Artykuł metodologiczny

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

DOI:

10.3791/3622

⸱

7 lutego 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę analizy migracji i ostatecznego losu komórek grzebienia nerwowego ptaków w chimerycznych embrionach przepiórniczo-kurzych. Metoda ta stanowi prostą i bezpośrednią technikę śledzenia komórek grzebienia nerwowego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki ptaków stanowią wyjątkową platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców, dzięki łatwemu dostępowi do zarodka wewnątrz jaja. Chimeryczne zarodki ptaków, w których tkanka dawcy przepiórki jest przeszczepiana do zarodka kurczaka in ovo, łączą zalety trwałego znakowania genetycznego populacji komórek z łatwością manipulacji, jaką oferuje zarodek ptasi.

Chimery przepiór-kurczak są klasycznym narzędziem do śledzenia migrujących komórek grzebienia neuronalnego (NCCs)1-3. NCCs stanowią przejściową migrującą populację komórek w embrionie, które pochodzą z regionu grzbietowego rozwijającej się rurki neuralnej4. Przechodzą one przejście epitelialno-mezenchymalne, a następnie migrują do innych obszarów embrionu, gdzie różnicują się w różne typy komórek, w tym chrząstkę5-13, melanocyty11,14-20, neurony i glej21-32. NCCs są multipotencjalne, a ich ostateczny los zależy od: 1) regionu rurki neuralnej, z którego pochodzą wzdłuż osi rostro-kaudalnej embrionu11,33-37, 2) sygnałów z sąsiednich komórek podczas ich migracji38-44 oraz 3) mikrośrodowiska ich ostatecznego miejsca przeznaczenia w obrębie embrionu45,46. Śledzenie tych komórek od miejsca ich powstania w rurce neuralnej, aż po ich końcową pozycję i los w embrionie, dostarcza istotnych informacji na temat procesów rozwojowych regulujących wzorowanie i organogenezę.

Przeszczepianie komplementarnych obszarów cewy nerwowej dawcy (przeszczepianie homotopowe) lub różnych obszarów cewy nerwowej dawcy (przeszczepianie heterotopowe) może ujawnić różnice w przedspecyfikacji NCCs wzdłuż osi rostro-kaudalnej2,47. Technikę tę można dodatkowo zmodyfikować, aby przeszczepić jednostronny przedział cewy nerwowej w taki sposób, by jedna strona pochodziła z tkanki dawcy, a strona przeciwległa pozostała nienaruszona w embrionie biorcy, co zapewnia wewnętrzną kontrolę w obrębie tej samej próbki2,47. Można ją również dostosować do przeszczepiania segmentów mózgu w późniejszych stadiach embrionalnych, po HH10, kiedy przednia część cewy nerwowej uległa zamknięciu47.

W niniejszej pracy przedstawiamy techniki generowania chimer przepiórczo-kurzych poprzez transplantację rurki neuralnej, co umożliwia śledzenie migrujących NCC pochodzących z określonego segmentu rurki neuralnej. Gatunkowo swoiste znakowanie komórek pochodzących od dawcy za pomocą swoistego dla przepiórki przeciwciała QCPN48-56 pozwala badaczowi odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy w końcowym punkcie eksperymentu. Technika ta jest prosta, niedroga i posiada wiele zastosowań, w tym mapowanie losów komórek, śledzenie linii komórkowych oraz identyfikację zdarzeń wstępnego wzorowania wzdłuż osi rostro-kaudalnej45. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka ptaka, technika przeszczepu przepiórczo-kurzego może być łączona z innymi manipulacjami, w tym między innymi z ablacją soczewki40, wstrzykiwaniem cząsteczek inhibicyjnych57,58 lub manipulacjami genetycznymi poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych59-61, aby zidentyfikować reakcję konkretnych strumieni migrujących NCC na zaburzenia w programie rozwojowym zarodka. Ponadto ta technika przeszczepiania może być również wykorzystywana do generowania innych międzygatunkowych zarodków chimerycznych, takich jak chimery przepiórczo-kaczcze, w celu badania wkładu NCC w morfogenezę kraniofacjalną, lub chimery mysio-kurze, aby połączyć potencjał genetyki myszy z łatwością manipulacji zarodkiem ptaka.62

