Wysokoprzepustowa metoda wykrywania wirusa grypy

Summary

Ta metoda opisuje użycie systemu obrazowania opartego na barwniku w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płynie z płukania oskrzelików (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodologia ta może być wykonywana na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga objętości <10 μl badanego materiału i może potencjalnie prowadzić jednoczesne badania przesiewowe wielu patogenów.

Abstract

Wirus grypy jest patogenem układu oddechowego, który powoduje wysoki stopień zachorowalności i śmiertelności każdego roku w wielu częściach świata. W związku z tym precyzyjna diagnoza szczepu zakaźnego i szybkie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe ogromnej liczby próbek klinicznych mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się zakażeń pandemicznych. Obecne rozpoznania kliniczne zakażeń grypą opierają się na testach serologicznych, reakcji łańcuchowej polimerazy, immunofluorescencji próbki bezpośredniej i hodowli komórkowej ^1,2.

Tutaj informujemy o rozwoju nowej techniki diagnostycznej używanej do wykrywania żywych wirusów grypy. Użyliśmy ludzkiego wirusa A/PR/8/34 (PR8, H1N1) ^{przystosowanego} do myszy, aby przetestować skuteczność tej techniki przy użyciu komórek MDCK ⁴. Komórki MDCK (10,⁴ lub 5 x 10,³ na dołek) hodowano na płytkach 96- lub 384-dołkowych, zakażono PR8, a białka wirusowe wykryto za pomocą anty-M2, a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem IR. M2 ⁵ i hemaglutynina ¹ to dwa główne białka markerowe stosowane w wielu różnych testach diagnostycznych. Zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem IR zminimalizowało autofluorescencję związaną z innymi barwnikami fluorescencyjnymi. Zastosowanie przeciwciała anty-M2 pozwoliło nam na wykorzystanie intensywności fluorescencji specyficznej dla antygenu jako bezpośredniego wskaźnika ilości wirusa. Do wyliczenia intensywności fluorescencji użyliśmy skanera IR opartego na LI-COR Odyssey. System ten wykorzystuje dwukanałową detekcję laserową w podczerwieni do identyfikacji fluoroforów i odróżniania ich od szumu tła. Pierwszy kanał wzbudza się przy długości fali 680 nm i emituje przy długości fali 700 nm, co pomaga w ilościowym określeniu tła. Drugi kanał wykrywa fluorofory, które wzbudzają się przy 780 nm i emitują przy 800 nm. Skanowanie komórek MDCK zakażonych PR8 w skanerze podczerwieni wykazało jasną fluorescencję zależną od miana wirusa. Konsekwentnie można było zaobserwować dodatnią korelację intensywności fluorescencji z mianem wirusa zaczynającym się od 10^{2-10 5} PFU. Minimalna, ale wykrywalna dodatniość konsekwentnie obserwowana w przypadku mian wirusa 10^{2-10 3} PFU PR8 wykazała wysoką czułość barwników bliskiej podczerwieni. Stosunek sygnału do szumu określono przez porównanie komórek MDCK zakażonych pozorowanym lub leczonych przeciwciałami izotypowymi.

Korzystając z intensywności fluorescencji z 96- lub 384-dołkowych płytek, skonstruowaliśmy standardowe krzywe miareczkowania. W tych obliczeniach pierwszą zmienną jest miano wirusa, a drugą intensywność fluorescencji. Dlatego wykorzystaliśmy rozkład wykładniczy do wygenerowania dopasowania krzywej w celu określenia wielomianowej zależności między mianami wirusów a intensywnością fluorescencji. Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że system wykrywania białek oparty na barwniku IR może pomóc w diagnozowaniu infekujących szczepów wirusowych i precyzyjnym określeniu miana infekujących patogenów.

Protocol

1. Hodowla komórek MDCK

1. Hodowla 5 milionów komórek MDCK przez noc w kolbie T-75^cm2 w 20 ml RPMI1640 kompletnej pożywki z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 0,001% β-merkaptoetanolu w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO₂ .

