Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

Podsumowanie

Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.

Streszczenie

Technologia macierzy tkankowej (TMA) umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu tkanek i komórek. Technika ta jest wykorzystywana w projekcie Human Protein Atlas do globalnej analizy wzorców ekspresji białek w prawidłowych tkankach ludzkich, nowotworach oraz liniach komórkowych. Przedstawiamy tutaj proces składania rdzeni o średnicy 1 mm, pobranych z mikroskopowo wybranych reprezentatywnych tkanek, w jeden odbiorczy blok TMA. Liczba i rozmiar rdzeni w bloku TMA mogą się różnić, od około czterdziestu rdzeni o średnicy 2 mm do setek rdzeni o średnicy 0,6 mm. Przewagą zastosowania technologii TMA jest możliwość szybkiego uzyskania dużej ilości danych przy użyciu jednego protokołu immunostainingu, co pozwala uniknąć zmienności eksperymentalnej. Co istotne, wymagana jest jedynie niewielka ilość rzadkich tkanek, co umożliwia analizę dużych kohort pacjentów ^{1 2}. Z bloku TMA można wyciąć około 250 kolejnych przekrojów (o grubości 4 μm), które można wykorzystać do barwienia immunohistochemicznego w celu określenia specyficznych wzorców ekspresji białek dla 250 różnych przeciwciał. W projekcie Human Protein Atlas generowane są przeciwciała przeciwko wszystkim ludzkim białkom, które służą do pozyskania odpowiednich profili białkowych zarówno w prawidłowych tkankach ludzkich od 144 osób, jak i w tkankach nowotworowych od 216 różnych pacjentów, reprezentujących 20 najczęstszych postaci nowotworów u ludzi. Immunohistochemicznie barwione przekroje TMA na szkiełkach przedmiotowych są skanowane w celu stworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości, na podstawie których patolodzy mogą interpretować i opisywać wyniki immunohistochemii. Obrazy wraz z odpowiadającymi im danymi adnotacji patologicznych są udostępniane publicznie społeczności badawczej poprzez portal Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) (Rycina 1) ^{3 4}. Human Protein Atlas dostarcza mapę pokazującą rozmieszczenie i względną obfitość białek w ludzkim organizmie. Obecna wersja zawiera ponad 11 milionów obrazów z danymi o ekspresji białek dla 12 238 unikalnych białek, co odpowiada ponad 61% wszystkich białek kodowanych przez ludzki genom.

Protokół

1. Jak przygotować tkanki do produkcji macierzy tkankowej (Animacja 1)

1. Wybrać odpowiedni materiał utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie (próbki tkanek lub komórek), wraz z odpowiadającym im skrawkiem tkanki barwionym hematoksyliną.
2. Zaznaczyć odpowiedni obszar na skrawku tkanki. Zaleca się użycie świeżo wyciętego skrawka barwionego hematoksyliną, odpowiadającego blokowi parafinowemu.
3. Opracować szablon wykorzystywany do sporządzenia TMA. Próbki w obrębie szablonu należy rozmieścić losowo, aby uniknąć artefaktów spowodowanych problemami technicznymi, takimi jak nierównomierne pokrycie całego skrawka TMA przeciwciałem czy błędy podczas mikrotomii. Do szablonu należy dodać dodatkowe znaczniki orientacyjne.
4. Zorganizować tkanki zgodnie z opracowanym szablonem.

2. Ręczne przygotowanie macierzy tkanek (TMA) (Niezbędne do filmu)

1. Aby uzyskać zestandaryzowaną długość rdzeni tkankowych, należy zaznaczyć zgłębnik, np. na 4,5 mm (Rysunek 2). Wytyczne dotyczące odstępów między środkami próbek:
   rozmiar rdzenia 0,6 mm – 0,8-1,0 mm
   rozmiar rdzenia 1,0 mm – 1,8-2,0 mm
   rozmiar rdzenia 1,5 mm – 2,0-3,0 mm
   rozmiar rdzenia 2,0 mm – 2,5-4,0 mm
   Zaleca się pozostawienie marginesów o szerokości 2,5-3,0 mm po każdej stronie bloku parafinowego, aby uniknąć pękania parafiny.
   
