Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3622

⸱

7 lutego 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Streszczenie

Zarodki ptaków stanowią wyjątkową platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców dzięki łatwemu dostępowi do zarodków wewnątrz jaja. Chimerowe zarodki ptaków, w których tkanka dawcy z przepiórki jest przeszczepiana do zarodka kurczaka in ovo, łączą zalety trwałego znakowania genetycznego populacji komórek z łatwością manipulacji, jaką oferuje zarodek ptaka.

Chimery przepiór-kurczak są klasycznym narzędziem do śledzenia migrujących komórek grzebienia neuronalnego (NCCs)1-3. NCCs stanowią przejściową migrującą populację komórek w embrionie, które pochodzą z grzbietowej części rozwijającej się rurki neuralnej4. Przechodzą one przejście nabłonkowo-mezenchymalne, a następnie migrują do innych obszarów embrionu, gdzie różnicują się w różne typy komórek, w tym chrząstkę5-13, melanocyty11,14-20, neurony i glej21-32. NCCs są multipotencjalne, a ich ostateczny los zależy od: 1) regionu rurki neuralnej, z którego pochodzą wzdłuż osi rostralno-kaudalnej embrionu11,33-37, 2) sygnałów z sąsiednich komórek podczas migracji38-44 oraz 3) mikrośrodowiska w ich ostatecznym miejscu przeznaczenia w obrębie embrionu45,46. Śledzenie tych komórek od miejsca ich powstania w rurce neuralnej do końcowej pozycji i losu w embrionie dostarcza ważnych informacji na temat procesów rozwojowych regulujących wzorcowanie i organogenezę.

Przeszczepianie komplementarnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy homotopowe) lub różnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy heterotopowe) może ujawnić różnice w przedspecyfikacji NCC wzdłuż osi rostro-kaudalnej2,47. Technikę tę można dodatkowo dostosować do przeszczepienia jednostronnego przedziału rurki neuralnej w taki sposób, aby jedna strona pochodziła z tkanki dawcy, a strona przeciwległa w embrionie biorcy pozostała nienaruszona, co zapewnia kontrolę wewnętrzną w obrębie tej samej próbki2,47. Może ona zostać również zaadaptowana do przeszczepiania segmentów mózgu w późniejszych stadiach embrionalnych, po etapie HH10, gdy przednia część rurki neuralnej uległa zamknięciu47.

W niniejszej pracy przedstawiamy techniki generowania chimer przepiórczo-kurzych poprzez transplantację rurki neuralnej, które umożliwiają śledzenie migrujących NCC pochodzących z określonego segmentu rurki neuralnej. Gatunkowo swoiste znakowanie komórek pochodzących od dawcy za pomocą przeciwciała QCPN specyficznego dla przepiórki48-56 pozwala badaczowi odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy w końcowym punkcie eksperymentu. Technika ta jest prosta, niedroga i ma wiele zastosowań, w tym mapowanie losów komórek, śledzenie linii komórkowych oraz identyfikację zdarzeń pre-patterningu wzdłuż osi rostro-kaudalnej45. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka ptasiego, technika przeszczepu przepiórczo-kurzego może być łączona z innymi manipulacjami, w tym między innymi z ablacją soczewki40, wstrzykiwaniem cząsteczek inhibicyjnych57,58 lub manipulacjami genetycznymi poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych59-61, aby zidentyfikować odpowiedź konkretnych strumieni migrujących NCC na zaburzenia w programie rozwojowym zarodka. Ponadto technika ta może być również wykorzystywana do generowania innych międzygatunkowych zarodków chimerycznych, takich jak chimery przepiórczo-kaczcze, w celu zbadania udziału NCC w morfogenezie kraniofacjalnej, lub chimery mysio-kurze, aby połączyć możliwości genetyki myszy z łatwością manipulacji zarodkiem ptasim.62

