Metody badania morfogenezy neuronów: elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej mysiej korze mózgowej

Podsumowanie

Aby przeprowadzić szybką ocenę funkcji genów w rozwoju kory mózgowej, opisujemy metody polegające na elektroporacji ex vivo plazmidów koeksprymujących hamujące RNA (RNAi) i GFP w mysiej korze embrionalnej. Protokół ten jest podatny na badanie różnych aspektów rozwoju neurologicznego, takich jak neurogeneza, migracja neuronów i morfogeneza neuronów, w tym rozrost dendrytów i aksonów.

Streszczenie

Kora mózgowa kieruje wyższymi funkcjami poznawczymi. Ta sześciowarstwowa struktura jest generowana w sposób wewnętrzny, zewnętrzny-ostatni, w którym pierworodne neurony pozostają bliżej komory, podczas gdy ostatnie urodzone neurony migrują obok pierworodnych neuronów w kierunku powierzchni mózgu¹. Oprócz migracji neuronów², kluczowym procesem dla prawidłowego funkcjonowania kory mózgowej jest regulacja morfogenezy neuronów³. Podczas gdy morfogenezę neuronów można badać in vitro w kulturach pierwotnych, można się wiele nauczyć na temat tego, jak procesy te są regulowane w środowisku tkankowym.

Opisujemy techniki analizy migracji i/lub morfogenezy neuronów w organotypowych wycinkach kory mózgowej^4,6. Stosuje się zmodyfikowany wektor pSilencer, który zawiera zarówno promotor U6, który napędza dwuniciowy RNA spinki do włosów, jak i oddzielną kasetę ekspresyjną, która koduje białko GFP sterowane przez promotor CMV^7-9. Nasze podejście pozwala na szybką ocenę defektów w przeroscie neurytów po specyficznym wyłączeniu genów kandydujących i zostało z powodzeniem wykorzystane w badaniach przesiewowych regulatorów wzrostu neurytów⁸. Ponieważ tylko podzbiór komórek będzie wyrażał konstrukty RNAi, wycinki organotypowe pozwalają na mozaikową analizę potencjalnych fenotypów. Co więcej, ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w sposób zbliżony do środowiska in vivo, stanowi ona tanią i szybką alternatywę dla generowania zwierząt transgenicznych lub nokautujących genów o nieznanej funkcji kory mózgowej. Wreszcie, w porównaniu z technologią elektroporacji in vivo, powodzenie eksperymentów z elektroporacją ex vivo nie zależy od rozwoju biegłych umiejętności chirurgicznych i może być przeprowadzone przy krótszym czasie szkolenia i umiejętnościach.

Protokół

1. Przygotowanie rozwiązań kulturowych i mediów (nie w filmie)

1. Przygotuj 1 litr zbilansowanego roztworu soli Complete Hank's (HBSS) zawierającego 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH 7,4), 30 mM D-glukozy, 1 mM CaCl₂, 1 mM_MgSO4 i 4 mM_NaHCO3. Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH₂O). Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotuj pożywkę do hodowli plastrów, używając 35 ml pożywki Basal Medium Eagle, 12,9 ml Complete HBSS, 20 mM D-glukozy (1,35 ml 1 M roztworu), 1 mM Glutamax (0,25 ml 200 mM roztworu), 0,5 ml penicyliny-streptomycyny 100x bulion. Filtruj sterylizację za pomocą filtra 0,2 μm, a następnie dodaj inaktywowaną termicznie surowicę końską do końcowego stężenia 5%.
3. Przygotuj roztwór roboczy Lamininy, sporządzając 1 mg/ml roztworu podstawowego Lamininy ze sterylną destylowaną wodą dejonizowaną. Przygotować 100 μl podwielokrotności w 0,5 ml probówkach eppendorfa i zamrozić w temperaturze -80 °C.
4. Przygotować roztwór roboczy poli-L-lizyny, dodając 5 ml sterylnego_H2Odo 5 mg poli-L-lizyny, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przygotować 1 ml porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować roztwór powlekający, rozcieńczając 1 ml poli-L-lizyny i 100 μl lamininy do końcowej objętości 12 ml sterylną wodą. Spraw, aby to rozwiązanie było świeże za każdym razem.

