Artykuł metodologiczny

Analiza migracji i różnicowania grzebieni nerwowych przez przeszczep międzygatunkowy

DOI:

10.3791/3622

⸱

7 lutego 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu komórek grzebienia nerwowego ptaków w zarodkach chimerycznych piskląt przepiórczych. Metoda ta jest prostą i nieskomplikowaną techniką śledzenia komórek grzebienia nerwowego podczas migracji i różnicowania, które w przeciwnym razie są trudne do odróżnienia w niezmanipulowanym zarodku pisklęcia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ptasie embriony stanowią unikalną platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców, dzięki łatwemu dostępowi do zarodków w jaju. Chimeryczne zarodki ptaków, w których tkanka dawcy przepiórki jest przeszczepiana do zarodka pisklęcia in ovo, łączą w sobie moc nieusuwalnego znakowania genetycznego populacji komórek z łatwością manipulacji prezentowaną przez zarodek ptaka.

Chimery piskląt przepiórczych są klasycznym narzędziem do śledzenia migrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC)1-3. NCC to przejściowa migrująca populacja komórek w zarodku, która pochodzi z grzbietowej części rozwijającej się cewy nerwowej4. Przechodzą przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, a następnie migrują do innych regionów zarodka, gdzie różnicują się w różne typy komórek, w tym chrząstki5-13, melanocyty11,14-20, neurony i glej21-32. NCC są multipotencjalne, a na ich ostateczny los ma wpływ 1) obszar cewy nerwowej, w którym powstają, wzdłuż osi ostro-ogonowej zarodka11,33-37, 2) sygnały z sąsiednich komórek podczas migracji38-44 oraz 3) mikrośrodowisko ich ostatecznego miejsca przeznaczenia w zarodku45,46. Prześledzenie tych komórek od punktu ich pochodzenia w cewie nerwowej, aż do ich ostatecznego położenia i losu w zarodku, dostarcza ważnych informacji na temat procesów rozwojowych, które regulują wzorce i organogenezę.

Przeszczepienie komplementarnych regionów cewy nerwowej dawcy (przeszczep homotopowy) lub różnych regionów cewy nerwowej dawcy (przeszczep heterotopowy) może ujawnić różnice w wstępnej specyfikacji NCC wzdłuż osi ostro-ogonowej2,47. Technika ta może być dalej zaadaptowana do przeszczepienia jednostronnego przedziału cewy nerwowej, tak aby jedna strona pochodziła z tkanki dawcy, a strona przeciwległa pozostaje niezakłócona w zarodku gospodarza, co daje kontrolę wewnętrzną w tej samej próbce2,47. Może być również przystosowany do przeszczepiania segmentów mózgu w późniejszych zarodkach, po HH10, gdy przednia cewa nerwowa została zamknięta47.

Tutaj przedstawiamy techniki generowania chimer piskląt przepiórczych poprzez przeszczep cewy nerwowej, które pozwalają na śledzenie migrujących NCC pochodzących z dyskretnego segmentu cewy nerwowej. Specyficzne dla gatunku znakowanie komórek pochodzących od dawcy za pomocą specyficznego dla przepiórki przeciwciała QCPN48-56 pozwala badaczowi odróżnić komórki dawcy i gospodarza w eksperymentalnym punkcie końcowym. Technika ta jest prosta, niedroga i ma wiele zastosowań, w tym mapowanie losu, śledzenie linii komórkowych i identyfikowanie zdarzeń wstępnych wzdłuż osi rostro-ogonowej45. Ze względu na łatwość dostępu do ptasiego zarodka, technika przeszczepu piskląt przepiórczych może być łączona z innymi manipulacjami, w tym między innymi z ablacją soczewek40, wstrzykiwaniem cząsteczek hamujących57,58 lub manipulacją genetyczną poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych59-61, w celu zidentyfikowania odpowiedzi poszczególnych strumieni migracyjnych NCC na zaburzenia w programie rozwojowym zarodka. Co więcej, ta technika szczepienia może być również wykorzystana do generowania innych międzygatunkowych zarodków chimerycznych, takich jak chimery przepiórki i kaczki w celu zbadania udziału NCC w morfogenezie twarzoczaszki lub chimery piskląt myszy, aby połączyć moc genetyki myszy z łatwością manipulacji zarodkiem ptaków. 62 TGLI