Protokół

1. Inkubacja jaj kurzych i przepiórczych do pożądanego stadium

W przypadku embrionów w stadium HH9 typowy czas inkubacji wynosi od 29 do 33 godzin w temperaturze 38 °C.63

  1. Opłucz jaja z wszelkich zanieczyszczeń letnią wodą.
  2. Ułóż jaja kurzych poziomo na tacy. Zaznacz ołówkiem stronę skierowaną do góry; będzie ona odpowiadać obszarowi, w którym zlokalizowany będzie embrion. Inkubuj jaja przepiórcze tępym końcem do góry.
  3. Umieść jaja w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 38 °C. Włącz funkcję kołysania.

2. Przygotowanie jaj do wycinania okna i sekcji

  1. Wyjmij jaja z inkubatora i wysterylizuj ich górne części 70% etanolem. Najlepiej rozpylić etanol i szybko wytrzeć go ręcznikiem papierowym lub chusteczką Kimwipe, aby zapobiec wchłanianiu etanolu przez skorupkę jaja.
  2. Umieść jajo kurze w indywidualnym uchwycie (stosujemy szalkę Petriego wyłożoną złożonymi ręcznikami papierowymi, np. „Kimwipes”). Używając pęsety AA, wykonaj mały otwór w górnej powierzchni skorupki jaja na jego ostrym końcu.
  3. Odsącz 1,5-3 mL rzadkiego albuminy z jaja kurzego za pomocą igły hipodermicznej 18½ G i strzykawki 5 mL. Najlepiej wprowadzić igłę pionowo do otworu, tak aby ścięcie było skierowane w stronę ostrego końca jaja (Rysunek 2A). W ten sposób podczas odsysania albuminy istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego uszkodzenia żółtka przez ssanie. Wylej albuminę. Ten krok obniży poziom żółtka i zarodka wewnątrz jaja, umożliwiając otwarcie okna w skorupce.
  4. Przetrzyj otwór 70% etanolem, jak opisano powyżej, i zabezpiecz go taśmą klejącą. Ważne jest, aby skorupka wokół otworu była całkowicie wolna od albuminy i sucha, w przeciwnym razie klej nie przylgnie.
  5. Za pomocą pęsety AA wykonaj kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni poziomo ułożonego jaja, nie całkiem na szczycie. Należy uważać, aby pęseta nie weszła zbyt głęboko w skorupkę, aby uniknąć uszkodzenia żółtka lub zarodka.
  6. Wprowadź jedną stronę zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do skorupki jaja. Ściśniętej skorupkę, wykonując ruchy koliste, aby wyciąć okno o średnicy ok. 2 cm w skorupce jaja kurzego. Usuń fragment skorupki. Alternatywnie można pokryć górną powierzchnię jaja taśmą pakową i wyciąć okno nożyczkami. Minimalizuje to ryzyko wpadnięcia odłamków skorupki do wnętrza jaja. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty dysk na szczycie żółtka. Odrzuć jaja niezapłodnione (rozpoznawalne po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy).
  7. Wstrzyknij niewielką ilość tuszu indyjskiego (rozcieńczonego 1:10 w sterylnym roztworze Ringera zawierającym antybiotyk „Pen/Strep”: końcowe stężenie 100 μg/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny) pod blastodermę, aby ułatwić określenie stadium rozwoju zarodka. Użyj strzykawki 1 mL i igły hipodermicznej 26½ G, zgiętej pod kątem 45° u podstawy, ze ścięciem skierowanym do góry; alternatywnie można użyć wyciągniętej szklanej pipety Pasteura i urządzenia do pipetowania ustnego (należy stosować ochronę oczu podczas zginania igły hipodermicznej lub łamania szklanej igły). Przebij błonę żółtka poza obrysem blastodermy i wsuń końcówkę igły pod zarodek, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne (Rysunek 2B). Wstrzyknij tylko tyle tuszu, aby obrysować zarodek, a następnie ostrożnie wycofaj igłę (Rysunek 2C). Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości tuszu może doprowadzić do śmierci zarodka. Ważne jest, aby nie wstrzyknąć żadnych pęcherzyków powietrza pod zarodek, ponieważ mogą one być źródłem kontaminacji. Uwaga: cały roztwór Ringera stosowany w tej procedurze jest sterylizowany i zawiera Pen/Strep zgodnie z powyższą definicją. Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) jest również dopuszczalną alternatywą dla roztworu Ringera we wszystkich krokach tego protokołu.
  8. Określ stadium rozwoju zarodka zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona63 i zapisz stadium na skorupce jaja trwałym pisakiem lub ołówkiem. Stadia najlepiej oceniać pod mikroskopem stereoskopowym, z wykorzystaniem światłowodowych źródeł światła typu „gooseneck”, które generują niską emisję ciepła.
  9. Nanieś 2-3 krople ciepłego, sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię zarodka, aby zapobiec odwodnieniu i kontaminacji. Tymczasowo zabezpiecz okno parafilmem rozciągniętym nad powierzchnią jaja.
  10. Powtórz kroki 2.2-2.9 dla wszystkich jaj kurzych przed rozpoczęciem eksperymentów z transplantacją.
  11. Ponieważ zarodki przepiórcze są używane wyłącznie jako tkanki dawcze, kroki 2.2-2.9 in ovo można pominąć. Do przygotowania zarodków dawców ex ovo jaja przepiórcze inkubuje się stroną tępą do góry i otwiera w tym obszarze zakrzywioną pęsetą, aby odsłonić zarodek. Używając nożyczek sekcyjnych, wykonaj cztery nacięcia w kształcie kwadratu przez błonę żółtkową i blastodermę poza zarodkiem (upewnij się, że wszystkie nacięcia się łączą). Używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwyć jedną z krawędzi nacięcia, podnieś zarodek z jaja i przenieś go do roztworu Ringera w szalce Petriego. Alternatywnie można użyć zakrzywionej pęsety irydowej do podniesienia wyciętego zarodka od spodu lub łyżeczki do embrionów bądź plastikowej pipety transferowej przeciętej w szerszej części cylindra, aby przenieść zarodek z jaja. Delikatnie usuń błonę żółtkową pęsetą nr 5. Zbierz pozostałe zarodki przepiórcze w ten sam sposób i określ ich stadium pod mikroskopem sekcyjnym.

