Artykuł metodologiczny

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

DOI:

10.3791/3622

⸱

7 lutego 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki ptaków stanowią wyjątkową platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców dzięki łatwemu dostępowi do zarodków wewnątrz jaja. Chimerowe zarodki ptaków, w których tkanka dawcy z przepiórki jest przeszczepiana do zarodka kurczaka in ovo, łączą zalety trwałego znakowania genetycznego populacji komórek z łatwością manipulacji, jaką oferuje zarodek ptaka.

Chimery przepiór-kurczak są klasycznym narzędziem do śledzenia migrujących komórek grzebienia neuronalnego (NCCs)1-3. NCCs stanowią przejściową migrującą populację komórek w embrionie, które pochodzą z grzbietowej części rozwijającej się rurki neuralnej4. Przechodzą one przejście nabłonkowo-mezenchymalne, a następnie migrują do innych obszarów embrionu, gdzie różnicują się w różne typy komórek, w tym chrząstkę5-13, melanocyty11,14-20, neurony i glej21-32. NCCs są multipotencjalne, a ich ostateczny los zależy od: 1) regionu rurki neuralnej, z którego pochodzą wzdłuż osi rostralno-kaudalnej embrionu11,33-37, 2) sygnałów z sąsiednich komórek podczas migracji38-44 oraz 3) mikrośrodowiska w ich ostatecznym miejscu przeznaczenia w obrębie embrionu45,46. Śledzenie tych komórek od miejsca ich powstania w rurce neuralnej do końcowej pozycji i losu w embrionie dostarcza ważnych informacji na temat procesów rozwojowych regulujących wzorcowanie i organogenezę.

Przeszczepianie komplementarnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy homotopowe) lub różnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy heterotopowe) może ujawnić różnice w przedspecyfikacji NCC wzdłuż osi rostro-kaudalnej2,47. Technikę tę można dodatkowo dostosować do przeszczepienia jednostronnego przedziału rurki neuralnej w taki sposób, aby jedna strona pochodziła z tkanki dawcy, a strona przeciwległa w embrionie biorcy pozostała nienaruszona, co zapewnia kontrolę wewnętrzną w obrębie tej samej próbki2,47. Może ona zostać również zaadaptowana do przeszczepiania segmentów mózgu w późniejszych stadiach embrionalnych, po etapie HH10, gdy przednia część rurki neuralnej uległa zamknięciu47.

W niniejszej pracy przedstawiamy techniki generowania chimer przepiórczo-kurzych poprzez transplantację rurki neuralnej, które umożliwiają śledzenie migrujących NCC pochodzących z określonego segmentu rurki neuralnej. Gatunkowo swoiste znakowanie komórek pochodzących od dawcy za pomocą przeciwciała QCPN specyficznego dla przepiórki48-56 pozwala badaczowi odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy w końcowym punkcie eksperymentu. Technika ta jest prosta, niedroga i ma wiele zastosowań, w tym mapowanie losów komórek, śledzenie linii komórkowych oraz identyfikację zdarzeń pre-patterningu wzdłuż osi rostro-kaudalnej45. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka ptasiego, technika przeszczepu przepiórczo-kurzego może być łączona z innymi manipulacjami, w tym między innymi z ablacją soczewki40, wstrzykiwaniem cząsteczek inhibicyjnych57,58 lub manipulacjami genetycznymi poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych59-61, aby zidentyfikować odpowiedź konkretnych strumieni migrujących NCC na zaburzenia w programie rozwojowym zarodka. Ponadto technika ta może być również wykorzystywana do generowania innych międzygatunkowych zarodków chimerycznych, takich jak chimery przepiórczo-kaczcze, w celu zbadania udziału NCC w morfogenezie kraniofacjalnej, lub chimery mysio-kurze, aby połączyć możliwości genetyki myszy z łatwością manipulacji zarodkiem ptasim.62

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inkubacja jaj kurzych i przepiórczych do pożądanego stadium