2. Zakażenie PR8 i pobieranie płynu BAL

1. Wyzwanie C57BL / 6 donosowo z 5,000 PFU wirusa PR8 w sterylnym PBS w całkowitej objętości 30 μl przez jedno nozdrze. Przeprowadzaj pozorowane infekcje przy użyciu tylko sterylnego PBS bez wirusa.
2. Poddaj myszy eutanazji 0, 2, 4 i 7 dni po zakażeniu i rozetnij klatkę piersiową i wykonaj 1 cm nacięcie równolegle do tchawicy przez futro myszy, aby je odsłonić.
3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na bliższej stronie tchawicy.
4. Napełnij tchawicę 0,5 ml PBS-1% BSA i odessaj płyn BAL. Płyny BAL można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Infekcja wirusowa i wykrywanie białka macierzy wirusowej (M2) za pomocą LI-COR Odyssey

1. Aby określić ilościowo miana wirusa za pomocą przeciwciał sprzężonych z barwnikiem podczerwonym, należy pobrać komórki MDCK z kolb T-75 cm² i umieścić je na optycznych czarnych 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem (10 000 komórek na dołek) lub 384-dołkowych (5 000 komórek na dołek). Hodować komórki MDCK przez noc w temperaturze 37 °C w RPMI1640 kompletnej pożywce i dwukrotnie przemyć bezsurowicowym DMEM zawierającym BSA (0,2% wagowo/objętościowo), penicylinę (100 j./ml), streptomycynę (100 μg/ml), pirogronian sodu (1 mM), roztwór wodorowęglanu sodu (5% z 7,5%) i β-merkaptoetanol (0,001%).
2. Inkubować komórki MDCK z płynem BAL (50 μl dla płytki 96-dołkowej lub 10 μl dla płytki 384-dołkowej) lub wirusem PR8 ze znanymi mianami w każdym dołku o równej objętości (50 μl dla płytki 96-dołkowej lub 10 μl dla płytki 384-dołkowej) pożywki DMEM, zawierającej trypsynę traktowaną L-1-tozyloamido-2-fenyloetyloketonem chlorometylowym (TPCK) (0,2 μg/ml).
3. Po 1 godzinie od zakażenia dodać 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) 10% RPMI1640 pożywki zawierającej FBS do każdej studzienki.
4. Kontynuować hodowlę komórek MDCK przez kolejne 16 godzin infekcji; przemyć komórki MDCK dwukrotnie 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) roztworu PBS-1% BSA i utrwalić 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) 1% paraformaldehydu przez 5 minut.
5. Po utrwaleniu inkubować komórki MDCK dalej przez 30 minut ze 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) PBS-1% BSA w celu zablokowania.
6. Po zablokowaniu inkubować komórki MDCK przez 1 godzinę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko białku M2 (1:1000, rozcieńczone w PBS-1% BSA). Użyj 50 μl na basenik i 20 μl rozcieńczonego przeciwciała na basenik odpowiednio w płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkowych.
7. Przemyć komórki MDCK trzykrotnie 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) 1% BSA zawierającej PBS i inkubować przez 1 godzinę z 50 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) koziego przeciwciała przeciw mysim IRDye@800 wtórnym (rozcieńczenie 1:200).
8. Przemyć komórki MDCK trzykrotnie 100 μl PBS zawierającego 1% BSA. Umieść witrażowe płytki na platformie szkła do czytania skanera podczerwieni LI-COR Odyssey i ustaw czytnik na odczyt płytki 96- lub 384-dołkowej.
9. Puste studzienki kontroli ujemnej można ustawić za pomocą oprogramowania LI-COR Odyssey. Określ ilościowo całą płytkę lub wybrane dołki w obrębie płytki za pomocą oprogramowania LI-COR Odyssey.
10. Korzystając z narzędzia Auto Shape Tool, narysuj granice obszaru docelowego (ROI) w środku dołka testowego z płytkami 96- lub 384-dołkowymi. Utworzenie zwrotu z inwestycji pozwala oprogramowaniu na porównanie zdefiniowanych studzienek tła z próbkami miareczkowanymi pod kątem wirusów.
11. Aby ustawić wartość bazową dla całego testu, użyj zwrotu z inwestycji w tle. Wprowadź dwa przeciwstawne krzyże nitkowate dostarczone przez oprogramowanie Odyssey w ROI, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w całej studni.
12. Skanuj płytki przy użyciu kanału 780 nm do detekcji i 680 nm jako referencyjnej długości fali w skanerze podczerwieni LI-COR Odyssey.
13. Po aktywacji polecenia "Odczyt" zmierzone zostaną natężenia fluorescencji w jednolitych odstępach czasu od zwrotu z inwestycji, a zebrane punkty danych zostaną zintegrowane. Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału powyżej linii bazowej, który jest uwzględniony w określaniu zwrotu z inwestycji.
14. Fluorescencja tła zostanie określona ilościowo na podstawie prób kontrolnych z imitacją zakażenia lub samego przeciwciała wtórnego i zostanie wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych.
15. Do obliczeń wybrano "intensywność zintegrowaną", ponieważ reprezentuje ona objętość pikseli netto dla zdefiniowanego pojedynczego punktu i jest niezależna od rozmiaru obiektu. Użyj krzywej standardowej ze znanych mian wirusów, aby obliczyć miana wirusa w nieznanych próbkach. Użyj długiej krzywej interpolacji, aby precyzyjnie obliczyć miana wirusa. Obliczyć miana wirusa w badanych próbkach, porównując intensywność badanych próbek z krzywą wzorcową.