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wysiaduj jaja piskląt i przepiórczych do pożądanego etapu

Dla zarodków HH9 typowy czas inkubacji wynosi od 29 do 33 godzin w temperaturze 38 °C.63

  1. Umyj wszelkie zanieczyszczenia z jajek letnią wodą.
  2. Ułóż jaja kurze na tacy poziomo. Zaznacz ołówkiem stronę skierowaną do góry; Będzie to odpowiadać regionowi, w którym zostanie zlokalizowany zarodek. Wysiaduj jaja przepiórcze do końca.
  3. Umieścić w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 38 °C. Włącz funkcję bujania.

2. Przygotuj jajka do okienkowania i sekcji

  1. Wyjmij jaja z inkubatora i wysterylizuj wierzchołki 70% etanolem. Najlepiej spryskać etanol i szybko go wytrzeć ręcznikiem papierowym lub Kimwipe, aby uniknąć wchłaniania etanolu przez skorupkę jajka.
  2. Umieść jajko kurze na indywidualnym uchwycie na jajka (używamy szalki Petriego wyłożonej złożonymi ręcznikami papierowymi, np. "Kimwipes"). Za pomocą kleszczy AA wbij mały otwór w górną powierzchnię skorupki jajka na spiczastym końcu jajka.
  3. Usuń 1,5-3 ml lekkiej albuminy z jaja kurzego za pomocą igły podskórnej 181/2 G i strzykawki 5 ml. Najlepiej jest włożyć igłę pionowo do otworu, skosem skierowanym w stronę spiczastego końca jajka (ryc. 2A). W ten sposób, gdy albumina jest odstawiana, istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego uszkodzenia żółtka poprzez odsysanie. Wyrzuć albuminę. Ten krok obniży żółtko i zarodek w jaju, aby umożliwić otwarcie okienka w skorupce jajka.
  4. Przetrzyj otwór 70% etanolem, jak opisano powyżej, i uszczelnij go taśmą klejącą. Ważne jest, aby skorupka jajka otaczająca otwór była całkowicie pozbawiona albuminy i sucha, w przeciwnym razie klej nie będzie się uszczelniał.
  5. Za pomocą kleszczy AA wbij kolejny otwór w zaznaczoną górną powierzchnię poziomego jaja, nie do końca na wierzchołku. Uważaj, aby kleszcze nie przechodziły zbyt głęboko przez skorupkę jajka, aby uniknąć uszkodzenia żółtka lub zarodka.
  6. Włóż jedną stronę zakrzywionych kleszczyków tęczówki do otworu równoległego do skorupki jaj. Szczypanie skorupki, pracując okrężnymi ruchami, aby rozbić okienko o średnicy ~2 cm w skorupce jaja kurzego. Wyrzuć usuniętą skorupkę jajka. Alternatywnie przykryj górną powierzchnię jajka taśmą pakową i użyj nożyczek, aby wyciąć okno. Minimalizuje to ryzyko wpadnięcia resztek skorupki jajka do jajka. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty krążek na wierzchu żółtka. Wyrzuć wszelkie niezapłodnione jaja (rozpoznane po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy).
  7. Wstrzyknąć niewielką ilość tuszu indyjskiego (rozcieńczonego w stosunku 1:10 w sterylnym roztworze Ringera zawierającym antybiotyk "Pen/Strep": końcowe stężenie 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) pod blastodermą, aby pomóc w ocenie stopnia zarodka. Użyć strzykawki o pojemności 1 ml i igły podskórnej o pojemności 261/2 g, zgiętej pod kątem 45° u podstawy igły, ze skosem skierowanym do góry; alternatywnie można użyć pipety Pasteura z wyciąganego szkła i aparatu do pipetowania do ust (nosić okulary ochronne podczas zginania igły podskórnej lub łamania igły szklanej). Nakłuć błonę żółtkową na zewnątrz obwodu blastodermy i wsunąć końcówkę igły pod zarodek, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwach zarodkowych (ryc. 2B). Wstrzyknąć tylko tyle atramentu, aby obrysować zarodek, a następnie ostrożnie wyjąć igłę (ryc. 2C). Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości atramentu może prowadzić do śmierci zarodka. Ważne jest, aby nie wstrzykiwać żadnych pęcherzyków powietrza pod zarodek, ponieważ może to być źródłem zanieczyszczenia. Uwaga: Cały roztwór Ringera używany w tej procedurze jest sterylizowany i zawiera Pen/Strep, jak zdefiniowano powyżej. Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) jest również akceptowalną alternatywą dla roztworu Ringera na wszystkich etapach tego protokołu.