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inkubacja jaj kurzych i przepiórczych do pożądanego stadium

W przypadku embrionów w stadium HH9 typowy czas inkubacji wynosi od 29-33 godzin w temperaturze 38 °C.63

  1. Zmyć z jaj wszelkie zanieczyszczenia letnią wodą.
  2. Ułożyć jaja kurze poziomo na tacy. Zaznaczyć ołówkiem stronę skierowaną do góry; będzie ona odpowiadać obszarowi, w którym zlokalizowany będzie embrion. Jaja przepiórcze inkubować tępym końcem do góry.
  3. Umieścić w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C. Włączyć funkcję kołysania.

2. Przygotowanie jaj do wycięcia okna i sekcji

  1. Wyjąć jaja z inkubatora i wysterylizować ich górne części 70% etanolem. Najlepiej rozpylić etanol i szybko wytrzeć go ręcznikiem papierowym lub chusteczką Kimwipe, aby uniknąć wchłaniania etanolu przez skorupkę jaja.
  2. Umieścić jajo kurze w indywidualnym uchwycie (stosujemy szalkę Petriego wyłożoną złożonymi ręcznikami papierowymi, np. „Kimwipes”). Za pomocą pęsety AA zrobić niewielki otwór w górnej powierzchni skorupki w ostrym końcu jaja.
  3. Usunąć 1,5-3 mL rzadkiego albuminy z jaja kurzego za pomocą igły hipodermicznej 18½ G i strzykawki 5 mL. Najlepiej wprowadzić igłę pionowo do otworu, skierowując ścięcie igły w stronę ostrego końca jaja (Rycina 2A). W ten sposób podczas odsysania albuminy istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego uszkodzenia żółtka przez ssanie. Albuminę usunąć. Ten krok obniży poziom żółtka i zarodka wewnątrz jaja, co umożliwi otwarcie okna w skorupce.
  4. Przetrzeć otwór 70% etanolem, jak opisano powyżej, i zamknąć go taśmą klejącą. Ważne jest, aby skorupka wokół otworu była całkowicie wolna od albuminy i sucha, w przeciwnym razie klej nie przylgnie.
  5. Za pomocą pęsety AA zrobić kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni jaja ułożonego poziomo, nie całkiem na szczycie. Należy uważać, aby pęseta nie wniknęła zbyt głęboko w skorupkę, aby uniknąć uszkodzenia żółtka lub zarodka.
  6. Wprowadzić jeden koniec zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do skorupki jaja. Ściskając skorupkę i wykonując ruchy okrężne, wyciąć okno o średnicy ok. 2 cm w skorupce jaja kurzego. Usunąć fragment skorupki. Alternatywnie można pokryć górną powierzchnię jaja taśmą pakową i użyć nożyczek do wycięcia okna. Minimalizuje to ryzyko wpadnięcia odłamków skorupki do wnętrza jaja. Zarodek powinien być widoczny jako nieprzezroczysta tarcza na powierzchni żółtka. Odrzucić jaja niezapłodnione (rozpoznawalne po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy).
  7. Wstrzyknąć niewielką ilość tuszu chińskiego (rozcieńczonego 1:10 w sterylnym roztworze Ringera zawierającym antybiotyk „Pen/Strep”: stężenie końcowe 100 μg/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny) pod blastodermę, aby ułatwić określenie stadium rozwoju zarodka. Użyć strzykawki 1 mL i igły hipodermicznej 26½ G, zgiętej pod kątem 45° u nasady, ze ścięciem skierowanym do góry; alternatywnie można użyć dociąganej szklanej pipety Pasteura i urządzenia do pipetowania ustnego (należy stosować ochronę oczu podczas zginania igły hipodermicznej lub łamania szklanej igły). Przebić błonę żółtkową poza obrysem blastodermy i wsunąć końcówkę igły pod zarodek, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne (Rycina 2B). Wstrzyknąć tylko tyle tuszu, aby obrysować zarodek, a następnie ostrożnie wycofać igłę (Rycina 2C). Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości tuszu może doprowadzić do śmierci zarodka. Ważne jest, aby nie wstrzyknąć żadnych pęcherzyków powietrza pod zarodek, ponieważ mogą one być źródłem kontaminacji. Uwaga: cały roztwór Ringera stosowany w tej procedurze jest sterylny i zawiera Pen/Strep zgodnie z powyższym opisem. Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) jest również dopuszczalną alternatywą dla roztworu Ringera we wszystkich krokach tego protokołu.
  8. Określić stadium rozwoju zarodka zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona63 i zapisać stadium na skorupce jaja trwałą pisaką lub ołówkiem. Stadia najlepiej oceniać pod mikroskopem stereoskopowym, korzystając ze światłowodowych źródeł światła typu „gęsia szyja”, które mają ograniczoną emisję ciepła.
  9. Nanieść 2-3 krople ciepłego sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię zarodka, aby zapobiec dehydratacji i kontaminacji. Tymczasowo zamknąć okno za pomocą parafilmu naciągniętego na powierzchnię jaja.
  10. Powtórzyć kroki 2.2-2.9 dla wszystkich jaj kurzych przed rozpoczęciem eksperymentów z transplantacją.
  11. Ponieważ zarodki przepiórcze są wykorzystywane wyłącznie jako tkanki donora, kroki in ovo 2.2-2.9 można pominąć. W przypadku przygotowania zarodków donora ex ovo, jaja przepiórcze inkubuje się tępym końcem do góry i otwiera w tym obszarze zakrzywioną pęsetą, aby odsłonić zarodek. Za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonać cztery nacięcia w kształcie kwadratu przez błonę żółtkową i blastodermę poza obrębem zarodka (należy upewnić się, że wszystkie nacięcia się łączą). Używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwycić jedną z krawędzi nacięcia, unieść zarodek z jaja i przenieść go do roztworu Ringera w szalce Petriego. Alternatywnie można użyć zakrzywionej pęsety irydowej do podniesienia wyciętego zarodka od spodu lub użyć łyżeczki do zarodków bądź plastikowej pipety transferowej przeciętej w szerszej części cylindra, aby przenieść zarodek z jaja. Delikatnie usunąć błonę żółtkową za pomocą pęsety nr 5. Pozostałe zarodki przepiórcze zebrać w powyższy sposób i określić ich stadium pod mikroskopem sekcyjnym.