4. Reprezentatywne wyniki

Standaryzacja wysokoprzepustowego systemu wykrywania wirusów opartego na barwniku IR

PR8 wirus może infekować komórki MDCK; dlatego użyliśmy tych komórek do opracowania tego testu. Zmierzyliśmy miana wirusa za pomocą pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku matrycy wirusa grypy (M2). W przeciwieństwie do innych metodologii, użyliśmy przeciwciała drugorzędowego, które jest sprzężone z barwnikiem bliskiej podczerwieni. Metoda ta zapewnia proste, zautomatyzowane oznaczanie miana wirusa PR8 przy użyciu intensywności fluorescencji, która jest generowana podczas wykrywania białka M2. Po zakażeniu wirusem grypy białko M2 ulega translacji, transportowi i gromadzi się w komórce gospodarza, w tym na powierzchni komórki. Zatem ilość białka M2 stanowi mierzalny parametr określający ilość wirusa. Porównanie intensywności z badanych próbek z krzywą wzorcową zapewnia precyzyjny pomiar miana wirusa.

Aby określić skuteczność metody opartej na fluorescencji, przeprowadziliśmy hodowlę 10⁴ komórek MDCK/studzienki w szkiełkach komorowych przez noc. Stada wirusa PR8 o znanych mianach dodano do zduplikowanych studzienek z różnymi jednostkami tworzącymi płytki (PFU) i pozostawiono do adsorpcji na komórkach przez jedną godzinę. Komórki inkubowano przez 16 godzin, aby umożliwić namnażanie się wirusa. Następnie komórki MDCK w szkiełkach komory utrwalono 1% paraformaldehydem, przemyto i wybarwiono przeciwciałem anty-M2 przez 1 godzinę, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z AlexaFluor 488 przez dodatkowy 1 godzinę. Konfokalne analizy mikroskopowe zakażonych komórek MDCK wykazały, że przylegająca monowarstwa była w dużej mierze nienaruszona, a białko M2 pochodzące z PR8 było obficie obecne wewnątrz zakażonych komórek MDCK (Figura 1A). Fluorescencyjne komórki można wykryć w infekcjach z mianami wirusów tak niskimi, jak 10². Analizy te wykazały również, że liczba fluoryzujących komórek MDCK na studzienkę była wprost proporcjonalna do rosnących mian wirusa PR8. Chociaż skuteczność optyczna wzbudzenia fluorochromem za pomocą lasera argonowego zapewnia żywe obrazy komórkowe, jego wąski stosunek sygnału do szumu i autofluorescencja komórek sprawiają, że oznaczanie ilościowe wirusa jest niezwykle trudne, szczególnie przy niższych miareczkowaniach.