2. 1. Zamontuj wybrane wycinaki do użycia. Zacznij od poluzowania śrub imbusowych utrzymujących wycinak na miejscu. Wycinak jest prawidłowo ustawiony, gdy rowek w piastie wycinaka ściśle przylega do metalowego pręta w plastikowym wsporniku V. Dokręć śruby i upewnij się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma.
   2. Wycinak odbiorczy (oznaczony na zielono i czerwono, specyficzny dla dystrybutora) powinien zostać umieszczony po lewej stronie. Wycinak dawczy (oznaczony na zielono i niebiesko, specyficzny dla dystrybutora), który ma nieco większą średnicę, powinien zostać umieszczony po prawej stronie (Rysunek 3).
3. 1. Przesuwaj wycinaki wzdłuż osi x i y za pomocą pokręteł regulacji XY. Prawe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi x, a lewe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi y.
      Na obu pokrętłach regulacyjnych znajduje się cyfrowy odczyt mikrometru. Są one aktywowane podczas obracania pokręteł.
   2. Resetowanie $\rightarrow$ naciśnij przycisk ZERO/ABS.
      Przełączanie między calami a mm $\rightarrow$ naciśnij przycisk IN/mm.
      Odległość między otworami powinna wynosić 2,0 mm (mierzone między środkami otworów) przy użyciu wycinaka 1 mm dla szablonu 9x8.
4. 1. Aby upewnić się, że wycinak nie zostanie wciśnięty zbyt głęboko w blok, co mogłoby spowodować uderzenie w kasetkę i zniszczenie narzędzia, włóż do uchwytu kasetkę bez parafiny i ustaw dolną pozycję wycinaka odbiorczego na 1 mm powyżej dna kasetki, korzystając ze śruby ogranicznika głębokości w górnym lewym rogu prowadnicy Z (Rysunek 3).
   2. Włóż blok odbiorczy do uchwytu i użyj najmniejszego śrubokręta, aby dokręcić śruby. Nie dokręcaj śrub zbyt mocno, ponieważ parafina może oddzielić się od kasetki.
   3. Wciśnij wycinak odbiorczy w dół na około 5 mm w blok odbiorczy i za pomocą uchwytu w wycinaku obróć go raz w przód i w tył (Rysunek 3). Otwór będzie miał 5 mm głębokości podczas wciskania wycinaka tak głęboko w blok, jak to możliwe.
   4. Powoli zdejmij nacisk w dół, aby sprężyny mogły przesunąć wycinak w górę. Użyj zgłębnika, aby opróżnić wycinak i usunąć rdzeń parafinowy.
5. Przesuń rewolwer, aby przełączyć na wycinak dawczy (Rysunek 3).
6. Umieść mostek bloku dawczego z blokiem dawczym nad uchwytem bloku odbiorczego (Rysunek 3).
7. 1. Wciśnij wycinak dawczy w wybrany obszar bloku dawczego. Użyj odpowiadającego mu preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną, na którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę do pobrania. Przytrzymaj ręcznie blok dawczy w pozycji lewą ręką i wciśnij wycinak prawą ręką. Pamiętaj, aby nie naciskać na zgłębnik. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu wycinaka w odpowiedniej pozycji dla bloku dawczego, dlatego ważne jest, aby przestać naciskać, gdy na zgłębniku pojawi się druga marka.
   2. Obróć uchwyt wycinaka raz (Rysunek 3). Powoli zdejmij nacisk w dół, wciąż trzymając blok dawczy na mostku bloku dawczego.
   3. Tkankę dawczą najlepiej wyciąć o 0,5 mm krócej niż rdzeń odbiorczy. Proces ten zapewni możliwość regulacji wyrównania rdzeni na powierzchni bloku odbiorczego, unikając utraty cennej reprezentatywnej tkanki.
8. Zdejmij mostek i blok dawczy. Upewnij się, że wycinak dawczy jest wyrównany z otworem wykonanym wcześniej (punkt 4). Jeśli wycinak dawczy i otwór w bloku odbiorczym nie są wyrównane, należy skorygować pozycję wycinaka za pomocą śrub regulacyjnych.
9. Ostrożnie wciśnij wycinak w dół, aż jego końcówka dotknie górnej krawędzi otworu w bloku odbiorczym. Utrzymując tę pozycję, użyj zgłębnika, aby wprowadzić rdzeń tkankowy do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna być wyrównana z powierzchnią bloku.
10. Przesuń rewolwer z powrotem na wycinak odbiorczy.
11. Przejdź do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacji XY.
12. Powtarzaj czynności od punktu 4c powyżej, aż macierz zostanie ukończona.
13. Po zakończeniu pracy nad całym blokiem odbiorczym, poluzuj śruby w uchwycie bloku odbiorczego. Podgrzewaj blok w temperaturze 42 °C przez 40 minut. Połóż blok obszarem do cięcia skierowanym w dół na szkiełko przedmiotowe. Umieść szkiełko z blokiem na statywie do probówek (lub innej odpowiedniej konstrukcji) i włóż do piekarnika. Po podgrzaniu wyjmij statyw z piekarnika i wyrównaj powierzchnię bloku, delikatnie pocierając szkiełko.
14. Połóż blok wraz ze szkiełkiem na płycie chłodzącej na 10 minut.
    Aby zapewnić reprezentatywność tkanki w całym TMA, przeprowadza się kontrolę jakości każdego 50^th przekroju.