W przypadku zarodków w stadium HH9 typowy czas inkubacji wynosi od 29-33 godzin w temperaturze 38 °C.63

  1. Opłucz jaja z wszelkich zanieczyszczeń letnią wodą.
  2. Ułóż jaja kurze poziomo na tacy. Zaznacz ołówkiem stronę skierowaną do góry; będzie ona odpowiadać obszarowi, w którym zlokalizowany będzie embrion. Jaja przepiórcze inkubuj tępym końcem do góry.
  3. Umieść jaja w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 38 °C. Włącz funkcję kołysania.

2. Przygotowanie jaj do wycinania okienka i sekcji

  1. Wyjąć jaja z inkubatora i wysterylizować ich górne części 70% etanolem. Najlepiej rozpylić etanol i szybko wytrzeć go ręcznikiem papierowym lub chusteczką typu Kimwipe, aby uniknąć wchłaniania etanolu przez skorupkę jaja.
  2. Umieścić jajo kurze na indywidualnym uchwycie (stosujemy szalkę Petriego wyłożoną złożonymi ręcznikami papierowymi, np. „Kimwipes”). Za pomocą pęsety AA delikatnie nakłuć mały otwór w górnej powierzchni skorupki jaja na jego ostrym końcu.
  3. Usunąć 1,5-3 mL rzadkiego albuminy z jaja kurzego za pomocą igły hipodermicznej 18½ G i strzykawki 5 mL. Najlepiej wprowadzić igłę pionowo do otworu, skierowując ścięcie w stronę ostrego końca jaja (Rysunek 2A). W ten sposób podczas odsysania albuminy istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego uszkodzenia żółtka przez ssanie. Albuminę usunąć. Ten krok obniży poziom żółtka i embrionu wewnątrz jaja, co umożliwi wykonanie okienka w skorupce.
  4. Przetrzeć otwór 70% etanolem w opisany wyżej sposób i zamknąć go taśmą klejącą. Ważne jest, aby skorupka wokół otworu była całkowicie wolna od albuminy i sucha, w przeciwnym razie klej nie przylgnie.
  5. Za pomocą pęsety AA nakłuć kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni jaja ułożonego poziomo, nieco poniżej wierzchołka. Należy uważać, aby pęseta nie weszła zbyt głęboko przez skorupkę, by nie uszkodzić żółtka lub embrionu.
  6. Wprowadzić jeden koniec zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do skorupki jaja. Ściskając skorupkę i wykonując ruchy koliste, wyciąć okno o średnicy ok. 2 cm w skorupce jaja kurzego. Usunąć fragment skorupki. Alternatywnie można pokryć górną powierzchnię jaja taśmą pakową i wyciąć okno nożyczkami. Minimalizuje to ryzyko wpadnięcia odłamków skorupki do wnętrza jaja. Embrion powinien być widoczny jako nieprzezroczysty krążek na powierzchni żółtka. Odrzucić jaja niezapłodnione (rozpoznawalne po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy).
  7. Wstrzyknąć niewielką ilość tuszu indyjskiego (rozcieńczonego 1:10 w sterylnym roztworze Ringera zawierającym antybiotyki „Pen/Strep”: stężenie końcowe 100 μg/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny) pod blastodermę, aby ułatwić określenie stadium rozwoju embrionu. Użyć strzykawki 1 mL i igły hipodermicznej 26½ G, zgiętej pod kątem 45° u podstawy, ze ścięciem skierowanym do góry; alternatywnie można użyć wyciąganej szklanej pipety Pasteura i urządzenia do pipetowania ustnego (należy stosować ochronę oczu podczas zginania igły hipodermicznej lub łamania igły szklanej). Przebić błonę żółtkową poza obrysem blastodermy i wsunąć końcówkę igły pod embrion, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne (Rysunek 2B). Wstrzyknąć tylko tyle tuszu, aby obrysować embrion, a następnie ostrożnie wycofać igłę (Rysunek 2C). Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości tuszu może doprowadzić do śmierci embrionu. Ważne jest, aby nie wstrzyknąć żadnych pęcherzyków powietrza pod embrion, ponieważ mogą one stać się źródłem kontaminacji. Uwaga: Cały roztwór Ringera stosowany w tej procedurze jest sterylizowany i zawiera Pen/Strep zgodnie z powyższą definicją. Sterylny roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) jest również dopuszczalną alternatywą dla roztworu Ringera we wszystkich krokach tego protokołu.
  8. Określić stadium rozwoju embrionu zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona63 i zapisać stadium na skorupce jaja trwałym markerem lub ołówkiem. Stadia najlepiej oceniać pod mikroskopem stereoskopowym, stosując światłowodowe źródła światła typu „gęsia szyja”, które generują ograniczoną ilość ciepła.
  9. Nanieść 2-3 krople ciepłego sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię embrionu, aby zapobiec odwodnieniu i kontaminacji. Tymczasowo zamknąć okno za pomocą parafilmu rozciągniętego nad powierzchnią jaja.
  10. Powtórzyć kroki 2.2-2.9 dla wszystkich jaj kurzych przed rozpoczęciem eksperymentów z transplantacją.
  11. Ponieważ embriony przepiórcze są wykorzystywane wyłącznie jako tkanki dawcze, kroki 2.2-2.9 in ovo można pominąć. W przypadku przygotowania embrionów dawczych ex ovo, jaja przepiórcze inkubuje się tępym końcem do góry i otwiera w tym regionie zakrzywioną pęsetą, aby odsłonić embrion. Używając nożyczek sekcyjnych, wykonać cztery cięcia w kształcie kwadratu przez błonę żółtkową i blastodermę na zewnątrz embrionu (należy upewnić się, że wszystkie cięcia się łączą). Używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwycić jedną z krawędzi cięcia, unieść embrion z jaja i przenieść go do roztworu Ringera w szalce Petriego. Alternatywnie można użyć zakrzywionej pęsety irydowej do uniesienia wyciętego embrionu od spodu, lub użyć łyżeczki do embrionów bądź plastikowej pipety transferowej przeciętej w szerszej części cylindra, aby przenieść embrion z jaja. Delikatnie usunąć błonę żółtkową pęsetą nr 5. Pozostałe embriony przepiórcze zebrać w opisany wyżej sposób i określić ich stadium pod mikroskopem sekcyjnym.

