Artykuł metodologiczny

Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

57.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3620

⸱

31 maja 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory, Uppsala University

W tym artykule

Podsumowanie

Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.

Streszczenie

Technologia macierzy tkankowej (TMA) umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu tkanek i komórek. Technika ta jest wykorzystywana w projekcie Human Protein Atlas do globalnej analizy wzorców ekspresji białek w prawidłowych tkankach ludzkich, nowotworach oraz liniach komórkowych. Przedstawiamy tutaj proces składania rdzeni o średnicy 1 mm, pobranych z mikroskopowo wybranych reprezentatywnych tkanek, w jeden odbiorczy blok TMA. Liczba i rozmiar rdzeni w bloku TMA mogą się różnić, od około czterdziestu rdzeni o średnicy 2 mm do setek rdzeni o średnicy 0,6 mm. Przewagą zastosowania technologii TMA jest możliwość szybkiego uzyskania dużej ilości danych przy użyciu jednego protokołu immunostainingu, co pozwala uniknąć zmienności eksperymentalnej. Co istotne, wymagana jest jedynie niewielka ilość rzadkich tkanek, co umożliwia analizę dużych kohort pacjentów 1 2. Z bloku TMA można wyciąć około 250 kolejnych przekrojów (o grubości 4 μm), które można wykorzystać do barwienia immunohistochemicznego w celu określenia specyficznych wzorców ekspresji białek dla 250 różnych przeciwciał. W projekcie Human Protein Atlas generowane są przeciwciała przeciwko wszystkim ludzkim białkom, które służą do pozyskania odpowiednich profili białkowych zarówno w prawidłowych tkankach ludzkich od 144 osób, jak i w tkankach nowotworowych od 216 różnych pacjentów, reprezentujących 20 najczęstszych postaci nowotworów u ludzi. Immunohistochemicznie barwione przekroje TMA na szkiełkach przedmiotowych są skanowane w celu stworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości, na podstawie których patolodzy mogą interpretować i opisywać wyniki immunohistochemii. Obrazy wraz z odpowiadającymi im danymi adnotacji patologicznych są udostępniane publicznie społeczności badawczej poprzez portal Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) (Rycina 1) 3 4. Human Protein Atlas dostarcza mapę pokazującą rozmieszczenie i względną obfitość białek w ludzkim organizmie. Obecna wersja zawiera ponad 11 milionów obrazów z danymi o ekspresji białek dla 12 238 unikalnych białek, co odpowiada ponad 61% wszystkich białek kodowanych przez ludzki genom.

Protokół

1. Jak przygotować tkanki do produkcji macierzy tkankowej (Animacja 1)

  1. Wybierz odpowiedni materiał utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie (próbki tkanek lub komórek), w tym odpowiadający im skrawek tkanki barwiony hematoksyliną.
  2. Zaznacz odpowiedni obszar na skrawku tkanki. Zaleca się użycie świeżo wyciętego skrawka barwionego hematoksyliną, odpowiadającego blokowi parafinowemu.
  3. Opracuj szablon wykorzystywany do produkcji TMA. Randomizuj próbki w obrębie szablonu, aby uniknąć artefaktów spowodowanych problemami technicznymi, takimi jak nierównomierne pokrycie całego skrawka TMA przeciwciałem oraz problemy z cięciem. Dodaj do szablonu dodatkowe znaczniki orientacyjne.
  4. Zorganizuj tkanki zgodnie z szablonem.