3. Jak wykonywać skrawanie TMA (Animacja 2)

1. Wyciąć skrawki o grubości 4 μm, korzystając z mikrotomu z systemem przenoszenia skrawków (HM 355S, Microm). System ten może być stosowany ze wszystkimi aktualnie dostępnymi mikrotomami obrotowymi. System składa się z uchwytu noża z zintegrowanym mostkiem przenoszenia, podgrzewanej kąpieli wodnej oraz jednostki sterującej. Skrawki ześlizgują się z noża na mokrą powierzchnię przenoszenia, przechodząc przez mostek do kąpieli wodnej.
2. Skrawki należy wyjmować z kąpieli wodnej natychmiast po ich rozprostowaniu, aby uniknąć stopienia wrażliwych obszarów tkanki (np. tkanek bogatych w lipidy, takich jak pierś i mózg). Umieścić skrawki na szkiełkach typu superfrost. Czas, przez który skrawki mogą pozostawać w wodzie, zależy od rodzaju zastosowanej parafiny oraz temperatury wody. W naszym laboratorium stosujemy parafiny firmy HistoLab Products AB, które mają temperaturę topnienia 56-58 °C, i zalecamy temperaturę kąpieli wodnej w zakresie 37-39 °C.
3. Umieścić szkiełka w uchwycie do szkiełek w celu wysuszenia w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
4. Szkiełka poddać wypalaniu w temperaturze 50 °C przez 12-24 godziny. W przypadku korzystania z mikrotomu bez STS należy ręcznie przenieść skrawki z noża do kąpieli wodnej, np. za pomocą pędzelka.

4. Procedura testowania i miareczkowania dla immunohistochemii (Animacja 3)

Każde przeciwciało poddawane jest standaryzowanej procedurze testowej z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych macierzy tkankowych (TMA), zawierających mieszankę tkanek i różnych typów komórek. Celem jest opracowanie indywidualnego i zoptymalizowanego protokołu immunobarwienia dla każdego przeciwciała. Początkowo testowane jest jedno rozcieńczenie, określone na podstawie stężenia roztworu zapasowego przeciwciała pierwszorzędowego. Wynik tego barwienia testowego służy do wyznaczenia dalszych rozcieńczeń oraz optymalizacji protokołu.

1. Przed immunobarwieniem przeprowadza się deparafinizację i rehydratację w ksylenie oraz w serii roztworów etanolu o malejącym stężeniu, kończąc wodą destylowaną.
2. Krok blokowania w celu wygaszenia endogennej peroksydazy wykonuje się w 0,3% H₂O₂ w 95% etanolu przez 5 minut.
3. Odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem (HIER) przeprowadza się w buforze do odzyskiwania o pH 6, wykorzystując autoklaw (komora Decloaking, Biocare Medical) jako źródło ciepła przez 4 minuty w 125 °C. Po zakończeniu gotowania preparaty pozostają w autoklawie i są schładzane do 90 °C. Całkowity czas procesu HIER wynosi około 45 minut.
4. Jeśli w badaniu wstępnym nie uzyskano jednoznacznego wyniku, przeprowadza się dalsze testy w zależności od obserwowanego wzoru barwienia ^{5 6}. Badanie pilotażowe, przeprowadzone w ramach wysokoprzepustowego zestawu HPA, wykazało, że najskuteczniejsze odzyskiwanie antygenu odbywało się przy zastosowaniu HIER o pH 6, jednak można oczywiście zastosować inne metody odzyskiwania, takie jak preinkubacja z proteinazą, mikrofalowanie oraz gotowanie w buforze o wyższym lub niższym pH. Poprzez zmianę warunków IHC, np. czasu inkubacji przeciwciał, ich rozcieńczeń oraz czasu inkubacji z diaminobenzydyną (DAB), można uzyskać bardziej jednoznaczne wyniki barwienia.

