Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) jest techniką umożliwiającą wykrywanie specyficznych sekwencji DNA na chromosomach w metafazie lub interfazie w jądrach komórkowych1. Technika ta wykorzystuje sondy DNA o unikalnych sekwencjach, które hybrydyzują z całymi chromosomami lub specyficznymi regionami chromosomalnymi, i stanowi potężne uzupełnienie klasycznej cytogenetyki. Na przykład w wielu wcześniejszych badaniach z wykorzystaniem klasycznej analizy cytogenetycznej zgłaszano częste wykrywanie zwiększonej liczby aberracji chromosomalnych u pacjentów z białaczką związaną z ekspozycją na benzen, u pacjentów z zatruciem benzenem oraz u zdrowych pracowników narażonych na benzen2. Z zastosowaniem metody FISH zaobserwowano podwyższony poziom specyficznych dla białaczki zmian chromosomalnych u pozornie zdrowych pracowników narażonych na benzen3-6, co wskazuje na kluczową rolę zmian cytogenetycznych w indukowanej benzenem leukemogenezie.
Zazwyczaj pojedynczy test FISH analizuje tylko jeden lub kilka całych chromosomów lub specyficznych loci na jednym szkiełku, dlatego w celu objęcia wszystkich ludzkich chromosomów konieczne jest przeprowadzenie wielu hybrydyzacji na wielu szkiełkach. Kariotypowanie spektralne (SKY) umożliwia jednoczesną wizualizację całego genomu, jednak wymóg zastosowania specjalistycznego oprogramowania i sprzętu ogranicza jego zastosowanie7. W niniejszej pracy opisujemy nową metodę FISH, OctoChrome-FISH, którą można zastosować w Chromosomics, co definiujemy tutaj jako jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym szkiełku w badaniach ludzi, takich jak badanie aneuploidii w obrębie całego zestawu chromosomów (CWAS)8. Podstawą tej metody, oferowanej przez firmę Cytocell jako Chromoprobe Multiprobe System, jest urządzenie OctoChrome podzielone na 8 kwadratów, z których każdy zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów (Rycina 1). Każda z trzech sond jest bezpośrednio znakowana fluorophorem o innym kolorze: zielonym (FITC), czerwonym (Texas Red) i niebieskim (Coumarin). Układ kombinacji chromosomów w urządzeniu OctoChrome został zaprojektowany tak, aby ułatwić identyfikację nierandomowych strukturalnych zmian chromosomowych (translokacji) występujących w najczęstszych białaczkach i chłoniakach, np. t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Ponadto można jednocześnie wykrywać zmiany liczby chromosomów (aneuploidie). Odpowiadający im szkiełko matryca jest również podzielone na 8 kwadratów, do których przytwierdzone są preparaty metafaz (Rycina 2), i jest ono umieszczane nad urządzeniem OctoChrome. Sondy oraz docelowe DNA są denaturowane w wysokiej temperaturze i hybrydyzowane w komorze wilgotnej, a następnie wszystkie 24 ludzkie chromosomy mogą zostać zwizualizowane jednocześnie.
OctoChrome FISH to obiecująca technika w diagnostyce klinicznej białaczek i chłoniaków oraz w wykrywaniu aneuploidii we wszystkich chromosomach. Zastosowaliśmy to nowe podejście chromosomalne w badaniu CWAS wśród chińskich pracowników narażonych na działanie benzenu8,10.
Protokół
1. Przygotowanie preparatów na szkiełkach
- Zestaw OctoChrome FISH służy do badania zmian chromosomalnych w preparatach metafaz komórek ludzkich, w tym między innymi w hodowlach komórek krwi obwodowej, komórkach macierzystych/progenitorowych oraz liniach komórkowych. Próbki należy przygotować zgodnie ze standardową procedurą zbioru metafaz3,11-13: stosując kolcemid w celu zatrzymania komórek w metafazie, obróbkę hipotoniczną w celu napęcznienia komórek oraz fiksatywny Carnoya do utrwalenia komórek w zawiesinie o stężeniu około 0,5-1 x 106 komórek na ml.
- Oczyścić szkiełko z 8 polami (dołączone do zestawu OctoChrome, numer katalogowy: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, UK, Rysunek 2), zanurzając je w czystym etanolu na 2 min.