2. Ręczne przygotowanie macierzy tkanek (Niezbędne do celów filmowania)

  1. Aby uzyskać ustandaryzowaną długość rdzeni tkankowych, należy zaznaczyć stylet, np. 4,5 mm (Rysunek 2). Wytyczne dotyczące odstępów między centrami próbek:
    rozmiar rdzenia 0,6 mm – 0,8-1,0 mm
    rozmiar rdzenia 1,0 mm – 1,8-2,0 mm
    rozmiar rdzenia 1,5 mm – 2,0-3,0 mm
    rozmiar rdzenia 2,0 mm – 2,5-4,0 mm
    Zaleca się pozostawienie marginesów 2,5-3,0 mm z każdej strony bloku parafiniowego, aby uniknąć pękania parafiny.
    1. Zamontuj wybrane wycinaki do użycia. Zacznij od poluzowania śrub z gniazdem sześciokątnym, które utrzymują wycinak na miejscu. Wycinak jest prawidłowo ustawiony, gdy rowek w piaście wycinaka jest ściśle przylegać do metalowego pręta w plastikowym wsporniku V. Dokręć śruby i upewnij się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma.
    2. Wycinak odbiorczy (oznaczony na zielono i czerwono, specyficzny dla dystrybutora) powinien zostać umieszczony po lewej stronie. Wycinak dawczy (oznaczony na zielono i niebiesko, specyficzny dla dystrybutora), który ma nieco większą średnicę, powinien zostać umieszczony po prawej stronie (Rysunek 3).
    1. Przesuwaj wycinaki wzdłuż osi x i y za pomocą pokręteł regulacyjnych XY. Prawe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi x, a lewe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi y.
      Na obu pokrętłach regulacyjnych znajduje się cyfrowy odczyt mikrometryczny. Są one aktywowane podczas obracania pokręteł.
    2. Resetowanie → naciśnij przycisk ZERO/ABS.
      Przełączanie między calami a mm → naciśnij przycisk IN/mm.
      Odległość między otworami powinna wynosić 2,0 mm (mierzona między centrami otworów) przy użyciu wycinaka 1 mm dla szablonu 9x8.
    1. Aby upewnić się, że wycinak nie zostanie wciśnięty zbyt głęboko w blok, uderzając w kasetkę i niszcząc wycinak, włóż do uchwytu kasetkę bez parafiny i ustaw dolną pozycję wycinaka odbiorczego na 1 mm powyżej dna kasetki za pomocą śruby ogranicznika głębokości w lewym górnym rogu prowadnicy Z (Rysunek 3).
    2. Włóż blok odbiorczy do uchwytu i użyj najmniejszego śrubokręta, aby dokręcić śruby. Nie dokręcaj śrub zbyt mocno, ponieważ parafina może oddzielić się od kasetki.
    3. Wciśnij wycinak odbiorczy w dół na około 5 mm do bloku odbiorczego i użyj uchwytu w wycinaku, aby obrócić go raz w przód i w tył (Rysunek 3). Otwór będzie miał 5 mm głębokości przy maksymalnym wciśnięciu wycinaka w blok.
    4. Powoli zmniejsz nacisk w dół, aby sprężyny mogły przesunąć wycinak w górę. Użyj styletu, aby opróżnić wycinak i usunąć rdzeń parafiny.
  5. Przesuń wieżyczkę, aby przełączyć na wycinak dawczy (Rysunek 3).
  6. Umieść mostek bloku dawczego z blokiem dawczym nad uchwytem bloku odbiorczego (Rysunek 3).
    1. Wciśnij wycinak dawczy w wybrany obszar bloku dawczego. Użyj odpowiadającego mu preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną, na którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę do pobrania. Przytrzymaj ręcznie blok dawczy w pozycji lewą ręką i wciśnij wycinak prawą ręką. Pamiętaj, aby nie naciskać na stylet. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu wycinaka w odpowiedniej pozycji dla bloku dawczego, dlatego ważne jest, aby przestać naciskać, gdy na stylecie pojawi się drugi znacznik.
    2. Obróć uchwyt wycinaka raz (Rysunek 3). Powoli zdejmij nacisk w dół, nadal trzymając blok dawczy na mostku bloku dawczego.
    3. Tkanka dawcza powinna być najlepiej wycięta o 0,5 mm krócej niż rdzeń odbiorczy. Proces ten zapewni możliwość regulacji wyrównania rdzeni na powierzchni bloku odbiorczego, zapobiegając utracie cennej reprezentatywnej tkanki.
  8. Zdejmij mostek i blok dawczy. Upewnij się, że wycinak dawczy jest wyrównany z otworem wykonanym wcześniej (punkt 4). Jeśli wycinak dawczy i otwór w bloku odbiorczym nie są wyrównane, należy skorygować pozycję wycinaka za pomocą śrub regulacyjnych.
  9. Ostrożnie wciśnij wycinak w dół, aż jego końcówka dotknie góry otworu w bloku odbiorczym. Utrzymując tę pozycję, użyj styletu, aby wprowadzić rdzeń tkankowy do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna być wyrównana z powierzchnią bloku.
  10. Przesuń wieżyczkę z powrotem na wycinak odbiorczy.
  11. Przejdź do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacyjnych XY.
  12. Powtarzaj czynności od punktu 4c powyżej, aż macierz zostanie ukończona.
  13. Po zakończeniu pracy nad całym blokiem odbiorczym poluzuj śruby w uchwycie bloku odbiorczego. Podgrzewaj blok w temperaturze 42 °C przez 40 minut. Połóż blok obszarem do cięcia skierowanym w dół na szkiełko przedmiotowe. Umieść szkiełko z blokiem na statywie do probówek (lub innej odpowiedniej konstrukcji) i włóż do piekarnika. Po podgrzaniu wyjmij statyw z piekarnika i wyrównaj powierzchnię bloku, delikatnie pocierając szkiełko przedmiotowe.
  14. Umieść blok wraz ze szkiełkiem na płycie chłodzącej na 10 minut.
    Aby zapewnić reprezentatywną tkankę w całym TMA, przeprowadza się kontrolę jakości każdego 50tego przekroju.