5. Program barwienia, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)

Wszystkie inkubacje przeprowadza się w RT, a niniejszy protokół można również zastosować w konfiguracji manualnej z użyciem tych samych odczynników.

1. Płukanie w buforze do mycia.
2. Inkubacja z Ultra V block przez 5 minut.
3. Płukanie w buforze do mycia.
4. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 30 minut.
5. Płukanie w buforze do mycia (x2).
6. Inkubacja z znakowanym polimerem peroksydazy chrzanowej przez 30 minut.
7. Płukanie w buforze do mycia (x2).
8. Wywoływanie w roztworze DAB przez 10 minut.
9. Płukanie w buforze do mycia (x2).
10. Barwienie kontrastowe hematoksyliną Mayera przez 5 minut*. Przy zastosowaniu metody barwienia progresywnego (np. hematoksyliną Mayera) intensywność zależy od czasu i nie jest wymagane różnicowanie. Metoda barwienia regresywnego, np. hematoksyliną Harrisa, wymaga różnicowania w celu usunięcia nadmiaru barwnika z tkanek, aby uwydatnić strukturę.
11. Płukanie wodą z kranu*.
12. Płukanie wodą z węglanem litu, rozcieńczoną 1:5 z roztworu nasyconego, przez 1 minutę*.
13. Płukanie wodą z kranu przez 5 minut*.
14. Odwodnienie preparatów w seriach etanolu o rosnącym stężeniu, a następnie zamknięcie ich pod szkiełkami nakrywnymi (PERTEX, Histolab)

Wszystkie odczynniki nanosi się w objętości 300 μl na jeden preparat.
* Kroki 10-14 wykonuje się w aparacie do barwienia histologicznego (Autostainer XL, Leica), a nakładanie szkiełek przykrywek odbywa się dodatkowo w systemie do przykrywania preparatów (Automated glass coverslipper CV5030, Leica).

6. Sposób skanowania preparatu

Metoda skanowania preparatów zależy od wykorzystywanego skanera cyfrowego; niniejszy protokół definiuje jedynie sposób skanowania preparatu przy użyciu zautomatyzowanego systemu skanującego Aperio XT (Aperio Technologies). W konfiguracji Human Protein Atlas stosuje się powiększenie 20x dla tkanek oraz 40x dla komórek. Podczas skanowania automatycznego mogą wystąpić problemy z ostrością ze względu na heterogeniczność tkanki oraz liczbę różnych tkanek zawartych w TMA.

1. Oczyść szkiełko przedmiotowe z zabrudzeń i kleju oraz sprawdź, czy między szkiełkiem nakrywkowym a skrawkiem nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wystąpienia pęcherzyków powietrza ponownie zamontuj preparat na szkiełku.
2. Umieść szkiełko w statywie, a statyw w skanerze cyfrowym. Czas skanowania TMA przy powiększeniu 20x wynosi około 6 minut. Do wyboru obszaru zainteresowania wykorzystywane jest oprogramowanie firmy Aperio. Wybór punktów ostrości odbywa się automatycznie w ramach oprogramowania. Możliwy jest również ręczny wybór obszaru skanowania oraz punktów ostrości.
3. Wygenerowany obraz można wykorzystać do oceny i adnotacji barwienia IHC. Obrazy pozostają jako plik wynikowy eksperymentu i mogą być przekazywane współpracownikom do dyskusji oraz wykorzystywane w dalszej publikacji danych. Obrazy można przeglądać w bezpłatnie dostępnym oprogramowaniu firmy Aperio.

