Artykuł metodologiczny

Chromosomika: Wykrywanie zmian numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich jednocześnie za pomocą nowatorskiego testu OctoChrome FISH

DOI:

10.3791/3619

⸱

6 lutego 2012

 , 
1Genes and Environment Laboratory, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana jest nowatorska metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która jednocześnie bada zarówno numeryczne, jak i strukturalne zmiany chromosomów, szczególnie specyficzne translokacje chromosomowe związane z białaczką i chłoniakiem, wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w jednej hybrydyzacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to technika, która pozwala na wykrycie określonych sekwencji DNA na chromosomach metafazowych lub interfazowych w jądrach komórkowych1. Technika ta wykorzystuje sondy DNA z unikalnymi sekwencjami, które hybrydyzują z całymi chromosomami lub określonymi regionami chromosomowymi i służy jako potężne uzupełnienie klasycznej cytogenetyki. Na przykład wiele wcześniejszych badań donosiło o częstym wykrywaniu zwiększonych aberracji chromosomowych u pacjentów z białaczką związanych z ekspozycją na benzen, pacjentów zatrutych benzenem i zdrowych pracowników narażonych na benzen, przy użyciu klasycznej analizy cytogenetycznej2. Za pomocą FISH zaobserwowano, że zmiany chromosomowe specyficzne dla białaczki są podwyższone u pozornie zdrowych pracowników narażonych na benzen3-6, co wskazuje na krytyczną rolę zmian cytogennych w białaczce wywołanej benzenem.

Generalnie, pojedynczy test FISH bada tylko jeden lub kilka całych chromosomów lub określonych loci na szkiełku, więc konieczne jest przeprowadzenie wielu hybrydyzacji na wielu preparatach, aby pokryć wszystkie ludzkie chromosomy. Kariotypowanie spektralne (SKY) pozwala na jednoczesną wizualizację całego genomu, ale wymóg specjalnego oprogramowania i sprzętu ogranicza jego zastosowanie7. W tym miejscu opisujemy nowatorski test FISH, OctoChrome-FISH, który można zastosować do chromosomiki, którą definiujemy tutaj jako jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym szkiełku w badaniach na ludziach, takich jak badanie aneuploidii całego chromosomu (CWAS)8. Podstawą metody, sprzedawanej przez Cytocell jako Chromoprobe Multiprobe System, jest urządzenie OctoChrome, które jest podzielone na 8 kwadratów, z których każdy zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów (ryc. 1). Każda z trzech sond jest bezpośrednio znakowana fluoroforem w innym kolorze: zielonym (FITC), czerwonym (Texas Red) i niebieskim (kumaryna). Rozmieszczenie kombinacji chromosomów na urządzeniu OctoChrome zostało zaprojektowane tak, aby ułatwić identyfikację nielosowych strukturalnych zmian chromosomowych (translokacji) występujących w najczęstszych białaczkach i chłoniakach, na przykład t (9; 22), t(15; 17), t(8; 21), t(14; 18) 9. Co więcej, zmiany liczbowe (aneuploidia) w chromosomach mogą być wykrywane równocześnie. Odpowiedni slajd szablonu jest również podzielony na 8 kwadratów, na których związane są spready metafaz (rysunek 2) i jest umieszczony nad urządzeniem OctoChrome. Sondy i docelowe DNA są denaturowane w wysokiej temperaturze i hybrydyzowane w wilgotnej komorze, a następnie wszystkie 24 ludzkie chromosomy mogą być wizualizowane jednocześnie.

OctoChrome FISH to obiecująca technika do klinicznej diagnostyki białaczki i chłoniaka oraz do wykrywania aneuploidii we wszystkich chromosomach. Zastosowaliśmy to nowe podejście chromosomowe w badaniu CWAS chińskich pracowników narażonych na działanie benzenu8,10.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie preparatu próbnego

  • OctoChrome FISH jest przeznaczony do badania zmian chromosomalnych w rozprzestrzenianiu się metafaz komórek ludzkich, w tym między innymi hodowanych komórek krwi obwodowej, komórek macierzystych/progenitorowych i linii komórkowych. Próbki powinny być przygotowywane zgodnie ze standardową procedurą zbierania metafaz3,11-13: poprzez zastosowanie leczenia colcemidem w celu zatrzymania komórek w metafazie, leczenia hipotonicznego w celu pęcznienia komórek i utrwalacza Carnoya w celu utrwalenia komórek w zawiesinie w ilości około 0,5-1 x10 6 komórek na ml.
  • Wyczyść 8-kwadratowe szkiełko (dostarczone w zestawie OctoChrome, katalog #: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, Wielka Brytania, rysunek 2), zanurzając je w czystym etanolu na 2 minuty.
  • Przed utworzeniem szkiełka z próbką upuść niewielką ilość komórek na szkiełko, aby sprawdzić gęstość komórek. Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża (zbyt wiele nakładających się komórek), rozcieńczyć zawiesinę świeżym utrwalaczem. Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska (zbyt mało komórek na szkiełku), odwiruj komórki i ponownie zawieś w mniejszej objętości świeżego utrwalacza. Odpipetować 5-10 μl zawiesiny komórek na każdy z 8 obszarów szkiełka wzorcowego w sekwencji naprzemiennych kwadratów 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Gdy pierwsze dwa kwadraty wyschną na powietrzu, znajdź pozostałe kwadraty w ten sam sposób. Zapobiegnie to wzajemnemu zakłócaniu rozprzestrzeniania się komórek.
  • Wysuszone szkiełko może być przechowywane w temperaturze -20°C w atmosferze azotu przez ponad 5 lat przed hybrydyzacją.