Dlatego, aby ustalić dokładną metodę szacowania wirusa, zastosowaliśmy system wykrywania i kwantyfikacji oparty na barwniku IR. Komórki MDCK (10⁴ / dołek) hodowano na 96-dołkowych płytkach, zakażono PR8, a białka wirusowe wykryto za pomocą anty-M2, a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem IR. Zastosowanie przeciwciała anty-M2 pozwoliło nam na wykorzystanie intensywności fluorescencji specyficznej dla antygenu jako bezpośredniego wskaźnika ilości wirusa. Do wyliczenia intensywności fluorescencji użyliśmy skanera IR opartego na LI-COR Odyssey. System ten wykorzystuje dwukanałową detekcję laserową w podczerwieni do identyfikacji fluoroforów i odróżniania ich od szumu tła. Pierwszy kanał wzbudza się przy długości fali 680 nm i emituje przy długości fali 700 nm, co pomaga w ilościowym określeniu tła. Drugi kanał wykrywa fluorofory, które wzbudzają się przy 780 nm i emitują przy 800 nm. Skanowanie komórek MDCK zakażonych PR8 w LI-COR Odyssey wykazało zależną od miana wirusa jasną fluorescencję (Figura 1B). Dodatnie fluorescencyjne komórki MDCK M2 były wyraźnie widoczne wewnątrz studzienek (ryc. 1B). Konsekwentnie można było zaobserwować dodatnią korelację intensywności fluorescencji z mianem wirusa zaczynającym się od 10^{2-10 5} PFU. Miareczkowanie wirusa PR8 wyższe niż 10⁶ PFU prowadzi do śmierci komórki, co wyznacza górną granicę czułości testu. Minimalna, ale wykrywalna dodatniość konsekwentnie obserwowana w przypadku mian wirusa 10^{2-10 3} PFU PR8 wykazała wysoką czułość barwników bliskiej podczerwieni. Stosunek sygnału do szumu określono przez porównanie komórek MDCK zakażonych pozorowanym lub leczonych przeciwciałami izotypowymi. Obie te kontrole skutkowały znikomymi lub niewykrywalnymi poziomami fluorescencji (Figura 1B).

Aby jeszcze bardziej poprawić czułość i zmniejszyć wymagania dotyczące objętości próbki testowej, zainfekowaliśmy 5×10³ komórek MDCK/studzienkę na płytkach 384-dołkowych. Różne PFU PR8 zostały przetestowane jako rozcieńczenia szeregowe jednologarytmiczne (rysunek 1C). Czułość wykrywania z płytek 384-dołkowych była porównywalna do tej z testów na płytkach 96-dołkowych. Zarówno 10¹, jak i 10² PFU działały konsekwentnie lepiej na płytkach 384-dołkowych w porównaniu z płytkami 96-dołkowymi. Korzystając z intensywności fluorescencji z płytek 96- lub 384-dołkowych, skonstruowaliśmy standardowe krzywe miareczkowania (ryc. 1D). W tych obliczeniach pierwszą zmienną jest miano wirusa, a drugą intensywność fluorescencji. Dlatego wykorzystaliśmy rozkład wykładniczy do wygenerowania dopasowania krzywej w celu określenia wielomianowej zależności między mianami wirusów a intensywnością fluorescencji. Zweryfikowaliśmy również nasze obserwacje przy użyciu innego przeciwciała, które jest skierowane przeciwko nukleoproteinie (NP) wirusa PR8 (dane nie pokazane). Różne źródła szczepów PR8 wykorzystano również do zakażenia komórek MDCK, które były testowane z przeciwciałami anty-NP lub anty-M2 (dane nie pokazane). Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że system wykrywania białek oparty na barwniku IR może pomóc w diagnozowaniu infekujących szczepów wirusowych i precyzyjnym określeniu miana infekujących patogenów.