3. Jak przygotować skrawki z TMAs (Animacja 2)

  1. Wyciąć skrawki o grubości 4 μm przy użyciu mikrotomu z systemem transferu skrawków (HM 355S, Microm). System ten można stosować ze wszystkimi obecnymi mikrotomami obrotowymi. System składa się z uchwytu noża z zintegrowanym mostkiem transferowym, podgrzewanej kąpieli wodnej i jednostki sterującej. Z noża skrawki przesuwają się po mokrej powierzchni transferowej poprzez mostek transferowy do kąpieli wodnej.
  2. Skrawki należy wyjmować z kąpieli wodnej natychmiast po ich rozprostowaniu, aby uniknąć stopienia wrażliwych obszarów tkanki (np. tkanek bogatych w lipidy, takich jak pierś i mózg). Umieścić skrawki na szkiełku typu superfrost. Czas, przez jaki skrawki mogą pozostawać w wodzie, zależy od rodzaju zastosowanej parafiny oraz temperatury wody. W naszym laboratorium stosujemy parafinę firmy HistoLab Products AB, która ma temperaturę topnienia 56-58 °C, i zalecamy temperaturę kąpieli wodnej 37-39 °C.
  3. Umieścić szkiełka w statywie do szkiełek w celu wysuszenia w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
  4. Szkiełka należy poddać wypalaniu w temperaturze 50 °C przez 12-24 godziny. Przy użyciu mikrotomu bez STS należy transportować skrawki z noża do kąpieli wodnej ręcznie, np. za pomocą pędzelka.

4. Procedura testowa i miareczkowania dla immunohistochemii (Animacja 3)

Każde przeciwciało poddaje się standaryzowanej procedurze testowej z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych macierzy tkankowych (TMA), zawierających mieszankę tkanek i różnych typów komórek. Celem jest opracowanie indywidualnego i zoptymalizowanego protokołu immunobarwienia dla każdego przeciwciała. Początkowo testowane jest jedno rozcieńczenie, określone na podstawie stężenia roztworu zakładowego przeciwciała pierwotnego. Wynik tego barwienia testowego służy do wyznaczenia kolejnych rozcieńczeń i optymalizacji protokołu.