2. Przygotowanie wkładek do plastrów organotypowych (nie w filmie)

1. Przygotuj dwie sześciodołkowe płytki z jedną wkładką hodowlaną na studzienkę za pomocą sterylnych kleszczy. Dodać 2 ml sterylnego ddH₂O pod wkładki hodowlane.
2. Dodać 1 ml roztworu powlekającego na wierzch membrany, uważając, aby nie przebić membrany. Inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Usunąć podłoże powlekające i trzykrotnie umyć membranę sterylnym H₂0. Pozostaw wkładki do wyschnięcia przed użyciem. Dodać 1,8 ml pożywki do hodowli warstw i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Niewykorzystane płytki owinąć folią Parafilm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.

3. Przygotowanie do elektroporacji (nie w filmie)

1. Przygotuj konstrukty RNAi do elektroporacji. Dwuniciowe wstawki spinki do włosów RNA sklonowano do wektora pSilencer. Plazmid zawiera: 1) promotor U6, który napędza wytwarzanie dwuniciowego RNA; oraz 2) kaseta z ekspresją GFP napędzana promotorem CMV^8,9. Plazmid ten został wcześniej opisany przez Konishi i współpracowników⁹ oraz innych^7,8. Plazmidy są oczyszczane za pomocą zestawu Qiagen maxi-prep i stosowane w stężeniu 1 mg/ml.
2. Aby uwidocznić DNA podczas wstrzykiwania, należy przygotować 0,5% roztwór szybkiego zielonego barwnika i użyć go w stosunku 1:20 z DNA, które ma zostać wstrzyknięte (zwykle 20 μl DNA z 1 μl szybkiego zielonego barwnika). Pozostałą mieszaninę zielonego barwnika trwałego DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
3. Oczyść obszar sekcji, narzędzia preparacyjne i naczynie wibratome 70% etanolem. Schłodź cały HBSS, aby był lodowaty. Schłodzić naczynie wibratomowe, pakując wokół niego lód wewnątrz wibratomu z odrobiną wody w celu szybkiego schłodzenia. Przygotować 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia, używając kompletnego HBSS. Kuchenka mikrofalowa przez 1 min. Unikaj przegotowania. Przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C do czasu użycia.
4. Parametry elektroporacji ustawia się w następujący sposób. W przypadku zarodka E15 należy użyć 35 V, 5 impulsów, długość 100 ms, odstęp między impulsami 900 ms. W przypadku starszych zwierząt, aby zapewnić elektroporację, należy użyć wyższego napięcia do 50 V lub zwiększyć liczbę impulsów do 8 impulsów. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanki u młodszych zwierząt, należy stosować mniej impulsów lub do 2 impulsów i niższe napięcie do 25 V. Parametry te mogą być zróżnicowane i określane empirycznie w zależności od wieku zwierzęcia.

4. Preparacja i elektroporacja (w filmie)

1. Po eutanazji ciężarnej samicy należy przeprowadzić sekcję zarodków na lodowato zimny, kompletny HBSS. Trzymaj każdy zarodek w jego indywidualnych workach łożyskowych.
2. Wypreparuj zarodek i odetnij głowę po pierwszym kręgu. Przechowywać w lodowatym chłodzie, kompletnym HBSS.
3. Do wstrzyknięcia należy umieścić głowę na kawałku Parafilmu na szalce Petriego. Za pomocą specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona (patrz Tabela I) wstrzyknąć około 6 do 8 μl DNA: szybkiej zielonej mieszanki barwnika przez trzecią komorę w celu wypełnienia obu bocznych komór w pęcherzykach korowych. Alternatywnie, wstrzyknięcie można wykonać bezpośrednio do każdej komory bocznej.
4. Do elektroporacji ex vivo należy użyć pęsety platynowej BTX. Umieść elektrodę dodatnią w kierunku strony kory, którą chcesz naelektryzować, tj. czubka głowy w przypadku kory grzbietowej.
5. Po elektroporacji inkubuj głowy na lodzie przez co najmniej 5 minut przed preparacją.
6. Wypreparuj mózgi w lodowatym HBSS, wykonując małe nacięcie z boku głowy i złuszczając skórę z boków głowy. Następnie za pomocą cienkich kleszczy delikatnie oderwij pia od mózgu. Usuń nienaruszony mózg z czaszki, uważając, aby nie uszkodzić kory.