7. Jak wyszukiwać wybrane białka w bazie danych Human Protein Atlas

1. Przejdź na stronę www.proteinatlas.org.
2. Wpisz nazwę wybranego białka, identyfikator Ensembl, numer dostępu UniProt lub nazwę HGNC, np. insulinę.
3. Przejdź do strony podsumowania i przewiń w dół do sekcji podsumowania tkanek i organów (normal tissue and organ summary). Przegląd prezentuje ekspresję białka w trzustce.
4. Kliknij „more tissue data”. Przejdziesz do widoku tkanek prawidłowych, w którym możesz zobaczyć wszystkie uwzględnione tkanki posortowane według organów.
5. Kliknij trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla trzech przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Aby wyświetlić obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości, kliknij na obraz.
6. Dodatkowe informacje na temat ekspresji białka w tkankach nowotworowych, komórkach oraz dalsze dane walidacyjne w ramach Human Protein Atlas można znaleźć, przeglądając stronę internetową Human Protein Atlas.

8. Reprezentatywne wyniki

Animacja 1. Sposób przygotowania tkanek do produkcji macierzy tkankowej (TMA). Kliknij tutaj, aby obejrzeć Animację 1.

Animacja 2. Jak przygotowywać skrawki z bloków TMA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 2.

Animacja 3. Opisano technikę immunohistochemii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 3.

Rycina 1. Ogólny schemat procesu w Human Protein Atlas w Uppsali.

Rycina 2. Stylet pobierający z oznaczeniem standaryzowanej długości rdzeni tkankowych, np. 4,5 mm.

Rysunek 3. Ręczny aparat do tworzenia mikroarray tkankowych.

Rycina 4. Przykłady różnej jakości otrzymanych TMA. (A) Prosty i prawidłowo wyrównany TMA z wystarczającą przestrzenią między rzędami i kolumnami, a także do krawędzi parafiny. (B) TMA, w którym niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie spowoduje trudności podczas skrawania. (C) TMA, który był wypiekany zbyt długo, co doprowadziło do zapadnięcia się TMA i utraty prawidłowej struktury szablonu.

Rysunek 5. TMA barwione hematoksyliną i eozyną. (A) Prawidłowo wycięty przekrój z prostymi i wyrównanymi kolumnami oraz rzędami. Użycie zużytego lub zabrudzonego ostrza może prowadzić do rozwarstwienia (B) lub zmiażdżenia przekrojów (C).

Rysunek 6. Miareczkowanie przeciwciał. (A) Komórki centrum reakcyjnego w węźle chłonnym wykazują optymalnie zmiareczkowane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmatycznym (zaznaczonym na brązowo) bez tła. (B) Przekrój tkanki wykazuje słabe barwienie. Barwienie negatywne lub słabe występuje, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub gdy białko docelowe nie występuje w tkankach poddanych immunostainingowi. (C) Przekrój tkanki jest przebarwiony z powodu zastosowania zbyt wysokiego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego. Ciemny kolor utrudnia określenie lokalizacji subkomórkowej ze względu na rozlewanie się barwnika, reaktywność krzyżową i fałszywie dodatnie wyniki.