3. Przygotowanie zarodka biorcy do przyjęcia przeszczepu

  1. Usuń parafilm z zarodka gospodarza (kurczaka) i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej lub pęsety nr 5 wykonaj mały otwór w błonie żółtkowej w pożądanym obszarze rurki neuralnej (Rysunek 3A).
  2. Dodaj kroplę roztworu Ringera do zarodka. Należy zadbać o to, aby zarodek przez cały czas trwania procedury był całkowicie zanurzony w roztworze Ringera, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. W razie potrzeby sukcesywnie dodawaj krople roztworu Ringera na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.
  3. Za pomocą wyciągniętej igły szklanej ostrożnie wykonaj poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne, odpowiadające długości i obszarowi zainteresowania w grzbietowej części rurki neuralnej. (Wyciągnięte igły szklane otrzymuje się z kapilar szklanych krzemionkowych, które zostały rozciągnięte pod wpływem ciepła za pomocą wyciągarki do igieł). W przypadku przeszczepów jednostronnych nacięcia powinny sięgać jedynie do światła grzbietowej rurki neuralnej, a w przypadku przeszczepów obustronnych należy wykonać nacięcia przez całą szerokość grzbietowej rurki neuralnej. Następnie wykonaj obustronne cięcie między grzbietową rurką neuralną a mezodermą paraksjalną.
  4. Ostrożnie oddziel wycięty eksplant od rurki neuralnej, a następnie usuń go z zarodka poprzez aspirację do szklanej mikropipety (Rysunek 3B).