- Przed przygotowaniem szkiełka z próbką, nanieść niewielką ilość komórek na szkiełko, aby sprawdzić gęstość komórek. Jeśli gęstość komórek jest zbyt wysoka (zbyt wiele nakładających się komórek), rozcieńczyć zawiesinę świeżym fiksatywem. Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska (zbyt mało komórek na szkiełku), odwirować komórki i zawiesić je ponownie w mniejszej objętości świeżego fiksatywu. Nanieść pipetą 5-10 μl zawiesiny komórek na każde z 8 pól szkiełka wzorcowego w sekwencji naprzemiennych kwadratów 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Gdy pierwsze dwa kwadraty wyschną na powietrzu, nanieść próbki na pozostałe pola w ten sam sposób. Zapobiegnie to wzajemnemu zakłócaniu się rozprzestrzenionych komórek.
- Wysuszone szkiełko można przechowywać w temperaturze -20°C w atmosferze azotu przez ponad 5 lat przed hybrydyzacją.
2. Lokalizacja metafaz z wykorzystaniem systemu zautomatyzowanego
- Nanieś 20 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (0.2 μg/ml) na środek każdej połowy preparatu, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywką.
- Przeprowadź automatyczne skanowanie preparatu w celu zlokalizowania komórek w metafazie, korzystając z oprogramowania Metafer (MetaSystems, Altlussheim, Niemcy). Ułatwia to odnalezienie wszystkich metafaz i późniejszą ponowną ocenę obrazów wszystkich komórek.
- Przejrzyj wyniki skanowania ręcznie i usuń artefakty niebędące metafazami.
3. Hybrydyzacja
- Przygotowanie preparatu i urządzenia OctoChrome
- Zanurzyć preparat w buforze 2x SSC w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby wypłukać DAPI.
- Odwodnić preparat poprzez serię płukań etanolem (po 2 minuty w etanolu 70%, 85% i 100%), pozostawić do wyschnięcia i umieścić na płycie grzejnej o temperaturze 37°C na 5 minut.
- Umieścić komorę do hybrydyzacji wielosondowej Chromoprobe (dołączoną do zestawu OctoChrome) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i pozostawić do wyrównania temperatury do 37°C (+/- 1°C).
- Wymieszać roztwór do hybrydyzacji (dołączony do zestawu OctoChrome) poprzez wielokrotne pipetowanie i podgrzać alikwot o objętości 25 μl na jedno urządzenie OctoChrome do 37°C.
- Podgrzać każde urządzenie OctoChrome (dołączone do zestawu OctoChrome, patrz Rysunek 2) do 37°C, kładąc urządzenie stroną z etykietą do dołu na płycie grzejnej. NIE dotykać wypukłych powierzchni urządzenia OctoChrome, ponieważ znajdują się na nich sondy.
- Pozycjonowanie preparatu nad urządzeniem OctoChrome (Rysunek 2)
- Nanieść 2 μl podgrzanego roztworu do hybrydyzacji na każdy z ośmiu obszarów podgrzanego urządzenia OctoChrome, utrzymując temperaturę 37°C.
- Ostrożnie odwrócić szkiełko z preparatem nad urządzeniem OctoChrome w taki sposób, aby liczba 1, która znajduje się teraz do góry nogami, znajdowała się nad prawym górnym obszarem urządzenia OctoChrome. Aby ułatwić zlokalizowanie pola 1, jego pozycja na urządzeniu została zaznaczona kolorem pomarańczowym.
- Upewnić się, że szkiełko z preparatem jest dokładnie wyrównane z odpowiadającymi mu obszarami na urządzeniu OctoChrome. Ostrożnie opuścić szkiełko na urządzenie OctoChrome tak, aby krople roztworu do hybrydyzacji zetknęły się z szkiełkiem. Przyłożyć delikatny, równomierny nacisk, aby upewnić się, że roztwór do hybrydyzacji rozprowadził się do krawędzi każdego z wypukłych obszarów urządzenia OctoChrome.
- Podnieść zespół szkiełko/OctoChrome, trzymając ostrożnie za matową końcówkę szkiełka przedmiotowego, i odwrócić tak, aby szkiełko znalazło się pod urządzeniem OctoChrome. Należy upewnić się, że urządzenie nie przesunęło się po szkiełku z preparatem, ponieważ mogłoby to spowodować krzyżową kontaminację sond.
- Umieścić na płycie grzejnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) na 10 minut.