Rozważania matematyczne dotyczące obliczania miana wirusa

Obliczenia matematyczne intensywności fluorescencji i wyznaczania miana są wykonywane w sposób opisany poniżej. Po procedurze barwienia cała płytka lub wybrane dołki w obrębie płytki są oznaczane ilościowo za pomocą oprogramowania LI-COR Odyssey. Korzystając z narzędzia Auto Shape Tool, granice obszaru docelowego (ROI) zostały narysowane w środku dołków testowych płytek 96- lub 384-dołkowych (rysunek 2A i B). Utworzenie zwrotu z inwestycji pozwala oprogramowaniu na porównanie zdefiniowanych studzienek tła z próbkami miareczkowanymi pod kątem wirusów. Do ustalenia wartości wyjściowej dla całego testu wykorzystano zwrot z inwestycji w tle. Dwa przeciwległe krzyżyki nitkowe (białe) zostały wprowadzone do ROI w celu zmierzenia intensywności fluorescencji w całym dołku (ryc. 2C). Krzywe po prawej stronie i poniżej reprezentatywnych studzienek na rysunku 2C reprezentują intensywność pikseli wzdłuż tych krzyżyków. Zmierzono natężenia fluorescencji w jednolitych odstępach czasu ROI, a zebrane punkty danych zintegrowano. Mnożnik odchylenia standardowego określał poziom sygnału powyżej linii bazowej, który został uwzględniony przy określaniu zwrotu z inwestycji. Fluorescencję tła określono ilościowo na podstawie prób kontrolnych z imitacją zakażonego lub samego przeciwciała wtórnego i wykorzystano do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych. Do obliczeń wybraliśmy intensywność zintegrowaną, ponieważ reprezentuje ona objętość pikseli netto dla zdefiniowanego pojedynczego punktu i jest niezależna od rozmiaru obiektu. Ponadto zintegrowana intensywność jest zasadniczo niezależna od rozdzielczości. Całkowita intensywność/piksel (I) odpowiada natężeniu sygnału powstającego z wybranego dołka w obszarze piksela (Is) oraz sygnałowi powstającemu z tła obszaru piksela (b). Dlatego dla piksela "i":

Ii = Isi + bi

Objętość pikseli reprezentuje zarówno wielkość sygnału, jak i obszar, w którym jest on rozprowadzany. Obszar sygnału jest związany z rozkładem próbki, która generuje sygnał. Objętość piksela jest równa całkowitemu sygnałowi mierzonemu w pikselu "i" w obszarze (a) piksela pomnożonym przez jego wysokość (I). A więc dla piksela "i":

vi = aIi

Całkowita objętość pikseli to suma całkowitego sygnału z całego obszaru, a więc:

  n   n V= Σv_i = aΣI_i   i=1   i=1

Intensywność zintegrowana to suma wartości intensywności wszystkich pikseli zawartych w obiekcie, pomnożona przez pole okręgu/prostokąta (liczba mm²). W związku z tym zintegrowana intensywność =

a(ΣI_i- b )

Tutaj b oznacza średnią intensywność pikseli tła. Wzór ten oblicza zintegrowane intensywności sygnału w studniach kontrolnych lub eksperymentalnych i w ten sposób ustanawia krzywą standardową. Miana wirusów w próbkach testowych obliczono przy użyciu tej krzywej standardowej. Stężenie (intensywności) definiuje się jako ilość fluorescencji obecnej w określonym ROI. Stężenia w próbkach badanych są obliczane w odniesieniu do stężeń zdefiniowanych wzorców na tym samym obrazie. Aby obliczyć dokładne miano wirusa, intensywność każdego wzorca stężenia jest wykreślana i dopasowywana do długiej krzywej interpolacji. Stężenia badanych próbek oblicza się poprzez porównanie intensywności obszaru w obrębie krzywej wzorcowej.