3. Przygotowanie zarodka biorcy do przyjęcia przeszczepu

  1. Zdjąć parafilm z zarodka gospodarza (kurczaka) i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej lub pęsety nr 5 wykonać niewielki otwór w błonie żółtkowej w pożądanym obszarze rurki nerwowej (Rysunek 3A).
  2. Dodać kroplę roztworu Ringera do zarodka. Należy dbać o to, aby zarodek pozostawał całkowicie zanurzony w roztworze Ringera przez cały czas trwania procedury, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. W razie potrzeby należy sukcesywnie dodawać krople roztworu Ringera na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.
  3. Używając wyciągniętej igły szklanej, ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne, odpowiadające długości i obszarowi zainteresowania w grzbietowej części rurki nerwowej. (Wyciągnięte igły szklane są wytwarzane z silikatyowych kapilar szklanych, które zostały wyciągnięte pod wpływem ciepła za pomocą urządzenia do wyciągania igieł). W przypadku przeszczepów jednostronnych nacięcia powinny sięgać jedynie do światła grzbietowej części rurki nerwowej, a w przypadku przeszczepów obustronnych należy wykonać nacięcia przez całą szerokość grzbietowej części rurki nerwowej. Następnie należy przeciąć obustronnie przestrzeń między grzbietową częścią rurki nerwowej a mezodermą paraksjalną.
  4. Ostrożnie oddzielić wycięty eksplant od rurki nerwowej, a następnie usunąć go z zarodka poprzez odessanie do szklanej mikropipety (Rysunek 3B).