  8. Etap zarodka zgodnie z Hamburgerem i Hamiltonem63 i zapisz etap na skorupce jajka w trwałym tuszu lub ołówku. Etapy najlepiej oceniać pod mikroskopią stereoskopową, ze światłowodowymi źródłami światła typu "gęsia szyja", które mają ograniczone obciążenie cieplne.
  9. Nałóż 2-3 krople ciepłego, sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię zarodka, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu. Tymczasowo uszczelnij okno parafolią rozciągniętą na powierzchni jaja.
  10. Powtórz kroki 2.2-2.9 ze wszystkimi jajami piskląt przed rozpoczęciem eksperymentów z przeszczepem.
  11. Ponieważ zarodki przepiórek są wykorzystywane wyłącznie do tkanek dawcy, w procesie in ovo kroki 2.2–2.9 można pominąć. W celu przygotowania zarodków dawcy ex ovo, jaja przepiórcze są inkubowane stroną do góry i otwierane w tym obszarze za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić zarodek. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery nacięcia w kształcie kwadratu przez błonę witeliny i blastodermę na zewnątrz zarodka (upewnij się, że wszystkie nacięcia się spotykają). Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki delikatnie chwyć jedną odciętą krawędź i wyjmij zarodek z jaja i przenieś go do roztworu Ringersa na szalce Petriego. Alternatywnie można użyć zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, aby podnieść wycięty zarodek od spodu, lub można użyć łyżki do zarodków lub plastikowej pipety transferowej przeciętej przez szerszą część cylindra, aby przenieść zarodek z komórki jajowej. Delikatnie usuń membranę witeliny za pomocą kleszczy #5. Zbierz pozostałe zarodki przepiórcze jak powyżej i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym.

3. Przygotuj zarodek gospodarza do przyjęcia przeszczepu

  1. Usuń parafilm z zarodka gospodarza (pisklęcia) i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej lub kleszczy #5 rozerwij mały otwór w błonie witeliny w żądanym obszarze cewy nerwowej (ryc. 3A).
  2. Dodaj kroplę roztworu Ringera do zarodka. Należy zadbać o to, aby zarodek był całkowicie zanurzony w roztworze Ringera podczas całego zabiegu, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. W razie potrzeby należy dodawać krople roztworu Ringera na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.
  3. Za pomocą wyciągniętej szklanej igły ostrożnie wykonaj nacięcia poprzeczne rostralne i ogonowe odpowiadające długości i obszarowi zainteresowania w grzbietowej cewie nerwowej. (Wyciągane szklane igły są generowane z kapilarnych rurek ze szkła silikonowego, które zostały naciągnięte pod wpływem ciepła za pomocą aparatu do wyciągania igieł.) W przypadku przeszczepów jednostronnych nacięcia powinny sięgać tylko do światła grzbietowej cewy nerwowej, a w przypadku przeszczepów dwustronnych należy wykonać nacięcia w poprzek całej grzbietowej cewy nerwowej. Następnie przeciąć obustronnie między grzbietową cewą nerwową a mezodermą przyosiową.
  4. Ostrożnie oddzielić wycięty eksplant od cewy nerwowej, a następnie usunąć go z zarodka, zasysając go do szklanej mikropipety (ryc. 3B).