  1. Przed immunobarwieniem przeprowadza się deparafiniзацию i rehydratację w ksylenie oraz w serii roztworów etanolu o malejącej stężeniu, aż do wody destylowanej.
  2. Krok blokowania w celu wygaszenia endogennej peroksydazy wykonuje się w 0,3 % H2O2 w 95% etanolu przez 5 minut.
  3. Odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem (HIER) przeprowadza się w buforze do odzyskiwania o pH 6, wykorzystując autoklaw (Decloaking chamber, Biocare Medical) jako źródło ciepła przez 4 minuty w temperaturze 125 °C. Po zakończeniu gotowania preparaty pozostają w autoklawie i stygną do 90 °C. Całkowity czas procesu HIER wynosi około 45 minut.
  4. Jeśli w początkowym teście nie uzyskano rozstrzygającego wyniku, przeprowadza się dalsze próby w zależności od obserwowanego wzorca barwienia 5 6. Badanie pilotażowe w ramach wysokoprzepustowego systemu HPA wykazało, że najskuteczniejszym odzyskiwaniem antygenów było HIER przy pH 6, jednak można oczywiście stosować inne metody odzyskiwania, takie jak preinkubacja z proteinazą, mikrofalowanie oraz gotowanie w buforach o wyższym lub niższym pH. Poprzez modyfikację warunków IHC, np. zmianę czasu inkubacji przeciwciał, ich rozcieńczeń oraz czasu inkubacji z diaminobenzydyną (DAB), można uzyskać bardziej jednoznaczne wyniki barwienia.

5. Program barwienia, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)

Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze RT; protokół ten można również zastosować w konfiguracji manualnej z użyciem tych samych odczynników.

  1. Płukanie w buforze do mycia.
  2. Inkubacja z Ultra V block przez 5 minut.
  3. Płukanie w buforze do mycia.
  4. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 30 minut.
  5. Płukanie w buforze do mycia (2x).
  6. Inkubacja z znakowanym polimerem peroksydazy chrzanowej przez 30 minut.
  7. Płukanie w buforze do mycia (2x).
  8. Wywoływanie w roztworze DAB przez 10 minut.
  9. Płukanie w buforze do mycia (2x).
  10. Kontrastowanie w hematoksylinie Mayera przez 5 minut*. Przy zastosowaniu metody barwienia progresywnego (np. hematoksylina Mayera) intensywność zależy od czasu i nie jest wymagana dyferencjacja. Metoda barwienia regresywnego, np. hematoksylina Harrisa, wymaga dyferencjacji w celu usunięcia nadmiaru barwnika z tkanek, aby uwydatnić strukturę.
  11. Płukanie w wodzie z kranu*.
  12. Płukanie w wodzie z węglanem litu, rozcieńczonej 1:5 z roztworu nasyconego, przez 1 minutę*.
  13. Płukanie w wodzie z kranu przez 5 minut*.
  14. Odwodnienie preparatów w szeregu stężeń etanolu i przykrycie szkiełek cover-slipem (PERTEX, Histolab).

Wszystkie odczynniki nanosi się w objętości 300 μl na każdy preparat.
* Kroki 10-14 wykonuje się w urządzeniu do barwienia histologicznego (Autostainer XL, Leica), a nakładanie szkiełek zakrywających wykonuje się dodatkowo w systemie do nakładania szkiełek (Automated glass coverslipper CV5030, Leica).

6. Jak skanować preparat

Metoda skanowania preparatów zależy od wykorzystywanego skanera cyfrowego; niniejszy protokół określa jedynie sposób skanowania preparatu przy użyciu zautomatyzowanego systemu skanującego Aperio XT (Aperio Technologies). W konfiguracji Human Protein Atlas stosuje się powiększenie 20x dla tkanek i 40x dla komórek. Skanowanie zautomatyzowane może napotkać problemy z ostrością ze względu na heterogeniczność tkanki oraz liczbę różnych tkanek zawartych w TMA.