4. Przygotowanie tkanki przeszczepowej dawcy

  1. Wybierz zarodek przepiórki o odpowiadającym stadium rozwoju. Przytrzymaj zarodek pęsetą AA, usuń błonę żółtkową i wyetnij obszar cewy nerwowej o podobnej wielkości, jak opisano powyżej (3.3-3.4) (Rycina 3A'-B'). W zależności od potrzeb eksperymentu, obszar ten może być regionem komplementarnym do cewy nerwowej gospodarza (kurczaka) lub pochodzić z innego regionu wzdłuż osi rostro-kaudalnej. (Uwaga: w przypadku większych przeszczepów regionalnych, w tym pełnych przeszczepów cewy nerwowej, badacze mogą chcieć wprowadzić na tym etapie trawienie proteazą, aby usunąć przylegającą tkankę mezenchymalną z tkanki dawcy przed transplantacją. Jednak w przypadku małych przeszczepów grzbietowej części cewy nerwowej na wczesnych etapach, jak szczegółowo opisano tutaj, trawienie proteazą nie jest konieczne, ponieważ cewę nerwową można łatwo oddzielić od sąsiedniej mezenchymy za pomocą ściśle technik chirurgicznych.)

5. Przeszczepienie tkanki

  1. Odessa eksplant donora do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera. Należy uważać, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  2. Przenieś eksplant w miejsce sąsiadujące z wyciętym obszarem gospodarza (kurczaka). Za pomocą wyciągniętej szklanej igły ustaw eksplant i delikatnie wprowadź go w obszar ablacji (Rysunek 3C).
  3. Ostrożnie dodaj kilka kropli roztworu Ringera do embrionu, aby zapobiec odwodnieniu. Należy uważać, aby nie wkraplać płynu bezpośrednio na miejsce przeszczepu, ponieważ może to spowodować jego przemieszczenie.
  4. Uszczelnij okno taśmą pakową. Upewnij się, że taśma szczelnie zakrywa cały obszar okna w jajie. Zapobiega to odwodnieniu i kontaminacji embrionu podczas późniejszej inkubacji.
  5. Włóż jajo z powrotem do inkubatora aż do osiągnięcia pożądanego stadium. Upewnij się, że funkcja „kołysania” (rocking) jest wyłączona podczas inkubacji chimer. Jaja można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, co może zwiększyć ich żywotność, jeśli celem są późniejsze stadia rozwoju.

6. Przygotowanie embrionów chimerycznych do sekcjonowania

  1. W punkcie końcowym eksperymentu odciąć taśmę zakrywającą okno za pomocą precyzyjnych nożyczek.
  2. Chwycić krawędź blastodermy zakrzywioną pęsetą irydową (najłatwiej wykonać to pęsetą z ząbkami), a następnie oddzielić zarodek od żółtka, wykonując 4 szerokie cięcia poza granicami blastodermy.
  3. Przenieść zarodek do szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera. Należy zadbać o zminimalizowanie ekspozycji zarodka na powietrze, aby uniknąć odwodnienia tkanek.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oddzielić błonę witelijną od blastodermy za pomocą pęsety nr 5.
  5. Uważnie ułożyć zarodek w szalce tak, aby zachował tę samą orientację co w jajku, z płasko rozłożonymi błonami otaczającymi.
  6. Używając igieł sekcyjnych wykonanych z drutów wolframowych64, precyzyjnie usunąć otaczającą blastodermę z zarodka, ustawiając igłę na granicy zarodka i tkanek pozazarodkowych, tak aby drut wolframowy był równoległy do dna szalki. Tkaniki przeciąć delikatnym ruchem piłującym.
  7. Ostrożnie usunąć błonę owodnią za pomocą pęsety nr 5. Na tym etapie można przeprowadzić dalszą sekcję obszaru zainteresowania lub pozostawić zarodek w całości.
  8. Przenieść zarodek do lodowatej 4% paraformaldehydu i inkubować na kołysarce przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotować próbki i zatopić je do sekcjonowania krio- lub parafina-metodą.