3. Przygotowanie zarodka gospodarza do przyjęcia przeszczepu

  1. Zdjąć parafilm z zarodka gospodarza (kurczaka) i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej lub pęsety nr 5 wykonać niewielki otwór w błonie żółtkowej w wybranym obszarze cewy nerwowej (Rysunek 3A).
  2. Dodać kroplę roztworu Ringera do zarodka. Należy zadbać o to, aby zarodek był całkowicie zanurzony w roztworze Ringera przez cały czas trwania procedury, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. W razie potrzeby dodawać kolejne krople roztworu Ringera na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.
  3. Używając wyciągniętej igły szklanej, ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne, odpowiadające długości i obszarowi zainteresowania w grzbietowej części cewy nerwowej. (Wyciągnięte igły szklane powstają z kapilarnych rurek ze szkła krzemionkowego, które zostały rozciągnięte pod wpływem ciepła za pomocą wyciągarki do igieł). W przypadku przeszczepów jednostronnych nacięcia powinny sięgać jedynie do światła grzbietowej części cewy nerwowej, a w przypadku przeszczepów obustronnych nacięcia należy wykonać przez całą szerokość grzbietowej części cewy nerwowej. Następnie przeciąć obustronnie przestrzeń między grzbietową częścią cewy nerwowej a mezodermą paraksjalną.
  4. Ostrożnie oddzielić wycięty eksplant od cewy nerwowej, a następnie usunąć go z zarodka poprzez aspirację do szklanej mikropipety (Rysunek 3B).