4. Przygotuj tkankę przeszczepu dawcy

  1. Wybierz zarodek przepiórki dopasowany do etapu. Przytrzymaj zarodek kleszczami AA, usuń błonę witelinową i wytnij obszar cewy nerwowej o podobnej wielkości, jak opisano powyżej (3.3-3.4) (Ryc. 3A'-B'). W zależności od potrzeb eksperymentu, region ten może być regionem uzupełniającym cewy nerwowej gospodarza (pisklęcia) lub z innego regionu wzdłuż osi ostro-ogonowej. (Uwaga: w przypadku większych przeszczepów regionalnych, w tym pełnych przeszczepów cewy nerwowej, naukowcy mogą chcieć dodać trawienie proteazy na tym etapie, aby usunąć wszelkie przylegające tkanki mezenchymalne z tkanki dawcy przed przeszczepem. Jednak w przypadku małych przeszczepów grzbietowej cewy nerwowej we wczesnych stadiach, jak opisano tutaj, trawienie proteazy nie jest konieczne, ponieważ cewę nerwową można łatwo oddzielić od sąsiedniej mezenchymy za pomocą ściśle chirurgicznych technik).

5. Przeszczep tkankę

  1. Odessać eksplant dawcy do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do pipety.
  2. Przenieś eksplant przylegający do wyciętego obszaru żywiciela pisklęcia. Za pomocą wyciągniętej szklanej igły zorientuj eksplant i delikatnie wprowadź go do obszaru ablacji (ryc. 3C).
  3. Ostrożnie dodaj kilka kropli roztworu Ringera do zarodka, aby zapobiec odwodnieniu. Należy uważać, aby nie upuszczać płynu bezpośrednio na miejsce przeszczepu, ponieważ może to spowodować przemieszczenie przeszczepu.
  4. Uszczelnij okno taśmą pakową. Upewnij się, że taśma uszczelnia cały obszar jaja z okienkiem. Zapobiega to odwodnieniu i zanieczyszczeniu zarodka podczas późniejszej inkubacji.
  5. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze do pożądanego etapu. Upewnij się, że funkcja "kołysania" jest wyłączona podczas inkubacji chimer. Jaja można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, ponieważ może to zwiększyć ich żywotność, jeśli ukierunkowane są na późniejsze etapy rozwoju.

6. Przygotowanie chimerycznych zarodków do sekcji

  1. W punkcie końcowym eksperymentu odetnij taśmę zakrywającą okno za pomocą cienkich nożyczek.
  2. Chwyć krawędź blastodermy zakrzywionymi kleszczami tęczówki (najłatwiej zrobić to za pomocą ząbkowanych końcówek), a następnie odetnij zarodek od żółtka za pomocą 4 dużych nacięć poza granicami blastodermy.
  3. Przenieść zarodek na szalkę Petriego zawierającą roztwór Ringera. Należy uważać, aby zminimalizować narażenie zarodka na działanie powietrza, aby uniknąć odwodnienia tkanki.
  4. Pod mikroskopią stereoskopową delikatnie oddziel błonę witelinową od blastodermy za pomocą kleszczy #5.
  5. Ostrożnie ułóż zarodek w naczyniu tak, aby zarodek był w tej samej orientacji, co w jaju, z otaczającymi błonami ułożonymi płasko.
  6. Użyj igieł preparacyjnych wykonanych z drutów wolframowych64, aby czysto usunąć otaczającą blastodermę z zarodka, układając igłę na granicy zarodka i tkanek pozazarodkowych, tak aby długość drutu wolframowego była równoległa do dna naczynia. Użyj delikatnego ruchu piłowania, aby przeciąć tkanki.
  7. Ostrożnie usuń owodnię za pomocą kleszczy #5. W tym momencie możesz chcieć albo dokładniej przeanalizować obszar swojego zainteresowania, albo pozostawić zarodek w całości.
  8. Przenieś zarodek do lodowatego 4% paraformaldehydu i rozbujaj przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotuj próbki i zatapiaj je w celu cięcia krio- lub parafinowego.