Śledzenie przeszczepionej tkanki w obrębie zarodka biorcy. Istnieje kilka technik identyfikacji tkanki przepiórki w zarodku kurczaka, w tym wykrywanie jąderków przepiórki za pomocą barwienia hematoksyliną (jądra przepiórki posiadają znacznie większe, ciemniej barwiące się wtrącenia niż jądra kurczaka), reakcję Feulgena-Rossenbecka, barwienie akrydyną pomarańczową lub biz-benzamidem w połączeniu z mikroskopią elektronową lub immunoznakowanie antygenów specyficznych dla przepiórki3,47,65,66. W niniejszym protokole wykorzystujemy antygen QCPN oraz standardowe techniki immunofluorescencji całego preparatu lub przekrojów w celu identyfikacji komórek grzebienia neuronalnego przepiórki w chimerach przepiórka-kurczak (Rysunek 4). Technika ta zapewnia największą elastyczność w projekcie eksperymentalnym, ponieważ immunofluorescencję QCPN można łączyć z innymi przeciwciałami w celu identyfikacji zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki dawcy (przepiórki). Należy zastosować standardowe techniki immunofluorescencji całego preparatu lub przekrojów, aby znakować komórki pochodzące od przepiórki w chimerach.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny obraz obszaru przeszczepionego rurki nerwowej po 6h ponownej inkubacji (do stadium HH11) wykazuje oczekiwaną inkorporację przeszczepionej tkanki dawcy (przepiórki) do rurki nerwowej biorcy (kurczaka) (Rycina 4A). Zarodki wykazujące niepełną integrację przeszczepu lub asymetryczny rozwój obszaru czaszkowego bądź somytów po ponownej inkubacji powinny zostać odrzucone.

Przekrój poprzeczny przez obszar szczepienia w stadium HH11 wykazuje, że NCC znakowane HNK-1 migrują bocznie od rurki neuralnej. Komórki przepiórcze uczestniczące w strumieniu migracyjnym NCC oraz tworzące rurkę neuralną są wyraźnie znakowane QCPN (Rysunek 4B).

W późniejszych etapach komórki pochodne z NCC przepiórnika mogą być śledzone aż do ich docelowej tkanki. Komórki znakowane QCPN są rozmieszczone w obrębie mezenchymy wyrostka szczękowego zarodka kurczaka w dniu E5 (Rycina 4C).

Przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania komórek grzebienia neuronalnego (NCC) pochodzenia przepiórczego w środowisku gospodarza. Neurony sensoryczne nerwu trójdzielnego pochodzące z NCC przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN i Tuj1 (Rysunek 4D).

Proces tworzenia chimery zarodka kurczaka i przepiórki; schematy, narzędzia do eksperymentu nad rozwojem zarodkowym.
Rysunek 1. Przegląd procedury eksperymentalnej i niezbędnych instrumentów. A) Zarodki gospodarza (kurczaka) i dawcy (przepiórki) powinny być na tym samym etapie rozwoju. Do znakowania strumienia NCC, który przyczynia się do tworzenia zwoju trójdzielnego oraz obszaru szczękowo-żuchwowego, idealny jest etap HH9. W stadium HH9 cewka nerwowa zaczyna się zamykać w regionie rostralnym, ale nie jest jeszcze całkowicie szczelna. Szara linia na schematach reprezentuje linię środkową zamykającej się cewki nerwowej. Białe linie przerywane wskazują linie cięcia służące do wycięcia regionu śródmózgowia z prawej strony cewki nerwowej zarodków gospodarza i dawcy. Wycięty region zarodka gospodarza zostaje usunięty, a tkanka dawcy zostaje przeszczepiona w celu wytworzenia zarodka chimerycznego. B) Niezbędne instrumenty obejmują: a) strzykawkę 5 mL z igłą hipodermiczną 18½ G, b) strzykawkę 1 mL z igłą hipodermiczną 26½ G zgiętą pod kątem 45°, c) tusz kreślarski, d) przezroczystą taśmę pakową, e) pipetę szklaną z urządzeniem do pipetowania ustnego, f) szalkę Petriego 60 mm, g) pincetę AA, h) zakrzywioną pincetę irydową z ząbkowanymi końcówkami, i) pincetę nr 5, j) precyzyjne nożyczki, k) zaostrzony drut wolframowy, l) wyciąganą igłę szklaną, m) kwadraty parafilmu.