4. Przygotowanie tkanki graftu dawcy

  1. Wybierz zarodek przepiórki o odpowiadającym stadium rozwoju. Przytrzymaj zarodek pęsetą AA, usuń błonę żółtkową i wycięty fragment cewy nerwowej o podobnej wielkości, zgodnie z opisem powyżej (3.3-3.4) (Rycina 3A'-B'). W zależności od potrzeb eksperymentu, region ten może być obszarem komplementarnym do cewy nerwowej gospodarza (kurczaka) lub pochodzić z innego odcinka osi rostro-kaudalnej. (Uwaga: w przypadku większych przeszczepów regionalnych, w tym pełnych przeszczepów cewy nerwowej, badacze mogą chcieć zastosować na tym etapie trawienie proteazą, aby usunąć przylegającą tkankę mezenchymalną z tkanki dawcy przed transplantacją. Jednakże w przypadku małych przeszczepów grzbietowej części cewy nerwowej we wczesnych stadiach, tak jak opisano tutaj, trawienie proteazą nie jest konieczne, ponieważ cewę nerwową można łatwo oddzielić od sąsiedniej mezenchymy za pomocą wyłącznie technik chirurgicznych.)

5. Przeszczepienie tkanki

  1. Odssać eksplant od dawcy do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera. Należy uważać, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  2. Przenieść eksplant w sąsiedztwo wyciętego obszaru u gospodarza (zarodka kurczaka). Za pomocą wyciągniętej szklanej igły zorientować eksplant i delikatnie wprowadzić go w miejsce ablacji (Rysunek 3C).
  3. Ostrożnie dodać kilka kropel roztworu Ringera do zarodka, aby zapobiec odwodnieniu. Należy uważać, aby nie zakraplać płynu bezpośrednio na miejsce przeszczepu, ponieważ może to spowodować jego przemieszczenie.
  4. Uszczelnić okno taśmą pakową. Upewnić się, że taśma szczelnie zakrywa cały obszar wyciętego okna w skorupce jaja. Zapobiega to odwodnieniu i kontaminacji zarodka podczas późniejszej inkubacji.
  5. Przenieść jajo z powrotem do inkubatora aż do osiągnięcia pożądanego stadium. Upewnić się, że funkcja kołysania („rocking”) jest wyłączona podczas inkubacji chimer. Jaja można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, co może zwiększyć ich żywotność w przypadku planowania późniejszych etapów rozwoju.

6. Przygotowanie embrionów chimerycznych do sekcjonowania

  1. W punkcie końcowym eksperymentu odetnij taśmę zakrywającą okno za pomocą precyzyjnych nożyczek.
  2. Chwyć krawędź blastodermy zakrzywioną pęsetą irydową (najłatwiej wykonać to pęsetą z ząbkowanymi końcówkami), a następnie oddziel zarodek od żółtka, wykonując 4 szerokie cięcia poza granicami blastodermy.
  3. Przenieś zarodek do szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera. Należy zadbać o zminimalizowanie kontaktu zarodka z powietrzem, aby uniknąć odwodnienia tkanki.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie oddziel błonę żółtkową od blastodermy za pomocą pęsety nr 5.
  5. Starannie ułóż zarodek w szalce tak, aby zachował tę samą orientację, którą miał w jajku, z płasko rozłożonymi błonami otaczającymi.
  6. Używając igieł sekcyjnych wykonanych z drutów wolframowych64, precyzyjnie usuń otaczającą blastodermę z zarodka, ustawiając igłę na granicy zarodka i tkanek pozazarodkowych, tak aby drut wolframowy był równoległy do dna szalki. Do przecięcia tkanek stosuj delikatny ruch piłujący.
  7. Ostrożnie usuń błonę owodni pęsetą nr 5. Na tym etapie można przystąpić do dalszej sekcji obszaru zainteresowania lub pozostawić zarodek w całości.
  8. Przenieś zarodek do lodowatego 4% paraformaldehydu i inkubuj na kołysce przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotuj próbki i zatop je w celu wykonania skrawków krio- lub parafinowych.

