Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Podsumowanie

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Streszczenie

Kora mózgu steruje wyższymi funkcjami poznawczymi. Ta sześciowarstwowa struktura powstaje w sposób „od wewnątrz do zewnątrz”, w którym neurony powstałe jako pierwsze pozostają bliżej komory, natomiast neurony powstałe później migrują obok nich w kierunku powierzchni mózgu¹. Oprócz migracji neuronalnej², kluczowym procesem dla prawidłowego funkcjonowania kory jest regulacja morfogenezy neuronalnej³. Chociaż morfogenezę neuronalną można badać in vitro w kulturach pierwotnych, wiele można dowiedzieć się z tego, jak procesy te są regulowane w środowisku tkankowym.

Opisujemy techniki analizy migracji neuronalnej i/lub morfogenezy w organotypowych skrawkach kory mózgowej^4,6. Wykorzystany zostaje zmodyfikowany wektor pSilencer, który zawiera zarówno promotor U6 sterujący dwuniciowym RNA w formie spinki (hairpin RNA), jak i oddzielną kasetę ekspresyjną kodującą białko GFP pod kontrolą promotora CMV^7-9. Nasze podejście pozwala na szybką ocenę defektów wzrostu neurytów po specyficznym wyciszeniu genów kandydackich i zostało z powodzeniem zastosowane w screeningu regulatorów wzrostu neurytów⁸. Ponieważ tylko część komórek będzie ekspresować konstrukty RNAi, skrawki organotypowe umożliwiają analizę mozaikową potencjalnych fenotypów. Co więcej, ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w środowisku zbliżonym do warunków in vivo, stanowi ona niskokosztową i szybką alternatywę dla generowania zwierząt transgenicznych lub knockoutowych w przypadku genów o nieznanej funkcji korowej. Wreszcie, w porównaniu z technologią elektroporacji in vivo, sukces eksperymentów z elektroporacją ex vivo nie zależy od wysokiego stopnia rozwoju umiejętności chirurgicznych i może być przeprowadzony przy krótszym czasie szkolenia i mniejszym zaawansowaniu technicznym.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów hodowlanych i pożywek (brak w wideo)

1. Przygotować 1 litr kompletnego zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH7,4), 30 mM D-glukozy, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄ oraz 4 mM NaHCO₃. Dopełnić wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O). Sterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2-μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować pożywkę do hodowli skrawków, używając 35 mL pożywki Basal Medium Eagle, 12,9 mL kompletnego HBSS, 20 mM D-glukozy (1,35 mL roztworu 1 M), 1 mM Glutamax (0,25 mL roztworu 200 mM) oraz 0,5 ml stoku penicyliny-streptomycyny 100x. Sterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2-μm, a następnie dodać inaktywowaną ciepłem surowicę konia do stężenia końcowego 5%.
3. Przygotować roztwór roboczy lamininy, sporządzając stoki lamininy o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej destylowanej wodzie dejonizowanej. Przygotować alikwoty po 100 μL w probówkach eppendorfowskich 0,5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C.
4. Przygotować roztwór roboczy poli-L-lizyny, dodając 5 mL sterylnej H₂O do 5 mg poli-L-lizyny, aby uzyskać roztwór stokowy o stężeniu 1 mg/mL. Przygotować alikwoty po 1 mL i zamrozić w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować roztwór do powlekania, rozcieńczając 1 mL poli-L-lizyny i 100 μL lamininy do końcowej objętości 12 mL sterylną wodą. Roztwór ten należy przygotowywać świeżo przed każdym użyciem.

2. Przygotowanie wkładów z plastrów organotypowych (brak w materiale wideo)

1. Przygotować dwie płytki 6-dołkowe, umieszczając w każdej dołku jeden wkład kulturacyjny za pomocą sterylnej pęsety. Pod wkłady kulturacyjne dodać 2 mL sterylnej ddH₂O.
2. Na powierzchnię membrany nanieść 1 mL roztworu powlekającego, uważając, aby nie przebić membrany. Inkubować przez noc w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.
3. Usunąć medium powlekające i trzykrotnie przemyć membranę sterylną H₂0. Pozostawić wkłady do wyschnięcia przed użyciem. Dodać 1,8 mL pożywki do hodowli skrawków i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nieużywane płytki owinąć Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 4 tygodnie.