4. Przygotowanie tkanki przeszczepu od dawcy

  1. Wybrać zarodek przepiórki o odpowiadającym stadium rozwojowym. Przytrzymać zarodek pęsetą AA, usunąć błonę żółtkową i wyciąć obszar cewy nerwowej o podobnej wielkości, zgodnie z opisem powyżej (3.3-3.4) (Rysunek 3A'-B'). W zależności od potrzeb eksperymentu obszar ten może być regionem komplementarnym do cewy nerwowej gospodarza (kurczaka) lub pochodzić z innego regionu wzdłuż osi rostro-kaudalnej. (Uwaga: w przypadku większych przeszczepów regionalnych, w tym pełnych przeszczepów cewy nerwowej, badacze mogą chcieć wprowadzić na tym etapie trawienie proteazą, aby usunąć przylegającą tkankę mezenchymalną z tkanki dawcy przed transplantacją. Jednak w przypadku małych przeszczepów grzbietowej części cewy nerwowej we wczesnych stadiach, jak opisano tutaj, trawienie proteazą nie jest konieczne, ponieważ cewę nerwową można łatwo oddzielić od sąsiedniej mezenchymy za pomocą wyłącznie technik chirurgicznych.)

5. Przeszczepienie tkanki

  1. Odssać eksplant dawcy do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera. Należy uważać, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  2. Przenieść eksplant w sąsiedztwo wyciętego obszaru u kurczaka biorcy. Za pomocą wyciągniętej szklanej igły ustawić eksplant i delikatnie wprowadzić go w obszar ablacji (Rysunek 3C).
  3. Ostrożnie dodać kilka kropel roztworu Ringera do embrionu, aby zapobiec odwodnieniu. Należy uważać, aby nie nanosić cieczy bezpośrednio na miejsce przeszczepu, ponieważ może to spowodować jego przemieszczenie.
  4. Uszczelnić okno taśmą pakową. Należy upewnić się, że taśma całkowicie zakrywa obszar otworu w jajku. Zapobiega to odwodnieniu i kontaminacji embrionu podczas późniejszej inkubacji.
  5. Umieścić jajko z powrotem w inkubatorze aż do osiągnięcia pożądanego stadium. Należy upewnić się, że funkcja kołysania („rocking”) jest wyłączona podczas inkubacji chimer. Jajka można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, co może zwiększyć ich przeżywalność w przypadku celowania w późniejsze stadia rozwoju.

6. Przygotowanie embrionów chimerycznych do sekcjonowania

  1. W punkcie końcowym eksperymentu odetnij nożyczkami precyzyjnymi taśmę zakrywającą okienko.
  2. Chwyć krawędź blastodermy za pomocą zakrzywionej pęsety irydowej (najłatwiej wykonać to pęsetą z ząbkami), a następnie oddziel zarodek od żółtka, wykonując 4 szerokie cięcia poza granicami blastodermy.
  3. Przenieś zarodek do szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera. Należy zadbać o zminimalizowanie kontaktu zarodka z powietrzem, aby uniknąć odwodnienia tkanek.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oddziel błonę żółtkową od blastodermy, używając pęsety nr 5.
  5. Starannie ułóż zarodek w szalce tak, aby znajdował się w tej samej orientacji, co w jajku, z rozprostowanymi płasko błonami otaczającymi.
  6. Używając igieł sekcyjnych wykonanych z drutów wolframowych64, precyzyjnie usuń otaczającą blastodermę z zarodka, ustawiając igłę na granicy zarodka i tkanek pozazarodkowych tak, aby drut wolframowy był równolegle do dna szalki. Aby przeciąć tkanki, stosuj delikatne ruchy piłujące.
  7. Ostrożnie usuń błonę owodni pęsetą nr 5. Na tym etapie można przystąpić do dalszej sekcji interesującego obszaru lub pozostawić zarodek w całości.
  8. Przenieś zarodek do lodowatego 4% paraformaldehydu i inkubuj na kołysce przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotuj próbki i zatop je w celu wykonania skrawków kriotomicznych lub parafinowych.