Dyskusja

Immunohistochemia jest zdecydowanie najczęstszym zastosowaniem macierzy tkankowych (TMA). Połączenie IHC i TMA może być wykorzystywane w różnych warunkach, np. podczas wysokoprzepustowego przesiewowego badania wzorców ekspresji białek w tkankach ^{7 8} i komórkach ^{9 10}, w badaniach nad odkrywaniem biomarkerów opartych na próbkach tkanek z dużych kohort pacjentów ^{11 12} oraz w bardziej podstawowych badaniach biologii nowotworów, obejmujących różne fenotypy/genotypy, stadia różnicowania, progresję i przerzuty ¹³. Jedną z zalet stosowania TMA jest możliwość jednoczesnej analizy materiału z dużych kohort, co pozwala zarówno na oszczędność cennego materiału biologicznego, jak i zapewnienie większej powtarzalności eksperymentów. Ponadto zastosowanie technologii TMA pozwala zredukować koszty odczynników oraz czas przetwarzania laboratoryjnego. Ponieważ TMA zawiera ograniczoną ilość tkanki, problemem może być heterogenność tkankowa. W zależności od rodzaju tkanki i stawianych pytań badawczych, z jednego preparatu może być konieczne pobranie kilku próbek. W przypadku tkanek nowotworowych zaleca się pobranie od dwóch do czterech rdzeni z każdego preparatu, ponieważ wykazano, że zapewnia to wysoki stopień dokładności w reprezentowaniu całych przekrojów tkanki ^{13 14}. W zależności od składu tkanki można dostosować średnicę wycinaków (w zakresie od 0,6 mm do 2 mm). Tkanki są złożone i składają się z wielu różnych typów komórek, struktur oraz macierzy zewnątrzkomórkowej. Skład każdego rodzaju tkanki, zawierający zmienną ilość tłuszczu, naczyń krwionośnych, tkanki łącznej, chrząstki itp., będzie wpływać na nacisk potrzebny do wycięcia i zebrania poszczególnych rdzeni. Dlatego ważne jest, aby przećwiczyć wszystkie kroki procedury na materiale nieposiadającym wartości badawczej przed przygotowaniem TMA z określonych tkanek do planowanych eksperymentów.

Podczas skrawania różnych rodzajów tkanek w obrębie jednego bloku TMA, skład bloku może wpływać na możliwość uzyskania przekrojów wysokiej jakości. Niektóre tkanki, np. skóra, szpik kostny, tkanka tłuszczowa, mózg i pierś, utrudniają skrawanie bloku TMA ze względu na różnice w teksturze, które wpływają na to, jak przekroje rozprostowują się w kąpieli wodnej oraz jak różna twardość jest cięta przez ostrze itp. Dlatego zaleca się, jeśli to możliwe, grupowanie tkanek o podobnych cechach, np. tkanek bogatych w lipidy, w jednym bloku TMA. Większość tkanek nowotworowych jest w tym sensie jednorodna, co ułatwia skrawanie TMA z nowotworami. W przypadku pracy z TMA zawierającym heterogeniczne typy tkanek można zastosować alternatywną metodę skrawania w celu stabilizacji rdzeni mikroarray. Użycie taśmy klejącej może pomóc w zapobieganiu utracie rdzeni i ich wypadaniu z przekrojonego TMA. Z taśmy klejącej należy korzystać ostrożnie, ponieważ może ona wpływać na grubość skrawanych rdzeni, a w konsekwencji również na wynik barwienia IHC ¹⁵. W konfiguracji Human Protein Atlas stosowany jest szablon TMA o rozmiarze 9x8 rdzeni (wyłączając markery). Istotne jest uzyskanie maksymalnej liczby przekrojów i zachowanie reprezentatywności wszystkich tkanek w całym bloku. Aby zaoszczędzić odczynniki i czas skanowania, dwa przekroje umieszcza się na jednym szkiełku przedmiotowym, co umożliwia zastosowanie maksymalnego szablonu 9x8.

Główny repozytorium informacji o białkach, Universal Protein Resource ¹⁶, zawiera około 20 300 zweryfikowanych wpisów dotyczących ludzkich białek, z czego tylko około 66% posiada dowody na poziomie białka. Ponadto dla większości genów, dla których istnieją dowody na obecność na poziomie białka, informacje o funkcji białka i rozkładzie jego ekspresji są szczupłe lub nie istnieją. Ważnym wyzwaniem na przyszłość jest analiza wzorca rozkładu i względnej liczebności tych nieznanych białek w różnych typach ludzkich tkanek. Informacje z baz danych takich jak Uniprot, ENSEMBL oraz opublikowane dane z PubMed mogą służyć jako wskazówka do ustalenia, czy wzorce barwienia immunohistochemicznego z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko nieznanym białkom reprezentują rzeczywiste profile białkowe docelowego białka. Ponadto konieczne jest zastosowanie kilku innych strategii walidacji w celu zapewnienia funkcjonalności przeciwciał, na przykład oceny funkcjonalności przeciwciał w macierzach białkowych, w metodzie Western blot, immunofluorescencji, immunoprecypitacji oraz w eksperymentach pull-down. Być może najważniejszym narzędziem walidacji funkcjonalności przeciwciał jest zastosowanie przeciwciał sparowanych, tj. dwóch różnych przeciwciał wytworzonych przeciwko oddzielnym, niepokrywającym się epitopom tego samego białka docelowego, aby porównać wyniki specyficzne dla danego testu ¹⁷.