3. Przygotowanie do elektroporacji (brak w filmie)

1. Przygotować konstrukty RNAi do elektroporacji. Dwuniciowe wstawki RNA w formie spinki (hairpin) sklonowano do wektora pSilencer. Plazmid zawiera: 1) promotor U6 sterujący generowaniem dwuniciowego RNA oraz 2) kasetę ekspresyjną GFP sterowaną przez promotor CMV^8,9. Plazmid ten został wcześniej opisany przez Konishiego i współpracowników⁹ oraz innych autorów^7,8. Plazmidy oczyszcza się za pomocą zestawu Qiagen maxi-prep i stosuje w stężeniu 1 mg/mL.
2. W celu wizualizacji DNA podczas wstrzykiwania, przygotować 0,5% roztwór barwnika fast green i stosować go w proporcji 1:20 w stosunku do wstrzykiwanego DNA (zazwyczaj 20 μL DNA i 1 μL fast green). Pozostałą mieszaninę DNA z barwnikiem fast green można przechowywać w temperaturze -20 °C do tygodnia.
3. Oczyścić obszar sekcji, narzędzia sekcyjne oraz naczynie wibrotomu 70% etanolem. Schłodzić kompletny HBSS do temperatury lodowej. Schłodzić naczynie wibrotomu, obkładając je lodem wewnątrz wibrotomu z dodatkiem niewielkiej ilości wody w celu szybkiego chłodzenia. Przygotować 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia, wykorzystując kompletny HBSS. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 1 min. Unikać zagotowania. Przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C do momentu użycia.
4. Parametry elektroporacji ustawić w następujący sposób. Dla zarodka E15 zastosować 35 V, 5 impulsów, czas trwania 100 ms, odstęp między impulsami 900 ms. W przypadku starszych zwierząt, aby zapewnić skuteczność elektroporacji, należy zastosować wyższe napięcie do 50 V lub zwiększyć liczbę impulsów do 8. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanki u młodszych zwierząt, należy zastosować mniejszą liczbę impulsów (do 2 impulsów) oraz niższe napięcie do 25 V. Parametry te mogą być modyfikowane i ustalane empirycznie w zależności od wieku zwierzęcia.

4. Disekcja i elektroporacja (w materiale wideo)

1. Po uśmierceniu ciężarnej samicy, wypreparuj zarodki do lodowatego, kompletnego roztworu HBSS. Pozostaw każdy zarodek w jego indywidualnym worku łożyskowym.
2. Wyjmij zarodek i odetnij głowę za pierwszym kręgiem. Przechowuj w lodowatym, kompletnym roztworze HBSS.
3. Do wstrzykiwania umieść głowę na kawałku Parafilmu na płytce Petriego. Używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona (patrz Tabela I), wstrzyknij około 6 do 8 μL mieszaniny DNA i barwnika fast green przez trzecią komorę, aby wypełnić obie komory boczne w pęcherzykach korowych. Alternatywnie wstrzykiwanie można przeprowadzić bezpośrednio do każdej z komór bocznych.
4. Do elektroporacji ex vivo użyj platynowych elektrod BTX-tweezer. Umieść elektrodę dodatnią po stronie kory, którą chcesz poddać elektroporacji, np. na szczycie głowy dla kory grzbietowej.
5. Po elektroporacji inkubuj głowy na lodzie przez co najmniej 5 min przed preparowaniem.
6. Wypreparuj mózgi w lodowatym HBSS, wykonując niewielkie nacięcie po bokach głowy i zdejmując skórę z boków głowy. Następnie, za pomocą precyzyjnych pęset, delikatnie oddziel oponę miękką od mózgu. Usuń nienaruszony mózg z czaszki, dbając o to, aby nie uszkodzić kory.