Śledzenie przeszczepionej tkanki w obrębie zarodka gospodarza. Istnieje kilka technik identyfikacji tkanki przepiórczej w zarodku kurczaka, w tym wykrywanie jąderek przepiórczych za pomocą barwienia hematoksyliną (jądra przepiórcze mają znacznie większe i ciemniej barwiące się inkluzje niż jądra kurczaka), reakcję Feulgena-Rossenbecka, barwienie akrydyną pomarańczową lub biz-benzamidem w połączeniu z mikroskopią elektronową lub immunoznakowanie antygenów specyficznych dla przepiórki3,47,65,66. W niniejszej procedurze wykorzystujemy antygen QCPN oraz standardowe techniki immunofluorescencji preparatów całych lub sekcji w celu identyfikacji komórek grzebienia neuralnego przepiórki w chimerach przepiórka-kurczak (Rycina 4). Technika ta zapewnia największą elastyczność w projektowaniu eksperymentów, ponieważ immunofluorescencję QCPN można łączyć z innymi przeciwciałami w celu identyfikacji zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki dawcy (przepiórki). Należy zastosować standardowe techniki immunofluorescencji preparatów całych lub sekcji, aby oznakować komórki pochodzące od przepiórki w chimerach.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny obraz obszaru przeszczepionego rurki neuralnej po 6 h ponownej inkubacji (do stadium HH11) pokazuje oczekiwaną inkorporację przeszczepionej tkanki donora (przepiórki) do rurki neuralnej biorcy (kurczaka) (rycina 4A). Zarodki wykazujące niepełną integrację przeszczepu lub asymetryczny rozwój obszaru kranialnego lub somytów po ponownej inkubacji powinny zostać odrzucone.

Przekrój poprzeczny przez obszar przeszczepu w stadium HH11 pokazuje komórki NCC znakowane HNK-1, migrujące bocznie z dala od cewy nerwowej. Komórki przepiórki uczestniczące w strumieniu migracyjnym NCC oraz w tworzeniu cewy nerwowej są wyraźnie znakowane QCPN (Rycina 4B).

Na późniejszych etapach komórki pochodzące z NCC przepiórnika mogą być śledzone aż do ich docelowej tkanki. Komórki znakowane QCPN są rozproszone w mezenchymie wyrostka szczękowego zarodka kurczaka w E5 (Rysunek 4C).

Przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania NCC pochodzących od przepiórki w środowisku gospodarza. Neurony czuciowe nerwu trójdzielnego pochodzące z NCC przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN oraz Tuj1 (Rycina 4D).

Układ chimery kurczaka i przepiórki; schemat i narzędzia do eksperymentu z transplantacją zarodka.
Rycina 1. Przegląd procedury eksperymentalnej i niezbędnych instrumentów. A) Zarodki gospodarza (kurczaka) i dawcy (przepiórki) powinny znajdować się na tym samym etapie rozwoju. W celu oznakowania strumienia NCC, który przyczynia się do tworzenia zwoju trójdzielnego oraz obszaru szczękowo-żuchwowego, idealny jest etap HH9. W stadium HH9 cewka nerwowa zaczyna się zamykać w regionie rostralnym, ale nie jest jeszcze całkowicie szczelna. Szara linia na schematach reprezentuje linię środkową zamykającej się cewki nerwowej. Białe linie przerywane wskazują linie cięcia do wycięcia obszaru śródmózgowia z prawej strony cewki nerwowej z zarodków gospodarza i dawcy. Wycięty obszar zarodka gospodarza jest usuwany, a tkanka dawcy transplantowana w celu wytworzenia zarodka chimerycznego. B) Niezbędne instrumenty obejmują: a) strzykawkę 5 mL z igłą hipodermiczną 18½ G, b) strzykawkę 1 mL z igłą hipodermiczną 26½ G zgiętą pod kątem 45°, c) tusz kreślarski, d) przezroczystą taśmę pakową, e) pipetę szklaną z aparatem do pipetowania ustnego, f) szalkę Petriego 60 mm, g) pęsetę AA, h) zakrzywioną pęsetę irydową z ząbkowanymi końcówkami, i) pęsetę nr 5, j) precyzyjne nożyczki, k) zaostrzony drut wolframowy, l) wyciągniętą igłę szklaną, m) kwadraty z parafilmu.