Na podstawie zebranych informacji przeciwciała są testowane i mianowane zgodnie ze standardami IHC oraz doświadczeniem zdobytym podczas testowania i walidacji ponad 35 000 przeciwciał w projekcie Human Protein Atlas. W przypadku ponad 20% wszystkich genów z profilami białkowymi wykorzystano dane z par przeciwciał (2 lub więcej przeciwciał skierowanych przeciwko niepokrywającym się epitopom tego samego białka), aby określić najlepszą szacunkową wartość wzorca ekspresji odpowiedniego białka. Pary przeciwciał stanowią doskonałą strategię walidacji specyficznych wzorców ekspresji białek opartych na immunohistochemii. Strategia ta jest cenna, ponieważ duża liczba różnych tkanek ujętych w podstawowym przesiewie zwiększa ryzyko reaktywności krzyżowej. Należy również zauważyć, że niektóre tkanki są ogólnie bardziej podatne na barwienie tła, np. makrofagi, mięśnie gładkie, cewki dystalne w nerkach i hepatocyty w wątrobie. Dodatkowe kwestie do rozważenia obejmują różnice w technikach przetwarzania tkanek na przestrzeni czasu w przypadku materiałów archiwalnych, co może prowadzić do fałszywie ujemnych lub niewłaściwych dodatnich wzorców barwienia IHC. Zjawisko to występuje również w analizie dużych przekrojów. Zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne są kluczowe i powinny być stosowane wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. W przypadku bardziej szczegółowych badań, w tym analiz funkcjonalnych, do stworzenia kontroli można wykorzystać linie komórkowe z wymuszoną ekspresją oraz specyficznym wyciszeniem odpowiednich transkrypcji (technologia siRNA). Aby uzyskać optymalne wyniki w IHC, ważne jest testowanie i stosowanie systemów odzyskiwania antygenu, ponieważ fiksacja formaliną indukuje różne modyfikacje chemiczne, np. sieciowanie, hydrolizę zasad Schiffa maskujących antygen ¹⁸.

Podsumowując, proteomika oparta na przeciwciałach z wykorzystaniem technologii TMA i IHC stanowi potężną strategię generowania danych o ekspresji białek na szeroką skalę. Projekt Human Protein Atlas został powołany w celu stworzenia mapy ekspresji białek ludzkich w prawidłowych tkankach oraz w nowotworach. Celem tego projektu jest przedstawienie pierwszej wersji kompleksowego atlasu białek ludzkich do 2015 roku. Oprócz dostarczenia profili białkowych w prawidłowych organach i tkankach, przedsięwzięcie to stanowi również punkt wyjścia dla projektów badawczych z zakresu biomedycyny, w tym dla wysiłków zmierzających do odkrycia klinicznych biomarkerów. Ostatecznym celem jest dodanie kolejnej warstwy informacji nad sekwencją ludzkiego genomu, co będzie miało kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia biologii leżącej u podstaw różnych stanów chorobowych oraz dostarczy podstaw do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do płukania	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-999-TT
Bufor cytrynianowy pH6	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-250-Pm1X
Rozcieńczalnik do przeciwciał	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-UD
Polimer HRP UltraVision LP	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TL-125-HL
System substratu DAB plus	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-HDX
Ultra V Block	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-UB
Wzmacniacz przeciwciał pierwszorzędowych	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TL-125-PB
Hematoksylina Mayera	Histolab	01820
PERTEX	Histolab	00871.0500
Ręczny przyrząd do tworzenia macierzy tkankowych	Estigen, Beecher Instrument	MTA-1
Mikrotom kaskadowy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Microm HM 355S
Automatyczny skaner obrazów	Aperio Technologies	XT
Automatyczny system barwienia preparatów	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Autostainer 480S-2D
Automatyczny system barwienia preparatów do deparafinacji i odwadniania	Leica Microsystems	Autostainer XL
Automatyczna zaklejarka szkiełek	Leica Microsystems	CV5030
Komora do zdemaskowania antygenów	Biocare Medical	DC2008INTEL