  1. Oczyść szkiełko przedmiotowe z zabrudzeń i kleju oraz sprawdź, czy między szkiełkiem nakrywką a skrawkiem nie znajdują się pęcherzyki powietrza. W przypadku obecności pęcherzyków powietrza ponownie zamontuj preparat na szkiełku.
  2. Włóż szkiełko do statywu, a następnie umieść statyw w skanerze cyfrowym. Czas skanowania TMA przy powiększeniu 20x wynosi około 6 minut. Do wyboru obszaru zainteresowania wykorzystywane jest oprogramowanie firmy Aperio. Wybór punktów ostrości odbywa się automatycznie w ramach oprogramowania. Możliwy jest również ręczny wybór obszaru skanowania i punktów ostrości.
  3. Po wygenerowaniu obrazu można go wykorzystać do oceny i adnotacji barwienia IHC. Obrazy pozostają jako plik wynikowy eksperymentu i mogą być przesyłane do współpracowników w celu dyskusji oraz wykorzystane do publikacji danych. Obrazy można przeglądać w bezpłatnie dostępnym oprogramowaniu firmy Aperio.

7. Jak wyszukiwać ulubione białko w bazie Human Protein Atlas

  1. Przejdź do strony www.proteinatlas.org.
  2. Wprowadź nazwę wybranego białka, identyfikator Ensembl, numer akcesyjny UniProt lub nazwę HGNC, np. insulinę.
  3. Otwórz stronę podsumowania i przewiń w dół do sekcji podsumowania dla normalnych tkanek i narządów. Przegląd pokazuje ekspresję białka w trzustce.
  4. Kliknij „more tissue data”. Przejdziesz do widoku tkanek prawidłowych, gdzie zobaczysz wszystkie uwzględnione tkanki posortowane według narządów.
  5. Kliknij trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla 3 przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Aby zobaczyć obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości, kliknij w zdjęcie.
  6. Dodatkowe informacje na temat ekspresji białek w tkankach nowotworowych, komórkach oraz dalsze dane walidacyjne w ramach Human Protein Atlas można znaleźć, przeglądając stronę internetową Human Protein Atlas.

8. Reprezentatywne wyniki

Animacja 1. Sposób przygotowania tkanek do produkcji mikromacierzy tkankowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 1.

Animacja 2. Jak wykonywać skrawanie TMAs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 2.

Animacja 3. Opisano technikę immunohistochemii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 3.

Schemat procesu macierzy tkanek, cyfrowa analiza preparatów, barwienie przeciwciałami z wykorzystaniem Human Protein Atlas.
Rysunek 1. Ogólny schemat procesu w ramach projektu Human Protein Atlas w Uppsali.

Równowaga statyczna; mosiężny element wahadła; zaznaczona długość; schemat; eksperyment fizyczny.
Rysunek 2. Styla donorowy z zaznaczoną ustandaryzowaną długością rdzeni tkankowych, np. 4,5 mm.

Schemat przygotowania mikroarray tkankowego z punktami dawczymi i biorczymi do analizy próbek.
Rycina 3. Ręczny aparat do mikroarray tkankowych.

Wyniki analizy dot blot; detekcja białek; trzy próbki membran wykazujące różne wzorce wiązania.
Rysunek 4. Przykłady różnej jakości wykonanych TMA. (A) Prosta i prawidłowo wyrównana TMA z odpowiednimi odstępami między rzędami i kolumnami, a także od krawędzi parafiny. (B) TMA, w której niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie spowoduje trudności podczas skrawania. (C) TMA, która była wypiekana zbyt długo, co doprowadziło do zapadnięcia się bloku TMA i utraty prawidłowego wzorca.

Wyniki analizy dot blot, przedstawiające detekcję białek na membranach, oznaczone jako A, B, C.
Rycina 5. TMAs barwione hematoksyliną i eozyną. (A) Prawidłowo wycięty przekrój z prostymi i wyrównanymi kolumnami oraz rzędami. Użycie zużytego lub zanieczyszczonego ostrza może prowadzić do rozwarstwienia (B) lub zgniatania przekrojów (C).