Schemat wstrzykiwania i znakowania jaj; analiza przenikania tuszu indyjskiego w strukturze skorupy.
Rycina 2. Przygotowanie jaj i embrionów. A) Schemat przekroju jaja, przedstawiający optymalny punkt wprowadzenia igły hipodermicznej 18½ G w celu odessania lekkiego albuminy. B) Po odessaniu ~3mL lekkiego albuminy, żółtko i embrion opadają wewnątrz jaja, co pozwala badaczom na wycięcie „okna” (strzałki) w skorupie jaja w celu uzyskania dostępu do embrionu. Następnie pod blastodermę można wstrzyknąć tusz indyjski, rozcieńczony 1:10 w sterylnym roztworze Ringera, aby zapewnić kontrast umożliwiający łatwe określenie stadium rozwoju embrionów. C) Embrion kurczaka po zabarwieniu tuszem.

Chimery embrionów kury i przepiórnika; stadia rozwojowe; schematy, fuzja embrionalna, błona witelinowa, HH9.
Rycina 3. Schemat i przykłady embrionów dawcy i biorcy w stadium HH 9 na każdym etapie procedury przeszczepiania. A) Embrion kury (biorca). Linie przerywane na schemacie wskazują miejsce, w którym należy przerwać błonę witelinową, aby uzyskać dostęp do regionu czaszkowego w celu wykonania przeszczepu. Po przerwaniu trójkątna klapa błony witelinowej powinna zostać odchylona w kierunku ogonowym. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B-C). A') Embrion przepiórnika (dawca). Zdjęcie przedstawia embrion dawcy wyjęty z jaja i umieszczony w szalce Petriego w celu wycięcia tkanki do przeszczepu. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B'). Linie przerywane na schemacie (A') wskazują miejsce, w którym należy przeciąć błony witelinową i żółtkową, aby usunąć embrion z jaja. B) Embrion biorcy z wyciętym jednostronnie regionem śródmózgowym rurki neuralnej (białe strzałki) oczekujący na przeszczep. Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsca nacięć koniecznych do wycięcia rurki neuralnej w regionie śródmózgowia. B') Embrion dawcy z wyciętą tkanką z grzbietowej części rurki neuralnej (tkanka przeszczepowa wskazana czarnymi grotami strzałek). Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsca nacięć w embrionie przepiórnika w celu wycięcia tkanki dawcy do jednostronnego przeszczepu w regionie śródmózgowia rurki neuralnej. C) Embrion chimeryczny po przeszczepieniu eksplantatu grzbietowej rurki neuralnej przepiórnika do regionu śródmózgowia kury.