5. Osadzanie i cięcie elektroporowanych kory mózgowych (w filmie)

1. Przenieś 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do dużej formy umieszczonej na lodzie. Dno formy zacznie szybciej krzepnąć, co zapobiegnie opadaniu mózgów na dno formy. Delikatnie przenieś mózgi cienkimi kleszczami jeden po drugim po usunięciu nadmiaru buforu za pomocą Kimwipe lub bibuły filtracyjnej. Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl, aby zawirować mózgi wewnątrz formy, aby zapewnić maksymalny interfejs między agarozą a tkanką mózgową.
2. Zorientuj mózgi tak, aby upewnić się, że wszystkie mózgi są w tej samej orientacji i mniej więcej na tym samym poziomie w agarozie. Pozwól agarozie zastygnąć przez około 5 minut. Użyj kleju wiążącego (szalonego kleju), aby przymocować bloki agarozy tak, aby opuszki węchowe stały. Po przymocowaniu klocków natychmiast dodaj lodowaty HBSS i przytnij agarozę, aby upewnić się, że dla każdego mózgu uzyskano indywidualne plasterki.
3. Aby pokroić bloki, ustaw prędkość wibratomu na niską prędkość (około połowy maksymalnej) i ustaw częstotliwość wibracji ostrza na najwyższe ustawienie. Generuj plastry koronalne o grubości 250 μm. Wyjmij plasterki za pomocą wygiętej cienkiej szpatułki i przenieś je do dołków na tkanki za pomocą cienkiej szczoteczki lub kleszczy.
4. W kapturze do hodowli tkankowej przenieś plastry do powlekanych wkładek. Dodaj 500 μl pożywki do hodowli warstw do każdej wkładki, aby ułatwić przenoszenie. W jednej wkładce można umieścić do 5 plastrów. Usunąć nadmiar pożywki z wierzchu plastrów i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.

6. Hodowla i analiza plastrów organotypowych (w filmie)

1. Aby zachować zdrowe plastry, świeże podłoże należy dodawać co najmniej co drugi dzień pod membranę, za każdym razem wymieniając połowę podłoża.
2. Aby przeanalizować plastry po pożądanych dniach w hodowli, przymocuj plastry w membranie. Przemyć 1x buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze 37 °C trzy razy przez 10 minut za każdym razem. Następnie utrwal 4% paraformaldehydem (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Plastry mogą być analizowane za pomocą różnych markerów komórkowych lub barwione samym Hoechstem w celu wizualizacji komórek elektroporowanych i nieelektroporowanych. Przepuszczalne i blokowane plastry przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 10% kozim surowicą, 0,1% trytonem w 1x PBS z delikatnym wstrząsaniem.
4. Plamić Hoechstem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, prać 3 razy 1x PBS 10 min za każdym razem delikatnie wstrząsając.
5. Aby zamontować plastry, przetnij membranę skalpelem i za pomocą cienkich kleszczyków przenieś membranę zawierającą plastry na szkiełka z matowego szkła w komorze wodnej. Na jednym szkiełku można umieścić do 5 plastrów. Usuń nadmiar wody i dodaj kroplę roztworu Flourmount do każdego plasterka mózgu. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na plasterkach mózgu i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Analizuj plastry za pomocą mikroskopu konfokalnego.

7. Alternatywne zatapianie plastrów organotypowych w parafinie (nie w filmie)

1. Plastry organotypowe mogą być również zatopione w parafinie w celu dokładniejszej analizy morfologicznej, w tym celu błonę zawierającą plastry organotypowe można utrwalić w 4% PFA, jak opisano powyżej.
2. Utrwalone plastry są zatapiane w 1% agarozie (wstępnie podgrzanej do 37 °C) i krzepnięte w lodzie przez 30 minut. Bloki agarozy można następnie utrwalić w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
3. Blok agarozy zawierający wycinek organotypowy zostanie następnie zanurzony w parafinie i przetworzony pod kątem immunofluorescencji, jak opisano wcześniej¹⁰.

8. Reprezentatywne wyniki

Schematyczne przedstawienie elektroporacji kory myszy i hodowli wycinków organotypowych jest pokazane na rysunku 1. Metoda ta jest przydatną strategią do szybkiej oceny funkcji genów zaangażowanych w rozwój neuronów¹¹. W zależności od ilości elektroporowanego DNA i stadium embrionalnego podczas elektroporacji, wydajność transfekcji będzie się różnić. Plastry zaczną wyrażać GFP co najmniej 8 godzin po elektroporacji, a komórki przejdą normalną sekwencję zdarzeń neurogennych (proliferacja, migracja i wczesne różnicowanie neuronów) w hodowli. Rycina 2 przedstawia elektroporowany wycinek mózgu, który wyraża kontrolny wektor pSilencer-GFP i można zaobserwować neuronalne komórki progenitorowe, migrujące neurony i zróżnicowane neurony w wycinku. Plastry organotypowe zachowają swoją morfologię, o ile będą utrzymywane w dobrym interfejsie pożywka-powietrze na błonach i mogą być używane do co najmniej 5 dni w hodowli.