Analiza immunohistochemiczna; porównanie ekspresji białek w przekrojach tkanek, zawiera schemat metody.
Rysunek 6. Miareczkowanie przeciwciał. (A) Komórki centrum reakcyjnego w węźle chłonnym wykazują optymalnie zmiareczkowane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmy (pokazanym na brązowo) bez tła. (B) Przekrój tkanki wykazuje słabe barwienie. Barwienie negatywne lub słabe występuje, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub gdy białko docelowe nie występuje w tkankach poddanych immunohistochemii. (C) Przekrój tkanki jest przebarwiony z powodu zastosowania zbyt wysokiego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego. Ciemny kolor powoduje trudności w określeniu lokalizacji subkomórkowej ze względu na rozlewanie się barwnika, reakcje krzyżowe i fałszywie dodatnie wyniki.

Dyskusja

Immunohistochemia jest zdecydowanie najczęstszym zastosowaniem macierzy tkankowych (TMA). Połączenie IHC i TMA może być wykorzystywane w różnych warunkach, np. podczas wysokoprzepustowego przesiewowego badania wzorców ekspresji białek w tkankach 7 8 i komórkach 9 10, w badaniach nad odkrywaniem biomarkerów opartych na próbkach tkanek z dużych kohort pacjentów 11 12 oraz w bardziej podstawowych badaniach biologii nowotworów, obejmujących różne fenotypy/genotypy, stadia różnicowania, progresję i przerzuty 13. Jedną z zalet stosowania TMA jest możliwość jednoczesnej analizy materiału z dużych kohort, co pozwala zarówno na oszczędność cennego materiału biologicznego, jak i zapewnienie większej powtarzalności eksperymentów. Ponadto zastosowanie technologii TMA pozwala zredukować koszty odczynników oraz czas przetwarzania laboratoryjnego. Ponieważ TMA zawiera ograniczoną ilość tkanki, problemem może być heterogenność tkankowa. W zależności od rodzaju tkanki i stawianych pytań badawczych, z jednego preparatu może być konieczne pobranie kilku próbek. W przypadku tkanek nowotworowych zaleca się pobranie od dwóch do czterech rdzeni z każdego preparatu, ponieważ wykazano, że zapewnia to wysoki stopień dokładności w reprezentowaniu całych przekrojów tkanki 13 14. W zależności od składu tkanki można dostosować średnicę wycinaków (w zakresie od 0,6 mm do 2 mm). Tkanki są złożone i składają się z wielu różnych typów komórek, struktur oraz macierzy zewnątrzkomórkowej. Skład każdego rodzaju tkanki, zawierający zmienną ilość tłuszczu, naczyń krwionośnych, tkanki łącznej, chrząstki itp., będzie wpływać na nacisk potrzebny do wycięcia i zebrania poszczególnych rdzeni. Dlatego ważne jest, aby przećwiczyć wszystkie kroki procedury na materiale nieposiadającym wartości badawczej przed przygotowaniem TMA z określonych tkanek do planowanych eksperymentów.