- Denaturacja
- Przenieść zespół szkiełko/urządzenie OctoChrome na płytę grzejną, dbając o to, aby trzymać go poziomo. Upewnić się, że szkiełko z preparatem równomiernie styka się z płytą grzejną.
- Denaturować na płycie grzejnej w temperaturze 75°C (+/- 1°C) przez 5 minut.
- Hybrydyzacja
- Umieścić zespół szkiełko/urządzenie OctoChrome w komorze do hybrydyzacji wielosondowej Chromoprobe.
- Zamknąć pokrywą i pozostawić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) (bez mieszania) przez noc. Uwaga: NIE uszczelniać pokrywy komory do hybrydyzacji; NIE uszczelniać pokrywy kąpieli wodnej; NIE przeprowadzać hybrydyzacji w inkubatorze. Kroki te są kluczowe dla kontroli wilgotności.
- Płukania po hybrydyzacji
- Przygotowanie roztworów do płukania
Roztwór 1: Przygotować naczynie Coplina/Hellendahla zawierające 0.4x SSC. Wyrównać temperaturę do 72°C (+/- 1°C) w kąpieli wodnej i dostosować pH do 7,0.
Roztwór 2: Przygotować naczynie Coplina/Hellendahla zawierające 2x SSC i 0,05% Tween 20. Pozostawić w temperaturze pokojowej. - Ostrożnie zdjąć urządzenie OctoChrome ze szkiełka i umieścić szkiełko w Roztworze 1 na 2 minuty.
- Przenieść szkiełko do Roztworu 2 na 30 sekund.
- Przygotowanie roztworów do płukania
4. Montowanie i wizualizacja wyników
- Nanieś 20 μl DAPI na środek każdej połowy preparatu i przykryj szkiełkiem coverglass.
- Inkubuj w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed analizą pod mikroskopem fluorescencyjnym.
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 3A przedstawia prawidłową komórkę w metafazie w Polu 2. (1)-(3): chromosomy 8, 21 i 12 zostały zabarwione na czerwono, zielono i niebiesko i są odpowiednio wizualizowane za pomocą filtrów Texas Red, FITC oraz DEAC; (4): wizualizacja za pomocą potrójnego filtra DAPI/FITC/Texas Red. Zazwyczaj chromosomy zabarwione na niebiesko nie są wyraźne przy użyciu potrójnego filtra i wymagają obserwacji pod specyficznym filtrem DEAC.
Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne nieprawidłowe komórki z translokacją chromosomową swoistą dla białaczki oraz aneuploidią. (1): t(8;21), częsta translokacja chromosomowa w ostrej białaczce szpikowej; (2): Trisomia 21, trzy kopie chromosomu 21, częsta aneuploidia w białaczkach.
Rysunek 1. Układ kombinacji chromosomów w urządzeniu OctoChrome i oczekiwane wyniki malowania chromosomów.
Rysunek 2. Pozycjonowanie preparatu na szkiełku nad urządzeniem OctoChrome.
Rycina 3. Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą metody OctoChrome FISH (Kwadrat 2).
Rysunek 3A. Prawidłowa komórka z chromosomami 8, 12, 21 zabarwionymi w Kwadracie 2.
Ryc. 3B. Reprezentatywne komórki abnormalne z leukemiczną translokacją chromosomową i aneuploidią w polu 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten nowatorski test OctoChrome-FISH umożliwia jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów w ramach jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Układ kombinacji chromosomów w 8 polach został zaprojektowany tak, aby ułatwić identyfikację nierandomowych rearanżacji chromosomowych występujących w najczęstszych białaczkach i chłoniakach. W związku z tym test ten pozwala na jednoczesne wykrywanie zarówno zmian liczbowych (aneuploidii), jak i strukturalnych (translokacji) chromosomów.
Najbardz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr Clionie M. McHale za krytyczną lekturę i redakcję rękopisu. Praca ta została sfinansowana przez National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health w ramach grantu R01ES017452 przyznanego L Zhang.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw OctoChrome | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| fitohemaglutynina (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Kolcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Fiksatyw Carnoy’a | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Mikroskop fluorescencyjny | Wyposażony w filtry do osobnej obserwacji widm DAPI, Texas Red, FITC i kumaryny oraz potrójny filtr DAPI/FITC/Texas Red do jednoczesnej obserwacji różnych kolorów | ||
| Oprogramowanie Metafer | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Ułatwia lokalizację wszystkich metafaz oraz ponowną ocenę nieprawidłowości |
Bibliografia
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