Rysunek 1. Ilustracja elektroporacji ex vivo i organotypowego testu hodowli plastrów. Zarodki E14.5 są wycinane i indywidualnie wstrzykiwane z DNA zmieszanym z szybkim zielonym barwnikiem w celu uwidocznienia miejsca wstrzyknięcia. DNA można wstrzyknąć zarówno do komór bocznych, jak pokazano na ilustracji, lub do trzeciej komory w celu wypełnienia komór bocznych. Po wstrzyknięciu mózgi są elektroporowane za pomocą elektroporatora o fali prostokątnej, umieszczając elektrodę dodatnią po pożądanej stronie mózgu. Mózgi są osadzone w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i podzielone na sekcje za pomocą wibratomu. Wycinki mózgu o wielkości 250 μm umieszcza się na wkładkach 0,4 μm i hoduje przez okres do tygodnia. GFP można zaobserwować po 8 godzinach od transfekcji.

Rysunek 2. Analiza elektroporowanych wycinków mózgu. Elektroporowane wycinki mózgu zostały wybarwione dla Hoeschta. W korze grzbietowej widoczne są elektroporowane neuronalne komórki progenitorowe w strefie komorowej (vz). Neurony w płytce korowej (cp) są ograniczone przez strefę brzeżną (mz). Białe strzałki pokazują migrujące neurony. W tym przypadku mózgom wstrzyknięto E15,5 i elektroporowano wektorem kontrolnym pSilencer GFP. Skrawki reprezentują eksplantaty korowe 4 dni po elektroporacji. Podziałka 100 μm.

Rozwiązywanie problemów:

1. Niska wydajność transfekcji: Dostosuj stężenie użytego DNA do co najmniej 1 μg/μl. Zawsze używaj bardzo czystego DNA z maxi prep, jeśli to konieczne, użyj zestawu Quiagen bez endo, aby oczyścić DNA.
2. Komórki transfekowane w innym obszarze mózgu niż pożądany: Upewnij się, że elektrody są prawidłowo ustawione, a elektroda dodatnia jest skierowana w stronę mózgu, która ma być elektroporowana.
3. Plastry organotypowe tracą morfologię: Zmieniaj pożywkę codziennie i upewnij się, że plasterki nie unoszą się w podłożu
4. Plastry schodzą z agarozy podczas krojenia w wibratomie: Upewnij się, że podczas osadzania mózgów w agarozie o niskiej temperaturze topnienia powstaje dobry interfejs.

Dyskusja

Te metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów kodujących spinki do włosów z dwuniciowym ^RNA8 i hodowlę wycinków organotypowych4 mają kilka wyraźnych zalet. Po pierwsze, metody te pozwalają na szybką ocenę fenotypów pochodzących z RNAi. Włączenie kasety ekspresyjnej kodującej GFP do tego samego wektora pSilencer, który zawiera promotor U6, który napędza dwuniciową spinkę do włosów RNA, pozwala na szybką identyfikację i charakterystykę komórek elektroporowanych wektorem RNAi. Oprócz o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka Hamilton	Co	80008	31 gauge, 0,5 cala długości, PT-4 (poziom ukosowania punktowego), 10μ l objętość
Platynowa pęseta	BTX Technologies	45-0489	Rozmiar 5mm
Elektroporator ECM830	BTX Technologies	45-0002
Przełącznik nożny BTX	Technologies	45-0208	Do użytku z elektroporatorem ECM830
Mikrotom z ostrzem wibracyjnym	Leica Microsystems	VT1000 S
6-dołkowa miska do użytku z wkładkami	Falcon BD	353502	Zawiera nacięcia pasujące do wkładek
Wkładki do hodowli tkankowych	Falcon BD	353090	0,4 mikrometra
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252
Agaroza niskotopliwa	Fisher Scientific	BP165-25	Klasa DNA
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P5899
Basal Medium Eagle	Sigma-Aldrich	B-1522
HBSS 10x bez Ca i Mg	GIBCO, firmy Life Technologies	14180-046
Kwas wolny od HEPES	Sigma-Aldrich	H4034