Podczas skrawania różnych rodzajów tkanek w obrębie jednego bloku TMA, skład bloku może wpływać na możliwość uzyskania przekrojów wysokiej jakości. Niektóre tkanki, np. skóra, szpik kostny, tkanka tłuszczowa, mózg i pierś, utrudniają skrawanie bloku TMA ze względu na różnice w teksturze, które wpływają na to, jak przekroje rozprostowują się w kąpieli wodnej oraz jak różna twardość jest cięta przez ostrze itp. Dlatego zaleca się, jeśli to możliwe, grupowanie tkanek o podobnych cechach, np. tkanek bogatych w lipidy, w jednym bloku TMA. Większość tkanek nowotworowych jest w tym sensie jednorodna, co ułatwia skrawanie TMA z nowotworami. W przypadku pracy z TMA zawierającym heterogeniczne typy tkanek można zastosować alternatywną metodę skrawania w celu stabilizacji rdzeni mikroarray. Użycie taśmy klejącej może pomóc w zapobieganiu utracie rdzeni i ich wypadaniu z przekrojonego TMA. Z taśmy klejącej należy korzystać ostrożnie, ponieważ może ona wpływać na grubość skrawanych rdzeni, a w konsekwencji również na wynik barwienia IHC 15. W konfiguracji Human Protein Atlas stosowany jest szablon TMA o rozmiarze 9x8 rdzeni (wyłączając markery). Istotne jest uzyskanie maksymalnej liczby przekrojów i zachowanie reprezentatywności wszystkich tkanek w całym bloku. Aby zaoszczędzić odczynniki i czas skanowania, dwa przekroje umieszcza się na jednym szkiełku przedmiotowym, co umożliwia zastosowanie maksymalnego szablonu 9x8.

Główny repozytorium informacji o białkach, Universal Protein Resource 16, zawiera około 20 300 zweryfikowanych wpisów dotyczących ludzkich białek, z czego tylko około 66% posiada dowody na poziomie białka. Ponadto dla większości genów, dla których istnieją dowody na obecność na poziomie białka, informacje o funkcji białka i rozkładzie jego ekspresji są szczupłe lub nie istnieją. Ważnym wyzwaniem na przyszłość jest analiza wzorca rozkładu i względnej liczebności tych nieznanych białek w różnych typach ludzkich tkanek. Informacje z baz danych takich jak Uniprot, ENSEMBL oraz opublikowane dane z PubMed mogą służyć jako wskazówka do ustalenia, czy wzorce barwienia immunohistochemicznego z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko nieznanym białkom reprezentują rzeczywiste profile białkowe docelowego białka. Ponadto konieczne jest zastosowanie kilku innych strategii walidacji w celu zapewnienia funkcjonalności przeciwciał, na przykład oceny funkcjonalności przeciwciał w macierzach białkowych, w metodzie Western blot, immunofluorescencji, immunoprecypitacji oraz w eksperymentach pull-down. Być może najważniejszym narzędziem walidacji funkcjonalności przeciwciał jest zastosowanie przeciwciał sparowanych, tj. dwóch różnych przeciwciał wytworzonych przeciwko oddzielnym, niepokrywającym się epitopom tego samego białka docelowego, aby porównać wyniki specyficzne dla danego testu 17.

Na podstawie zebranych informacji przeciwciała są testowane i mianowane zgodnie ze standardami IHC oraz doświadczeniem zdobytym podczas testowania i walidacji ponad 35 000 przeciwciał w projekcie Human Protein Atlas. W przypadku ponad 20% wszystkich genów z profilami białkowymi wykorzystano dane z par przeciwciał (2 lub więcej przeciwciał skierowanych przeciwko niepokrywającym się epitopom tego samego białka), aby określić najlepszą szacunkową wartość wzorca ekspresji odpowiedniego białka. Pary przeciwciał stanowią doskonałą strategię walidacji specyficznych wzorców ekspresji białek opartych na immunohistochemii. Strategia ta jest cenna, ponieważ duża liczba różnych tkanek ujętych w podstawowym przesiewie zwiększa ryzyko reaktywności krzyżowej. Należy również zauważyć, że niektóre tkanki są ogólnie bardziej podatne na barwienie tła, np. makrofagi, mięśnie gładkie, cewki dystalne w nerkach i hepatocyty w wątrobie. Dodatkowe kwestie do rozważenia obejmują różnice w technikach przetwarzania tkanek na przestrzeni czasu w przypadku materiałów archiwalnych, co może prowadzić do fałszywie ujemnych lub niewłaściwych dodatnich wzorców barwienia IHC. Zjawisko to występuje również w analizie dużych przekrojów. Zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne są kluczowe i powinny być stosowane wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. W przypadku bardziej szczegółowych badań, w tym analiz funkcjonalnych, do stworzenia kontroli można wykorzystać linie komórkowe z wymuszoną ekspresją oraz specyficznym wyciszeniem odpowiednich transkrypcji (technologia siRNA). Aby uzyskać optymalne wyniki w IHC, ważne jest testowanie i stosowanie systemów odzyskiwania antygenu, ponieważ fiksacja formaliną indukuje różne modyfikacje chemiczne, np. sieciowanie, hydrolizę zasad Schiffa maskujących antygen 18.