Śledzenie przeszczepionej tkanki w embrionie gospodarza. Istnieje kilka technik identyfikacji tkanki przepiórczej w embrionie kurczaka, w tym wykrywanie jąderek przepiórczych za pomocą barwienia hematoksyliną (jądra przepiórkowe mają znacznie większe, ciemniej barwiące się inkluzje niż jądra kurczaka), reakcję Feulgena-Rossenbecka, barwienie pomarańczową akrydyną lub biz-benzamidem w połączeniu z mikroskopią elektronową lub immunoznakowanie antygenów specyficznych dla przepiórki3,47,65,66. W niniejszej procedurze wykorzystujemy antygen QCPN oraz standardowe techniki immunofluorescencji preparatów całych lub przekrojów tkankowych w celu identyfikacji komórek grzebienia neuronalnego przepiórki w chimerach przepiórka-kurczak (Rycina 4). Technika ta zapewnia największą elastyczność w projekcie eksperymentalnym, ponieważ immunofluorescencję QCPN można łączyć z innymi przeciwciałami w celu identyfikacji zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki dawcy (przepiórki). Należy zastosować standardowe techniki immunofluorescencji preparatów całych lub przekrojów tkankowych, aby oznakować komórki pochodzące od przepiórki w chimerach.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny obraz obszaru przeszczepionego rurki neuralnej po 6 h ponownej inkubacji (do stadium HH11) wykazuje oczekiwaną inkorporację przeszczepionej tkanki dawcy (przepiórki) do rurki neuralnej biorcy (kurczaka) (Rycina 4A). Zarodki wykazujące niepełną integrację przeszczepu lub asymetryczny rozwój regionu czaszkowego bądź somitów po ponownej inkubacji powinny zostać odrzucone.

Przekrój poprzeczny przez obszar przeszczepu w stadium HH11 pokazuje komórki NCC znakowane HNK-1, migrujące bocznie od rurki neuralnej. Komórki przepiórki tworzące strumień migracyjny NCC oraz rurkę neuralną są wyraźnie znakowane QCPN (Rycina 4B).

Na późniejszych etapach można prześledzić migrację komórek pochodzących z NCC przepiórnika do ich docelowej tkanki. Komórki znakowane QCPN są rozproszone w mezenchymie wyrostka szczękowego embrionu kurczaka w dniu E5 (Rysunek 4C).

Przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami, aby badać różnicowanie komórek NCC pochodzenia przepiórczego w środowisku gospodarza. Neurony sensoryczne nerwu trójdzielnego pochodzące z NCC przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN i Tuj1 (Rysunek 4D).

Układ chimery kurczętno-przepiórczej; schemat i narzędzia do eksperymentu z transplantacją embrionów.
Rysunek 1. Przegląd procedury eksperymentalnej i niezbędnych narzędzi. A) Embriony biorcy (kurczę) i dawcy (przepiórka) powinny znajdować się na tym samym etapie rozwoju. W celu znakowania strumienia NCC, który przyczynia się do powstania zwoju trójdzielnego oraz obszaru szczękowo-żuchwowego, idealny jest etap HH9. W fazie HH9 cewka neuralna zaczyna się zamykać w obszarze rostralnym, ale nie jest jeszcze całkowicie szczelna. Szara linia na schematach reprezentuje linię środkową zamykającej się cewki neuralnej. Białe linie przerywane wskazują linie cięcia służące do wycięcia obszaru śródmózgowia z prawej strony cewki neuralnej embrionów biorcy i dawcy. Wycięty fragment embrionu biorcy jest usuwany, a tkanka dawcy transplantowana w celu wytworzenia embrionu chimerycznego. B) Niezbędne narzędzia obejmują: a) strzykawkę 5mL z igłą hipodermiczną 18½ G, b) strzykawkę 1 mL z igłą hipodermiczną 26½ G zgiętą pod kątem 45°, c) tusz chiński, d) przezroczystą taśmę pakową, e) pipetę szklaną z aparatem do pipetowania ustnego, f) szalkę Petriego 60 mm, g) pęsetę AA, h) zakrzywioną pęsetę irydową z ząbkowanymi końcówkami, i) pęsetę nr 5, j) precyzyjne nożyczki, k) zaostrzony drut wolframowy, l) wyciągniętą igłę szklaną, m) kwadraty z parafilmu.