Wyznaczanie mian wirusów z płynu BAL myszy zakażonych grypą

Wykrywanie żywych cząsteczek wirusa grypy w próbkach klinicznych i laboratoryjnych ma kluczowe znaczenie. Dlatego następnie sprawdziliśmy, czy możemy wykorzystać tę metodę do określenia miana wirusa w próbkach laboratoryjnych. Płyny BAL pobrano od nieuodpornionych myszy i doprawiono znaną ilością wirusa PR8. Wzbogacone płyny BAL miareczkowano liniowo w celu zliczenia mian wirusa. Podwielokrotności wzbogaconych płynów BAL użyto do zakażenia komórek MDCK na 96-dołkowych płytkach, utrwalonych i wybarwionych przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem anty-M2 i IR. Wyniki przedstawione na rysunku 3A pokazują, że miana wirusa w wzbogaconym płynie BAL były wykrywalne i skorelowane z mianami PR8 na krzywej standardowej. Korzystając z krzywej standardowej, określono ilościowo dokładną liczbę wirusów w wzbogaconym i dodanym płynie BAL. Obliczenia dopasowania krzywej wykładniczej dostarczyły miary do obliczenia miana wirusa w wzbogaconym płynie BAL (Figura 3B). Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy doskonałe korelacje między obliczonymi a zwiększonymi mianami wirusa, potwierdzając to podejście (Figura 3C).

Następnie przeanalizowaliśmy płyn BAL od myszy zakażonych PR8. PR8 jest szeroko stosowany w modelach mysich w celu zrozumienia patologii człowieka i odporności przeciwwirusowej³. Grupy myszy zostały zakażone donosowo 5000 PFU PR8. Myszy monitorowano pod kątem utraty wagi, pojawienia się zgarbionych pleców, potarganej sierści i innych objawów klinicznych. W dniach 0, 2, 4, 7 i 10 po zakażeniu myszy zostały uśmiercone i pobrano płyny BAL. Aby wykorzystać te próbki laboratoryjne, komórki MDCK inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami płynu BAL w końcowej objętości 50 μl przez 17 godzin na 96-dołkowych płytkach. Studzienki kontrolne komórek MDCK zakażonych znanymi mianami podstawowego wirusa PR8 posłużyły do wygenerowania krzywej standardowej. Po zakażeniu komórki przemyto, utrwalono i wybarwiono pierwszorzędowym przeciwciałem anty-M2, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem w bliskiej podczerwieni. Komórki MDCK, które zostały pozorowane lub potraktowane kontrolami izotypu po infekcji, dostarczyły intensywności fluorescencji tła do obliczeń miana.

Analizy płynu BAL wykazały, że wirus PR8 w próbce laboratoryjnej jest wykrywalny za pomocą systemu testów opartych na barwniku IR. Znaczny wzrost wiremii w płynie BAL zaobserwowano w 2 i 4 dniu po zakażeniu (ryc. 4A). Obliczenia zintegrowanej intensywności wykazały, że płyny BAL z 2 i 4 dnia po zakażeniu zawierały znaczne poziomy wirusa PR8 (Figura 4B). Nasze wyniki wskazują na stopniową, ale znaczącą utratę masy ciała we wczesnej fazie zakażenia PR8, co świadczy o ciężkości choroby. Niemniej jednak większość myszy zaczęła wracać do zdrowia po objawach choroby i przybierać na wadze 7 dni po infekcji (ryc. 4C). Myszy w 10 dniu po zakażeniu nie miały żadnego wykrywalnego PR8 wskazującego na usunięcie wirusa, co również korelowało ze wzrostem masy ciała i znacznym zmniejszeniem objawów choroby.

