrożnie, ponieważ eksplanty wciąż mogą się łatwo odkleić. Aby wymienić pożywkę do fuzji, należy dodawać płyn kroplami z minimalną prędkością, aby uniknąć odklejenia się komórek.
Rysunek 1. Współhodowle eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych od dnia 1. do dnia 15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Fizjologiczne narzędzie in vitro do badania funkcji komórek mięśniowych w kontekście prawidłowym i patologicznym jest przedmiotem szczególnego zainteresowania myologów, ponieważ hodowle komórek mięśniowych zazwyczaj nie odtwarzają znaczenia interakcji między wieloma komórkami i połączeń między różnymi typami komórek. Dodanie oczyszczonych neuronów ruchowych do komórek mięśniowych jest niewystarczające do uzyskania funkcjonalnej jednostki motorycznej, ponieważ do efektywnej innerwacji niezbędna jest obecność komó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Nasza praca jest wspierana przez Swiss National Science Foundation (SNF), Swiss Initiative in Systems Biology (SystemsX.ch), Muscular Dystrophy Association USA (MDA), Association Française contre les Myopathies (AFM), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF), Gebert-Rüf Foundation Rare Diseases Programme (GRF), Swiss Society for Research of the Muscle Diseases (SSEM/FSRMM), Swiss Life „Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung”, Roche Research Foundation oraz Uniwersytet w Bazylei.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Ludzki EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ludzki FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Roztwór penicyliny/streptomycyny | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
Bibliografia
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