Schemat wstrzykiwania w embrion, znakowanie tuszem indyjskim, schemat struktury żółtka w skorupce jaja i wynik.
Rycina 2. Przygotowanie jaj i embrionów. A) Schemat przekroju jaja, przedstawiający optymalny punkt wprowadzenia igły hipodermicznej 18½ G w celu odessania albuminy lekkiej. B) Po odessaniu ok. 3mL albuminy lekkiej żółtko i embrion obniżają się wewnątrz jaja, co pozwala badaczom na wycięcie „okienka” (strzałki) w skorupce jaja w celu uzyskania dostępu do embrionu. Następnie pod blastodermę można wstrzyknąć tusz indyjski, rozcieńczony 1:10 w sterylnym roztworze Ringera, aby zapewnić kontrast ułatwiający określenie stadium rozwoju embrionów. C) Embrion kurczaka po znakowaniu tuszem.

Schemat rozwoju zarodka kurczaka i przepiórki; chimeryczne stadia HH9; błona witelinowa, błony pozazarodkowe.
Rycina 3. Schemat i przykłady zarodków dawcy i biorcy w stadium HH9 na każdym etapie procedury przeszczepiania. A) Zarodek biorcy (kurczak). Linie przerywane na schemacie wskazują miejsce, w którym należy przerwać błonę witelinową, aby uzyskać dostęp do regionu kranialnego w celu wykonania przeszczepu. Po przerwaniu trójkątna zakładka błony witelinowej powinna zostać odchylona w kierunku kaudalnym. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B-C). A') Zarodek dawcy (przepiórka). Zdjęcie przedstawia zarodek dawcy wyjęty z jaja i umieszczony w szalce Petriego w celu wycięcia tkanki do przeszczepu. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B'). Linie przerywane na schemacie (A') wskazują miejsce, w którym należy rozciąć błony witelinową i żółtkową, aby usunąć zarodek z jaja. B) Zarodek biorcy z wyciętym jednostronnie regionem śródmózgowia rurki neuralnej (białe strzałki) oczekujący na przeszczep. Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsce nacięć niezbędnych do wycięcia rurki neuralnej w regionie śródmózgowia. B') Zarodek dawcy z wyciętą tkanką przeszczepową z grzbietowej części rurki neuralnej (tkanka przeszczepowa wskazana czarnymi grotami strzałek). Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsce nacięć w zarodku przepiórki w celu wycięcia tkanki dawcy do jednostronnego przeszczepu do regionu śródmózgowia rurki neuralnej. C) Zarodek chimeryczny po przeszczepieniu eksplantu grzbietowej rurki neuralnej przepiórki do regionu śródmózgowia kurczaka.