Śledź przeszczepioną tkankę w zarodku gospodarza. Istnieje kilka technik identyfikacji tkanki przepiórczej w zarodku pisklęcia, w tym wykrywanie jąder przepiórczych przez barwienie hematoksyliną (jądra przepiórek mają bardzo duże, ciemniejsze inkluzje barwiące niż jądra piskląt), reakcję Feulgena-Rossenbecka, barwienie akrydyną-pomarańczą lub biz-benzamidem w połączeniu z mikroskopią elektronową lub znakowanie immunologiczne antygenów specyficznych dla przepiórki3,47,65,66. Tutaj używamy antygenu QCPN i standardowych technik immunofluorescencji całego wierzchowania lub przekroju do identyfikacji komórek grzebienia nerwowego przepiórki w chimerach przepiórek i piskląt (ryc. 4). Technika ta zapewnia największą elastyczność w projektowaniu eksperymentalnym, ponieważ immunofluorescencja QCPN może być również łączona z innymi przeciwciałami w celu identyfikacji zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki dawcy (przepiórki). Użyj standardowych technik immunofluorescencji całego wierzchowca lub przekroju, aby oznaczyć komórki pochodzące z przepiórki w chimerach.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny obraz przeszczepionego obszaru cewy nerwowej po 6 godzinach od ponownej inkubacji (do HH11) pokazuje oczekiwane włączenie przeszczepionej tkanki dawcy (przepiórki) do cewy nerwowej gospodarza (pisklęcia) (Rysunek 4A). Zarodki wykazujące niepełną integrację przeszczepu lub asymetryczny rozwój okolicy czaszki lub somity po reinkubacji należy odrzucić.

Przekrój przez przeszczepiony obszar w HH11 pokazuje NCC oznaczone HNK-1 migrujące bocznie od cewy nerwowej. Komórki przepiórcze przyczyniające się do strumienia migracyjnego NCC i cewy nerwowej są wyraźnie oznaczone QCPN (ryc. 4B).

Na późniejszych etapach, komórki pochodzące z NCC przepiórczych mogą być śledzone aż do ich końcowej tkanki docelowej. Komórki znakowane QCPN są przeplatane w mezenchymie zarodka pisklęcia wyrostka szczękowego w E5 (ryc. 4C).