2. Lokalizacja metafaz za pomocą zautomatyzowanego systemu

  • Nanieść 20 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (0,2 μg/ml) na środek każdej połowy szkiełka, a następnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
  • Wykonaj automatyczne skanowanie szkiełka z próbką w celu zlokalizowania komórek metafazy za pomocą oprogramowania Metafer (MetaSystems, Altlussheim, Niemcy). Ułatwia to lokalizację wszystkich metafaz i przyszłą ponowną ocenę wszystkich obrazów komórek.
  • Przeglądaj wyniki skanowania ręcznie i usuwaj artefakty niezwiązane z metafazą.

3. Hybrydyzacja

  1. Przygotowanie preparatu próbnego i urządzenia OctoChrome
    • Zanurzyć szkiełko do pobierania próbek w buforze 2x SSC w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby zmyć DAPI.
    • Odwodnić szkiełko z próbką przez serię płukań etanolem (po 2 minuty w przypadku etanolu 70%, 85% i 100%), pozostawić do wyschnięcia i umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 37°C na 5 minut.
    • Umieść komorę hybrydyzacyjną Chromoprobe Multiprobe (dostarczoną w zestawie OctoChrome) w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i pozostaw do zrównoważenia do 37°C (+/- 1°C).
    • Wymieszaj roztwór hybrydyzacyjny (dostarczony w zestawie OctoChrome) przez wielokrotne pipetowanie i podgrzej wstępnie 25 μl porcji na urządzenie OctoChrome do 37°C.
    • Rozgrzej wstępnie każde urządzenie OctoChrome (dostarczone w zestawie OctoChrome, patrz Rysunek 2) do 37°C, umieszczając etykietę urządzenia stroną do dołu na płycie grzejnej. NIE WOLNO dotykać wytłoczonych powierzchni urządzenia OctoChrome, ponieważ zawierają one sondy.
  2. Umiejscowienie szkiełka próbki nad urządzeniem OctoChrome (Rysunek 2)
    • Dodaj 2 μl wstępnie podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego do każdego z ośmiu obszarów na wstępnie podgrzanym urządzeniu OctoChrome, gdy pozostaje ono w temperaturze 37°C.
    • Ostrożnie odwróć slajd szablonu nad urządzeniem OctoChrome tak, aby cyfra 1, która jest teraz odwrócona do góry nogami, znajdowała się w prawym górnym rogu urządzenia OctoChrome. Aby ułatwić zlokalizowanie kwadratu 1, jego położenie na urządzeniu zostało oznaczone kolorem pomarańczowym.
    • Upewnij się, że slajd szablonu jest starannie wyrównany z pasującymi obszarami na urządzeniu OctoChrome. Ostrożnie opuść szkiełko na urządzenie OctoChrome tak, aby krople roztworu hybrydyzacyjnego zetknęły się ze szkiełkiem. Zastosuj delikatny, równomierny nacisk, aby upewnić się, że roztwór hybrydyzacyjny jest rozprowadzony na krawędziach każdego z podniesionych obszarów na urządzeniu OctoChrome.
    • Podnieś suwak/OctoChrome, ostrożnie przytrzymując matowy koniec szklanego szkiełka i odwróć tak, aby suwak znalazł się pod urządzeniem OctoChrome. Upewnij się, że urządzenie nie rozmazuje się na szkiełku szablonu, ponieważ może to spowodować zanieczyszczenie krzyżowe sond.
    • Umieść na płycie grzejnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) na 10 minut.
  3. denaturacja
    • Przenieś sample slide/urządzenie OctoChrome na płytę grzejną, zwracając szczególną uwagę, aby utrzymać ją poziomo. Upewnij się, że szkiełko sample równomiernie styka się z płytą grzejną.
    • denaturować na płycie grzejnej w temperaturze 75°C (+/- 1°C) przez 5 minut.
  4. krzyżowanie
    • Umieść szkiełko z próbką/urządzenie OctoChrome w komorze hybrydyzacyjnej Chromoprobe Multiprobe.
    • Załóż pokrywę i zanurz komorę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) (bez mieszania) przez noc. Uwaga: NIE uszczelniaj pokrywy komory hybrydyzacyjnej; NIE WOLNO uszczelniać pokrywy łaźni wodnej; NIE hybrydyzuj w inkubatorze. Te kroki mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania wilgotności.
  5. Myjnie po hybrydyzacji
    • Przygotowanie roztworów myjących
      Rozwiązanie 1: Przygotuj słoik Coplin/Hellendahl zawierający 0,4x SSC. Wyrównać do 72°C (+/- 1°C) w łaźni wodnej i dostosować pH do 7,0,
      Rozwiązanie 2: Przygotuj słoik Coplin/Hellendahl zawierający 2x SSC i 0,05% Tween 20. Odstawić w temperaturze pokojowej.
    • Ostrożnie zdejmij urządzenie OctoChrome ze szkiełka i umieść je w roztworze 1 na 2 minuty.
    • Umieść szkiełko w roztworze 2 na 30 sekund.