Schemat wstrzykiwania w embrion, znakowanie tuszem indyjskim, schemat struktury żółtka w skorupce jaja i wynik.
Rycina 2. Przygotowanie jaj i embrionów. A) Schemat przekroju jaja, zawierający optymalny punkt wprowadzenia igły hipodermicznej 18½ G w celu odessania albuminy lekkiej. B) Po odessaniu ok. 3mL albuminy lekkiej, żółtko i embrion opadają wewnątrz jaja, co umożliwia badaczom wycięcie „okienka” (strzałki) w skorupce jaja w celu uzyskania dostępu do embrionu. Następnie pod blastodermę można wstrzyknąć tusz indyjski, rozcieńczony 1:10 w sterylnym roztworze Ringera, aby zapewnić kontrast ułatwiający określenie stadium rozwoju embrionów. C) Embrion kurczaka po naniesieniu tuszu.

Schemat rozwoju zarodka kury i przepiórki; chimeryczne stadia HH9; błona żółtkowa, błony pozazarodkowe.
Rycina 3. Schemat i przykłady zarodków dawcy i biorcy w stadium HH9 na każdym etapie procedury przeszczepiania. A) Zarodek kury jako biorca. Linie przerywane na schemacie wskazują miejsce, w którym należy przerwać błonę żółtkową, aby uzyskać dostęp do regionu głowowego w celu wykonania przeszczepu. Po przerwaniu trójkątna klapa błony żółtkowej powinna zostać odwarstwiona w kierunku ogonowym. Ramka na zdjęciu wskazuje fragment powiększony w (B-C). A') Zarodek przepiórki jako dawca. Zdjęcie przedstawia zarodek dawcy wyjęty z jaja i umieszczony w szalce Petriego w celu wycięcia tkanki do przeszczepu. Ramka na zdjęciu wskazuje fragment powiększony w (B'). Linie przerywane na schemacie (A') wskazują miejsce, w którym należy przeciąć błonę żółtkową i błonę żółtka, aby usunąć zarodek z jaja. B) Zarodek biorcy z wyciętym jednostronnie regionem śródmózgowia rurki neuralnej (białe strzałki), oczekujący na przeszczep. Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsce nacięć niezbędnych do wycięcia rurki neuralnej w regionie śródmózgowia. B') Zarodek dawcy z wyciętą tkanką grzbietowej rurki neuralnej (tkanka przeszczepowa wskazana czarnymi grotami strzałek). Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsce nacięć w zarodku przepiórki w celu wycięcia tkanki dawcy do jednostronnego przeszczepu w regionie śródmózgowia rurki neuralnej. C) Zarodek chimeryczny po przeszczepieniu eksplantatu grzbietowej rurki neuralnej przepiórki do regionu śródmózgowia kury.