Przeciwciało QCPN można łatwo połączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania NCC pochodzących od przepiórek w środowisku gospodarza. Przepiórcze neurony czuciowe pochodzące z NCC są znakowane przeciwciałami QCPN i Tuj1 (ryc. 4D).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Przegląd procedury eksperymentalnej i niezbędnych instrumentów. A) Zarodki gospodarza (pisklęcia) i dawcy (przepiórki) powinny być dopasowane do stadium zaawansowania. Aby oznaczyć strumień NCC, który przyczynia się do zwoju nerwu trójdzielnego i okolicy szczękowo-żuchwowej, HH9 jest idealny. W HH9 cewa nerwowa zaczyna się zamykać w obszarze rostralnym, ale nie jest jeszcze całkowicie uszczelniona. Szara linia na diagramach reprezentuje linię środkową zamykającej cewy neuronowej. Przerywane białe linie wskazują linie cięcia do wycięcia obszaru śródmózgowia po prawej stronie cewy nerwowej z zarodków gospodarza i dawcy. Wycięty obszar zarodka gospodarza jest odrzucany, a tkanka dawcy przeszczepiana w celu wytworzenia chimerycznego zarodka. B) Niezbędne instrumenty to: a) strzykawka 5 ml z igłą podskórną 181/2 G, b) strzykawka 1 ml z igłą podskórną 261/2 G zgiętą pod kątem 45°, c) tusz indyjski, d) przezroczysta taśma pakowa, e) szklana pipeta z aparatem do pipetowania doustnego, f) szalka Petriego 60 mm, g) kleszczyki AA, h) zakrzywione kleszczyki do tęczówki z ząbkowanymi końcówkami, i) #5 kleszczy, j) cienkie nożyczki, k) zaostrzony drut wolframowy, l) ciągnięta szklana igła, m) kwadraty parafilmowe.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Przygotowanie komórek jajowych i zarodków. A) Schemat przekroju poprzecznego komórki jajowej, w tym idealny punkt wprowadzenia igły podskórnej 181/2 G do pobrania albuminy światła. B) Po pobraniu ~ 3 ml lekkiej albuminy, żółtko i zarodek obniżają się w jaju, umożliwiając naukowcom wycięcie "okna" (strzałek) w skorupce jaja, aby uzyskać dostęp do zarodka. Atrament indyjski, rozcieńczony w stosunku 1:10 w sterylnym roztworze Ringera, może być następnie wstrzyknięty pod blastodermę, aby zapewnić kontrast dla łatwej oceny zarodków. C) Zarodek pisklęcia po farbowaniu.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Schemat i przykłady zarodków dawcy i gospodarza HH w stadium 9 na każdym etapie procedury szczepienia. A) Zarodek gospodarza pisklęcia. Linie przerywane na schemacie wskazują, gdzie należy rozerwać błonę witelinową, aby uzyskać dostęp do obszaru czaszki w celu szczepienia. Po zerwaniu trójkątny płat błony witelinowej należy odkleić doogonowo. Pole na obrazie oznacza wstawkę użytą w (B-C). A') Zarodek dawcy przepiórki. Zdjęcie przedstawia zarodek dawcy wycięty z komórki jajowej i umieszczony na szalce Petriego w celu wypreparowania przeszczepionej tkanki. Pole na obrazie oznacza wstawkę użytą w (B'). Linie przerywane na schemacie (A') wskazują miejsce, w którym należy przeciąć błony witeliny i żółtka w celu usunięcia zarodka z komórki jajowej. B) Zarodek gospodarza z jednostronnym obszarem śródmózgowia cewy nerwowej wyciętym (białe strzałki) oczekującym na przeszczep. Przerywana linia na schemacie ideowym wskazuje, gdzie należy wykonać nacięcia, aby wyciąć cewę nerwową w okolicy śródmózgowia. B') Zarodek dawcy z wyciętą tkanką przeszczepu grzbietowej cewy nerwowej (tkanka przeszczepiona oznaczona czarnymi grotami strzałek). Przerywana linia na schemacie wskazuje, gdzie należy wykonać nacięcia w zarodku przepiórki w celu wycięcia tkanki dawcy w celu jednostronnego przeszczepu obszaru śródmózgowia cewy nerwowej. C) Zarodek chimeryczny po wszczepieniu eksplantatu grzbietowej cewy nerwowej przepiórki w okolicę śródmózgowia pisklęcia.