4. Montaż i wizualizacja wyników

  • Nałóż 20 μl DAPI na środek każdej połowy szkiełka i nałóż szkiełko nakrywkowe.
  • Inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed oglądaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 3A pokazuje normalną komórkę metafazy w kwadracie 2. (1)-(3): Chromosomy 8, 21 i 12 zostały pomalowane na czerwono, zielono i niebiesko i są wizualizowane odpowiednio przez filtr Texas Red, FITC i DEAC; (4): Wizualizacja za pomocą potrójnego filtra DAPI/FITC/Texas Red. Ogólnie rzecz biorąc, chromosomy pomalowane na niebiesko nie są przezroczyste przez potrójny filtr i muszą być oglądane pod specjalnym filtrem DEAC.

Rysunek 3B pokazuje reprezentatywne nieprawidłowe komórki z translokacją chromosomową i aneuploidią specyficzną dla białaczki. (1): t(8; 21), powszechna translokacja chromosomowa w ostrej białaczce szpikowej; (2): Trisomia 21, trzy kopie chromosomu 21, powszechna aneuploidia w białaczce.

figure-protocol-1

Rysunek 1. Rozmieszczenie kombinacji chromosomów na urządzeniu OctoChrome i oczekiwane wyniki malowania chromosomów.

figure-protocol-2

Rysunek 2. Umiejscowienie szkiełka próbki nad urządzeniem OctoChrome.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki uzyskane z OctoChrome FISH (kwadrat 2).

figure-protocol-3

Rysunek 3A. Normalna komórka z chromosomami 8, 12, 21 pomalowanymi w kwadrat 2.

figure-protocol-4

Rysunek 3B. Reprezentatywne nieprawidłowe komórki z translokacją chromosomową specyficzną dla białaczki i aneuploidią w kwadracie 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten nowatorski test OctoChrome-FISH pozwala na jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów w jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Rozmieszczenie kombinacji chromosomów na 8 kwadratach zostało zaprojektowane tak, aby ułatwić identyfikację nielosowych rearanżacji chromosomów w najczęstszych białaczkach i chłoniakach. W ten sposób test może jednocześnie wykrywać numeryczne (aneuploidy) i strukturalne (translokacje) zmiany chromosomowe.

Najbardziej krytycznym krokiem w tym teście je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Cliona M. McHale za krytyczne przeczytanie i zredagowanie manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym, grant Narodowego Instytutu Zdrowia R01ES017452 dla L Zhanga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw OctoChrome Cytocell Sp. z o.o.PMP 803
fitohemaglutynina (PHA)Invitrogen10576-015
Colcemid Invitrogen15212-012
Carnoy' s utrwalaczMetanol : lodowaty kwas octowy = 3: 1
fluorescencyjny Wyposażony w filtry do indywidualnego przeglądania widm DAPI, Texas Red, FITC i kumaryny oraz potrójny filtr DAPI/FITC/Texas Red do jednoczesnego oglądania różnych kolorów
Oprogramowanie Metafer MetaSystems, Altlussheim, NiemcyUłatwia zlokalizowanie wszystkich metafaz i ponowną ocenę nieprawidłowości
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  2. Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
  3. Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
  4. Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
  5. Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
  6. Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
  7. Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
  8. Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
  9. Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
  10. Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
  11. Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
  12. Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
  13. Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
  14. Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ChromosomicsOctoChrome FISHFluorescence In Situ HybridizationChromosome PaintingMetaphase SpreadsWhole Chromosome ProbesNumerical AlterationsStructural AlterationsLeukemia Lymphoma DetectionBenzene Exposure Study

Powiązane artykuły