Podsumowując, proteomika oparta na przeciwciałach z wykorzystaniem technologii TMA i IHC stanowi potężną strategię generowania danych o ekspresji białek na szeroką skalę. Projekt Human Protein Atlas został powołany w celu stworzenia mapy ekspresji białek ludzkich w prawidłowych tkankach oraz w nowotworach. Celem tego projektu jest przedstawienie pierwszej wersji kompleksowego atlasu białek ludzkich do 2015 roku. Oprócz dostarczenia profili białkowych w prawidłowych organach i tkankach, przedsięwzięcie to stanowi również punkt wyjścia dla projektów badawczych z zakresu biomedycyny, w tym dla wysiłków zmierzających do odkrycia klinicznych biomarkerów. Ostatecznym celem jest dodanie kolejnej warstwy informacji nad sekwencją ludzkiego genomu, co będzie miało kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia biologii leżącej u podstaw różnych stanów chorobowych oraz dostarczy podstaw do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantów fundacji Knut and Alice Wallenberg. Autorzy wyrażają wdzięczność całemu personelowi centrów Human Protein Atlas w Uppsali, Sztokholmie i Indiach za ich wysiłki włożone w stworzenie Human Protein Atlas. Autorzy pragną szczególnie podziękować Frankowi Hammarowi i Sofie Gustafsson za pomoc przy zdjęciach oraz Elené Karlberg za pomoc przy produkcji TMA podczas filmowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor do płukaniaThermo Fisher Scientific, Inc.TA-999-TT
Bufor cytrynianowy pH6Thermo Fisher Scientific, Inc.TA-250-Pm1X
Rozcieńczalnik do przeciwciałThermo Fisher Scientific, Inc.TA-125-UD
Polimer HRP UltraVision LPThermo Fisher Scientific, Inc.TL-125-HL
System substratu DAB plusThermo Fisher Scientific, Inc.TA-125-HDX
Ultra V BlockThermo Fisher Scientific, Inc.TA-125-UB
Wzmacniacz przeciwciał pierwszorzędowychThermo Fisher Scientific, Inc.TL-125-PB
Hematoksylina MayeraHistolab01820
PERTEXHistolab00871.0500
Ręczny przyrząd do tworzenia macierzy tkankowychEstigen, Beecher InstrumentMTA-1
Mikrotom kaskadowyThermo Fisher Scientific, Inc.Microm HM 355S
Automatyczny skaner obrazówAperio TechnologiesXT
Automatyczny system barwienia preparatówThermo Fisher Scientific, Inc.Autostainer 480S-2D
Automatyczny system barwienia preparatów do deparafinacji i odwadnianiaLeica MicrosystemsAutostainer XL
Automatyczna zaklejarka szkiełekLeica MicrosystemsCV5030
Komora do zdemaskowania antygenówBiocare MedicalDC2008INTEL

Bibliografia

  1. Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
  2. Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
  3. Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019(2008).
  4. Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920(2005).
  5. Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
  6. Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
  7. Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
  8. Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas - a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
  9. Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
  10. Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142(2007).
  11. Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564(2009).
  12. Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937(2011).
  13. Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1(2001).
  14. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24(2001).
  15. Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. , (2010).
  16. UniProt. Nucleic acids research. 39, D214(2011).
  17. Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248(2010).
  18. Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikromacierze tkankoweanaliza ekspresji białekmontaż rdzeni tkankowychcięcie sekcjicyfrowe skanowanie obrazówprofilowanie przeciwciałprzygotowanie bloków parafinowychwycinanie rdzeni
Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.