5. Zatapianie i krojenie elektroporowanych kory mózgowych (w wideo)

1. Przenieś 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia do dużej formy umieszczonej na lodzie. Dno formy zacznie zestalać się szybciej, co zapobiegnie opadaniu mózgów na dno. Delikatnie przenieś mózgi jeden po drugim za pomocą precyzyjnej pęsety, po uprzednim usunięciu nadmiaru buforu za pomocą chusteczki Kimwipe lub papieru filtracyjnego. Użyj końcówki do pipety 10 μL, aby zakręcić mózgami wewnątrz formy, zapewniając maksymalny kontakt między agarozą a tkanką mózgową.
2. Ustaw mózgi tak, aby wszystkie znajdowały się w tej samej orientacji i na zbliżonym poziomie w agarozie. Pozostaw agarozę do zastygnięcia na około 5 min. Użyj kleju błyskawicznego, aby przymocować bloki agarozy tak, by opary węchowe były skierowane do góry. Po przymocowaniu bloków natychmiast dodaj lodowaty HBSS i przytnij agarozę, aby zapewnić uzyskanie pojedynczych przekrojów dla każdego mózgu.
3. Aby wykonać cięcia bloków, ustaw prędkość wibratomu na niską (około połowy maksymalnej), a częstotliwość wibracji ostrza na najwyższą. Wykonaj przekroje koronalne o grubości 250 μm. Pobierz przekroje za pomocą wygiętej precyzyjnej szpatułki i przenieś je do dołków z tkanką za pomocą precyzyjnego pędzla lub pęsety.
4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś przekroje do powlekanych insertów. Do każdego insertu dodaj 500 μL pożywki do hodowli przekrojów, aby ułatwić transfer. W jednym insercie można umieścić do 5 przekrojów. Usuń nadmiar pożywki z powierzchni przekrojów i inkubuj w 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.

6. Hodowla i analiza skrawków organotypowych (w wideo)

1. Aby utrzymać plastry w dobrym stanie, należy co najmniej co drugi dzień dodawać świeże medium pod membranę, wymieniając przy tym połowę medium.
2. W celu analizy plastrów po pożąganej liczbie dni hodowli, należy je utrwalić w membranie. Przemyć trzy razy buforem fosforanowym (PBS) 1x w temperaturze 37 °C, po 10 min każde płukanie. Następnie utrwalić w 4% Paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 h w temperaturze pokojowej.
3. Plastry można analizować z użyciem różnych markerów komórkowych lub barwić samym Hoechstem w celu wizualizacji komórek elektroporowanych i nieelektroporowanych. Przeprowadzić permeabilizację i blokowanie plastrów przez 2 h w temperaturze pokojowej w 10% surowicy koziej i 0,1% tritonu w PBS 1x przy delikatnym wstrząsaniu.
4. Barwić Hoechstem przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy w PBS 1x przez 10 min każde płukanie przy delikatnym wstrząsaniu.
5. Aby zamontować plastry, należy wyciąć membranę skalpelem, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść membranę z plastrami na matowe szkiełko obiektowe w komorze z wodą. Na jednym szkiełku można umieścić do 5 plastrów. Usunąć nadmiar wody i dodać kroplę roztworu Flourmount na każdy plaster mózgu. Delikatnie położyć szkiełko nakrywkę na plastrach mózgu i usunąć pęcherzyki powietrza. Przeanalizować plastry za pomocą mikroskopu konfokalnego.

7. Alternatywne zatapianie w parafinie skrawków organotypowych (brak w materiale wideo)

1. Przekroje organotypowe można również zalać parafiną w celu przeprowadzenia dokładniejszej analizy morfologicznej; w tym celu membranę zawierającą przekroje organotypowe można utrwalić w 4% PFA, zgodnie z powyższym opisem.
2. Utrwalone przekroje zalewa się 1% agaroza (wstępnie podgrzaną do 37 °C) i zestyla w lodzie przez 30 min. Następnie bloki agarozy można poddać potrwalaniu w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 30 min.
3. Blok agarozy zawierający przekrój organotypowy zostanie następnie zalany parafiną i poddany procedurze immunofluorescencji zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰.

8. Reprezentatywne wyniki

Schematyczne przedstawienie elektroporacji kory mysiej oraz hodowli plastrów organotypowych pokazano na Rysunku 1. Metoda ta stanowi przydatną strategię do szybkiej oceny funkcji genów zaangażowanych w rozwój neuronalny¹¹. Efektywność transfekcji będzie zależeć od ilości elektroporowanego DNA oraz stadium embrionalnego w momencie przeprowadzania procedury. Plastry zaczną wykazywać ekspresję GFP co najmniej 8 godzin po elektroporacji, a komórki przejdą normalną sekwencję zdarzeń neurogennych (proliferację, migrację i wczesne różnicowanie neuronalne) w hodowli. Rysunek 2 przedstawia elektroporowany plaster mózgu wykazujący ekspresję kontrolnego wektora pSilencer-GFP, w którym można zaobserwować progenitorów neuronalnych, migrujące neurony oraz neurony zróżnicowane. Plastry organotypowe zachowują swoją morfologię tak długo, jak są utrzymywane w prawidłowym interfejsie medium-powietrze na membranach, i mogą być wykorzystywane w hodowli przez co najmniej 5 dni.