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Immunofluorescencja wykrywająca specyficzny dla przepiórki antygen jądrowy QCPN w komórkach pochodzących od dawcy w zarodku chimerycznym. A) Całościowy obraz chimery HH11 (przeszczepionej w HH9) pokazujący barwienie QCPN na czerwono i barwienie HNK-1 (marker migrujących NCC) na zielono. 10-krotne powiększenie, widok grzbietowy. B) Przekrój przez zarodek w (A), pokazujący komórki pochodzące z przepiórki QCPN-dodatnie w cewie nerwowej i migrujące NCC zabarwione HNK-1 (zielony). 40-krotne powiększenie. C) Przekrój przez wyrostek szczękowy chimery E5 (inkubowanej przez 3 dni po przeszczepie), pokazujący komórki pochodzące z NCC z dodatnim wynikiem QCPN (kolor czerwony), które migrowały z przeszczepionego obszaru cewy nerwowej do swojej ostatecznej lokalizacji w zarodku. 10-krotne powiększenie. D) Przekrój przez chimerę E5 pokazujący udział NCC pochodzącego z przepiórki w zwoju nerwu trójdzielnego (czerwony) i różnicowanie się w neurony TuJ1-dodatnie (zielony). 40-krotne powiększenie. *, NCC; MP, wyrostek szczękowy; NT, cewa nerwowa; TG, zwój nerwu trójdzielnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj szczepienie cewy nerwowej przepiórki do zarodków piskląt gospodarza jest prostą i niedrogą techniką śledzenia określonych subpopulacji migrujących NCC pochodzących z różnych regionów wzdłuż osi rostro-ogonowej21,67-69. Technika ta wykorzystuje łatwość dostępu do zarodków ptaków (w porównaniu z zarodkami ssaków) i może być łączona z innymi technikami, takimi jak ablacja tkanek, wstrzykiwanie cząsteczek hamujących lub manipulacja genetyczna poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych, w celu eks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom laboratorium Lwigale za krytykę manuskryptu. SLG jest wspierane przez stypendium Ruth L. Kirschstein NRSA z National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL jest wspierany przez National Eye Institute (EY018050).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jaja pisklątRóżne
jaja przepiórczeRóżne
inkubatory jaj (odczyt cyfrowy 1502 Inkubator sportowca z wilgotnością 110-120 V AC)figure-materials-1 Zaopatrzenie drobiu1502
Kleszcze AA Dumont, Inox Narzędziado nauki11210-10
Taśma klejącaDowolny dostawca
Zakrzywione kleszcze do tęczówkiFine Science Tools11065-07
Atrament indyjskiDowolny dostawca Rozwiązanie
długopisu/paciorkowca (penicylina, streptomycyna) VWR international101447-068
Przezroczysta taśma pakowaDowolny dostawca
Aparat do ciągnięcia igiełNarishige InternationalPE-21
Igła ze szkła ciągnionego, wykonana z rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego 1,5-1,8 x 100 mmKimble Chase34500 99
Pipeta ze szkła ciągnionego, wykonana z 5¾ " Pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-6A
Aparat do pipet doustnych (zespół rurki aspiratora do skalibrowanej pipety mikrokapilarnej)Sigma-AldrichA5177-52A
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-30
Drut wolframowy, średnica 0,1 mmVWR internationalAA10404-H2
Uchwyty na igły (trzpień niklowany posiadacz)Fine Science Tools26018-17
QCPN antisurowicaBadania rozwojowe Hybridoma BankQCPN
Alexa Fluor przeciwciało wtórne (np. Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1)InvitrogenA21125
Ringer' s Roztwór (2L):
  • 14,4 g NaCl
  • 0,34g CaCl2
  • 0,74g KCl
  • 0,230 g Na2HPO4
  • 0,04g KH2PO4
  • ddH2O do 2L
  • Filtr i autoklaw
Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-4
  • 7778-77-0 li>
o naprawach epoksydowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chimera z piskl cia przepi rkitransplantacja rurki neuralnejznakowanie przeciwcia em QCPNmikroskopia immunofluorescencyjnaprzeszczep homotopowyprzeszczep heterotopowyo rostralno kaudalnadost p do zarodka ptakaledzenie linii kom rkowych

Powiązane artykuły