Migracja embrionalnych komórek grzebienia neuronalnego w mikroskopii fluorescencyjnej; markery QCPN, HNK-1; widoki przekrojowe.
Rycina 4. Immunofluorescencja wykrywająca swoisty dla przepiórki antygen jądrowy QCPN w komórkach pochodzących od dawcy w embrionie chimerycznym. A) Obraz całego preparatu chimery HH11 (przeszczepionej w stadium HH9) pokazujący barwienie QCPN na czerwono i barwienie HNK-1 (marker migrujących NCC) na zielono. Powiększenie 10X, widok grzbietowy. B) Przekrój poprzeczny przez embrion z (A), pokazujący komórki pochodzące od przepiórki wykazujące pozytywną reakcję z QCPN w rurce neuralnej oraz migrujące NCC współbarwione z HNK-1 (zielone). Powiększenie 40X. C) Przekrój poprzeczny przez wyrostek szczękowy chimery E5 (inkubowanej przez 3 dni po przeszczepieniu), pokazujący pochodzące z NCC komórki pozytywne dla QCPN (czerwone), które zmigrowały z przeszczepionego obszaru rurki neuralnej do swojej docelowej lokalizacji w embrionie. Powiększenie 10X. D) Przekrój przez chimerę E5 pokazujący udział NCC pochodzących od przepiórki w zwoju trójdzielnym (czerwone) i różnicowanie w neurony pozytywne dla TuJ1 (zielone). Powiększenie 40X. *, NCCs; MP, wyrostek szczękowy; NT, rurka neuralna; TG, zwój trójdzielny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj przeszczepianie cewy nerwowej przepiórki do embrionów kurczęcia jest prostą i niedrogą techniką śledzenia specyficznych subpopulacji migrujących NCC wywodzących się z różnych regionów wzdłuż osi rostro-kaudalnej21,67-69. Technika ta wykorzystuje łatwy dostęp do embrionów ptaków (w porównaniu do embrionów ssaków) i może być łączona z innymi metodami, takimi jak ablacja tkanek, wstrzykiwanie cząsteczek inhibitorowych lub manipulacje genetyczne za pomocą elektroporacji plazmidów ekspresyjnych, aby e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom laboratorium Lwigale za krytyczną analizę manuskryptu. SLG jest wspierana przez stypendium Ruth L. Kirschstein NRSA z National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL jest wspierany przez National Eye Institute (EY018050).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jaja kurczęceRóżne
Jaja przepiórczeRóżne
Inkubator do jaj (Sportsman Incubator z cyfrowym odczytem, model 1502, z kontrolą wilgotności, 110-120 V AC)figure-materials-1 Zaopatrzenie w drób1502
Pinceta Dumont AA, pokryta epoksydem InoxFine Science Tools11210-10
Taśma klejąca ScotchDowolny dostawca
Zakrzywiona pęseta irydowaFine Science Tools11065-07
tusze indyjskiDowolny dostawca
Roztwór Pen/Strep (penicylina, streptomycyna) VWR international101447-068
Przezroczysta taśma pakowaDowolny dostawca
Aparat do wyciągania igiełNarishige InternationalPE-21
Wyciągnięta igła szklana, wykonana z borokrzemianowej rurki kapilarnej o wymiarach 1,5–1,8 x 100 mmKimble Chase34500 99
Wytrawiona pipeta szklana, wykonana z 5¾pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-6A
Aparat do pipetowania ustnego (zespół rurki aspiracyjnej dla kalibrowanej pipety mikrokapilarnej)Sigma-AldrichA5177-52A
pinceta Dumont #5Fine Science Tools11251-30
Drut wolframowy, średnica 0,1 mmVWR internationalAA10404-H2
Portigły do igieł (niklowany uchwyt do pinów)Fine Science Tools26018-17
anty serum QCPNBank Hybrydom Developmental Studies Hybridoma BankQCPN
przeciwciało wtórne Alexa Fluor (np. Alexa Fluor 594 kozie anty-mysie IgG1)InvitrogenA21125
Ringer’roztwór (2 L):
  • 14,4 g NaCl
  • 0,34 g CaCl22
  • 0,74 g KCl
  • 0,230 g Na2HPO4
  • 0,04 g KH2PO4
  • ddH2O2O do 2 L
  • Filtrowanie i autoklawowanie
Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

Bibliografia

  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chimera z pisklęcia przepiórkitransplantacja rurki neuralnejznakowanie przeciwciałem QCPNmikroskopia immunofluorescencyjnaprzeszczep homotopowyprzeszczep heterotopowyoś rostralno-kaudalnadostęp do zarodka ptakaśledzenie linii komórkowych
Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.