Mikroskopia fluorescencyjna cewy nerwowej (NT) i zwojów wykazująca wzór barwienia QCPN, HNK-1 i DAPI.
Rycina 4. Immunofluorescencja wykrywająca specyficzny dla przepiórki antygen jądrowy QCPN w komórkach pochodzących od donora w embrionie chimerycznym. A) Obraz całego preparatu chimery HH11 (przeszczepionej w stadium HH9) wykazujący barwienie QCPN na czerwono oraz barwienie HNK-1 (markera migrujących NCC) na zielono. Powiększenie 10X, widok grzbietowy. B) Przekrój poprzeczny przez embrion z (A), wykazujący dodatnie pod względem QCPN komórki pochodzące od przepiórki w cewie nerwowej oraz migrujące NCC współbarwione z HNK-1 (zielony). Powiększenie 40X. C) Przekrój poprzeczny przez wyrostek szczękowy chimery E5 (inkubowanej przez 3 dni po przeszczepieniu), wykazujący dodatnie pod względem QCPN komórki pochodzące z NCC (czerwone), które migrowały z przeszczepionego regionu cewy nerwowej do ich docelowej lokalizacji w embrionie. Powiększenie 10X. D) Przekrój przez chimerę E5 wykazujący wkład NCC pochodzących od przepiórki do zwoju trójdzielnego (czerwony) oraz ich różnicowanie w neurony dodatnie pod względem TuJ1 (zielony). Powiększenie 40X. *, NCCs, komórki grzebienia neuronalnego; MP, wyrostek szczękowy; NT, cewa nerwowa; TG, zwój trójdzielny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj przeszczepianie cewy nerwowej przepiórki do embrionów kurczęcia jest prostą i niedrogą techniką śledzenia specyficznych subpopulacji migrujących NCC wywodzących się z różnych regionów wzdłuż osi rostro-kaudalnej21,67-69. Technika ta wykorzystuje łatwy dostęp do embrionów ptaków (w porównaniu do embrionów ssaków) i może być łączona z innymi metodami, takimi jak ablacja tkanek, wstrzykiwanie cząsteczek inhibitorowych lub manipulacje genetyczne za pomocą elektroporacji plazmidów ekspresyjnych, aby e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom laboratorium Lwigale za krytyczną analizę manuskryptu. SLG jest wspierana przez stypendium Ruth L. Kirschstein NRSA z National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL jest wspierany przez National Eye Institute (EY018050).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jaja pisklątRóżne
jaja przepiórczeRóżne
inkubatory jaj (odczyt cyfrowy 1502 Inkubator sportowca z wilgotnością 110-120 V AC)figure-materials-1 Zaopatrzenie drobiu1502
Kleszcze AA Dumont, Inox Narzędziado nauki11210-10
Taśma klejącaDowolny dostawca
Zakrzywione kleszcze do tęczówkiFine Science Tools11065-07
Atrament indyjskiDowolny dostawca Rozwiązanie
długopisu/paciorkowca (penicylina, streptomycyna) VWR international101447-068
Przezroczysta taśma pakowaDowolny dostawca
Aparat do ciągnięcia igiełNarishige InternationalPE-21
Igła ze szkła ciągnionego, wykonana z rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego 1,5-1,8 x 100 mmKimble Chase34500 99
Pipeta ze szkła ciągnionego, wykonana z 5¾ " Pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-6A
Aparat do pipet doustnych (zespół rurki aspiratora do skalibrowanej pipety mikrokapilarnej)Sigma-AldrichA5177-52A
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-30
Drut wolframowy, średnica 0,1 mmVWR internationalAA10404-H2
Uchwyty na igły (trzpień niklowany posiadacz)Fine Science Tools26018-17
QCPN antisurowicaBadania rozwojowe Hybridoma BankQCPN
Alexa Fluor przeciwciało wtórne (np. Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1)InvitrogenA21125
Ringer' s Roztwór (2L):
  • 14,4 g NaCl
  • 0,34g CaCl2
  • 0,74g KCl
  • 0,230 g Na2HPO4
  • 0,04g KH2PO4
  • ddH2O do 2L
  • Filtr i autoklaw
Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-4
  • 7778-77-0 li>
o naprawach epoksydowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chimera z piskl cia przepi rkitransplantacja rurki neuralnejznakowanie przeciwcia em QCPNmikroskopia immunofluorescencyjnaprzeszczep homotopowyprzeszczep heterotopowyo rostralno kaudalnadost p do zarodka ptakaledzenie linii kom rkowych

Powiązane artykuły