Mikroskopia fluorescencyjna cewy nerwowej (NT) i zwojów wykazująca wzór barwienia QCPN, HNK-1 i DAPI.
Rycina 4. Immunofluorescencja wykrywająca swoisty dla przepiórnika antygen jądrowy QCPN w komórkach pochodzących od dawcy w embrionie chimerycznym. A) Obraz całego preparatu chimery HH11 (przeszczepionej w stadium HH9) wykazujący barwienie QCPN na czerwono oraz barwienie HNK-1 (markera migrujących NCC) na zielono. Powiększenie 10X, widok grzbietowy. B) Przekrój poprzeczny przez embrion z (A), wykazujący dodatnie pod kątem QCPN komórki pochodzące od przepiórnika w cewie nerwowej oraz migrujące NCC współbarwione HNK-1 (zielony). Powiększenie 40X. C) Przekrój poprzeczny przez wyrostek szczękowy chimery E5 (inkubowanej przez 3 dni po przeszczepie), wykazujący dodatnie pod kątem QCPN komórki pochodzące z NCC (czerwone), które zmigrowały z przeszczepionego obszaru cewy nerwowej do docelowej lokalizacji w embrionie. Powiększenie 10X. D) Przekrój przez chimerę E5 wykazujący wkład NCC pochodzących od przepiórnika do zwoju trójdzielnego (czerwony) i różnicowanie w neurony dodatnie pod kątem TuJ1 (zielony). Powiększenie 40X. *, NCCs, komórki grzebienia neuronalnego; MP, wyrostek szczękowy; NT, cewą nerwowa; TG, zwój trójdzielny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj przeszczepianie cewy nerwowej przepiórki do embrionów kurczaka jest prostą i niedrogą techniką śledzenia specyficznych subpopulacji migrujących NCC wywodzących się z różnych regionów wzdłuż osi rostro-kaudalnej21,67-69. Technika ta wykorzystuje łatwość dostępu do embrionów ptaków (w porównaniu do embrionów ssaków) i może być łączona z innymi metodami, takimi jak ablacja tkanek, wstrzykiwanie cząsteczek inhibitorowych lub manipulacje genetyczne poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych, aby e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom laboratorium Lwigale za krytyczne uwagi do manuskryptu. SLG jest wspierany przez stypendium Ruth L. Kirschstein NRSA z National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL jest wspierany przez National Eye Institute (EY018050).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jaja pisklątRóżne
jaja przepiórczeRóżne
inkubatory jaj (odczyt cyfrowy 1502 Inkubator sportowca z wilgotnością 110-120 V AC)figure-materials-1 Zaopatrzenie drobiu1502
Kleszcze AA Dumont, Inox Narzędziado nauki11210-10
Taśma klejącaDowolny dostawca
Zakrzywione kleszcze do tęczówkiFine Science Tools11065-07
Atrament indyjskiDowolny dostawca Rozwiązanie
długopisu/paciorkowca (penicylina, streptomycyna) VWR international101447-068
Przezroczysta taśma pakowaDowolny dostawca
Aparat do ciągnięcia igiełNarishige InternationalPE-21
Igła ze szkła ciągnionego, wykonana z rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego 1,5-1,8 x 100 mmKimble Chase34500 99
Pipeta ze szkła ciągnionego, wykonana z 5¾ " Pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-6A
Aparat do pipet doustnych (zespół rurki aspiratora do skalibrowanej pipety mikrokapilarnej)Sigma-AldrichA5177-52A
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-30
Drut wolframowy, średnica 0,1 mmVWR internationalAA10404-H2
Uchwyty na igły (trzpień niklowany posiadacz)Fine Science Tools26018-17
QCPN antisurowicaBadania rozwojowe Hybridoma BankQCPN
Alexa Fluor przeciwciało wtórne (np. Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1)InvitrogenA21125
Ringer' s Roztwór (2L):
  • 14,4 g NaCl
  • 0,34g CaCl2
  • 0,74g KCl
  • 0,230 g Na2HPO4
  • 0,04g KH2PO4
  • ddH2O do 2L
  • Filtr i autoklaw
Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-4
  • 7778-77-0 li>
o naprawach epoksydowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chimera z piskl cia przepi rkitransplantacja rurki neuralnejznakowanie przeciwcia em QCPNmikroskopia immunofluorescencyjnaprzeszczep homotopowyprzeszczep heterotopowyo rostralno kaudalnadost p do zarodka ptakaledzenie linii kom rkowych

Powiązane artykuły