Rysunek 1. Ilustracja elektroporacji ex vivo oraz testu hodowli organotypowych skrawków. Embriony E14.5 są wyjmowane, a następnie poszczególne z nich są wstrzykiwane DNA zmieszanym z barwnikiem fast green w celu wizualizacji miejsca wstrzyknięcia. DNA można wstrzykiwać zarówno do komór bocznych, jak przedstawiono na ilustracji, jak i do komory trzeciej w celu wypełnienia komór bocznych. Po wstrzyknięciu mózgi są poddawane elektroporacji za pomocą elektroporatora z falą prostokątną, przy czym elektrodę dodatnią umieszcza się po pożądanej stronie mózgu. Mózgi są zatapiane w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i cięte za pomocą wibratomu. Skrawki mózgu o grubości 250 μm są umieszczane na insertach 0,4 μm i hodowane do tygodnia. GFP można zaobserwować 8 godzin po transfekcji.

Rycina 2. Analiza elektroporowanych skrawków mózgu. Elektroporowane skrawki mózgu barwiono barwnikiem Hoechst. W korze grzbietowej widoczne są elektroporowane progenitory neuronalne w strefie komorowej (vz). Neurony w płytce korowej (cp) są ograniczone strefą marginalną (mz). Białe strzałki wskazują migrujące neurony. W tym przypadku iniekcje do mózgów wykonano w dniu E15.5, a następnie przeprowadzono elektroporację z użyciem wektora kontrolnego pSilencer GFP. Przekroje przedstawiają eksplantaty korowe 4 dni po elektroporacji. Pasek skali 100 μm.

Rozwiązywanie problemów:

1. Niska wydajność transfekcji: Dostosuj stężenie użytego DNA do poziomu co najmniej 1 μg/μL. Zawsze używaj bardzo czystego DNA z preparacji maxi; w razie potrzeby zastosuj zestaw Quiagen endo-free do oczyszczania DNA.
2. Komórki przetransfekowane w innym obszarze mózgu niż zamierzony: Upewnij się, że elektrody są ustawione prawidłowo, z elektrodą dodatnią skierowaną w stronę strony mózgu, która ma zostać poddana elektroporacji.
3. Prążki organotypowe tracą morfologię: Wymieniaj pożywkę codziennie i upewnij się, że prążki nie pływają w pożywce.
4. Prążki odklejają się od agarozy podczas cięcia w wibratomie: Upewnij się, że podczas zatapiania mózgów w agarozie o niskiej temperaturze topnienia uzyskano dobrą powierzchnię styku.

Dyskusja

Metody te, obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów kodujących dwuniciowe RNA w formie spinek (hairpins)⁸ oraz hodowlę skrawków organotypowych⁴, zapewniają kilka istotnych zalet. Po pierwsze, metody te pozwalają na szybką ocenę fenotypów pochodnych RNAi. Włączenie kasety ekspresyjnej kodującej GFP do tego samego wektora pSilencer, który zawiera promotor U6 sterujący dwuniciową spinką RNA, umożliwia szybką identyfikację i charakterystykę komórek poddanych elektroporacji wektorem RNAi. Opr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka Hamiltona	Hamilton Co	80008	rozmiar igły 31 G, długość 0,5 cala, PT-4 (stopień ścięcia końcówki), objętość 10μl
Platynowe elektrody pęsetowe	BTX Technologies	45-0489	rozmiar 5 mm
Elektroporator ECM830	BTX Technologies	45-0002
Wyzwalacz nożny BTX	BTX Technologies	45-0208	Do użytku z elektroporatorem ECM830
Mikrotom z wibrującym ostrzem	Leica Microsystems	VT1000 S
Płytka 6-dołkowa do stosowania z wkładkami	Falcon BD	353502	Zawiera wycięcia dopasowane do wkładek
Wkładki do hodowli tkankowych	Falcon BD	353090	0,4 mikrometra
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252
Agaroza niskotopliwa	Fisher Scientific	BP165-25	klasa DNA
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P5899
Podstawowa pożywka Eagle	Sigma-Aldrich	B-1522
HBSS 10x bez Ca i Mg	GIBCO, by Life Technologies	14180-046
Kwas HEPES (bez HEPES)	Sigma-Aldrich	H4034