Aby jeszcze bardziej rozszerzyć zastosowanie tego testu, przetestowaliśmy izolat grypy ludzkiej A(H1N1) z 2009 roku za pomocą systemu wykrywania przeciwciał na bazie barwnika IR i porównaliśmy go z testem PCR w czasie rzeczywistym. Ta próbka kliniczna została wyizolowana z połączonego wymazu z nosogardzieli i gardła uzyskanego od podejrzanego pacjenta. Izolat rozmnożono w linii komórkowej MDCK w laboratorium Departamentu Zdrowia w Milwaukee. Wyniki testu porównano w celu sprawdzenia czułości metody opartej na barwniku IR na testy PCR w czasie rzeczywistym (ryc. 5). Wyniki wskazują, że system wykrywania przeciwciał oparty na barwniku IR ma potencjał do wykrywania wiremii już od 10³ TCID₅₀ / ml, co jest porównywalne z testem opartym na PCR (10 TCID₅₀ / ml) i mieści się w zakresie znaczenia klinicznego dla większości próbek pacjentów. Wyniki te dostarczają mocnych dowodów na to, że system oznaczania oparty na barwniku IR ma wystarczającą czułość i potencjał, aby można go było zastosować do oznaczania miana wirusa w warunkach badawczych, laboratoryjnych i klinicznych.

Rysunek 1. Immunologiczne wykrywanie wirusa grypy za pomocą barwnika IR. (A) Konfokalne analizy mikroskopowe komórek MDCK zakażonych grypą w 8-dołkowych szkiełkach mikroskopowych. Mikroskopowe analizy immunofluorescencyjne pokazują, że przylegająca monowarstwa MDCK jest w dużej mierze nienaruszona i obciążona białkiem M2 pochodzącym z wirusa. (B-C) Kwantyfikacja mian wirusów w oparciu o barwnik IR i system LI-COR Odyssey. (D) Generowanie krzywych standardowych i wykładniczych profili dopasowania krzywej. Dane przedstawione w A-D są reprezentatywne dla pięciu niezależnych eksperymentów.

Rysunek 2. Metodyka oznaczania mian wirusów za pomocą barwników IR. (A) Zintegrowane pomiary intensywności fluorescencji. Zdefiniowany obszar wewnątrz studzienek testowych (ROI) został oznaczony w celu zmierzenia intensywności fluorescencji. Za pomocą narzędzia Auto Shape Tool narysowano granice ROI w środku dołków testowych płytek 96- lub 384-dołkowych. Fluorescencję mierzono jako pojedyncze piksele (piksel = n) w ramach ROI. Intensywność zintegrowana to suma wartości intensywności wszystkich pikseli zawartych w obiekcie, pomnożona przez obszar okręgu/prostokąta (liczba^mm2). (B) Wyznaczanie zintegrowanych intensywności fluorescencji w studzienkach testowych. Stworzenie ROI umożliwiło skanerowi LI-COR porównanie zdefiniowanych studzienek tła z próbkami miareczkowanymi wirusem. Fluorescencję tła określono ilościowo na podstawie prób kontrolnych z imitacją zakażonego lub samego przeciwciała wtórnego i wykorzystano do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych. (C) Gromadzenie punktów danych w ramach ROI. Dwa przeciwległe krzyżyki nitkowe (białe) zostały wprowadzone do ROI w celu zmierzenia intensywności fluorescencji w całym odwiercie. Krzywe po prawej stronie i poniżej reprezentatywnych dołków reprezentują intensywność pikseli wzdłuż tych krzyżyków.

Rysunek 3. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe mian wirusa w płynach BAL wzbogaconych PR8. (A) Komórki MDCK hodowano przez noc na 96-dołkowych płytkach i dodano do nich płyn BAL z dodatkiem PR8. Tablice odczytane były w systemie LI-COR Odyssey. (B) Egzogennie wzbogacony płyn BAL porównano z krzywymi standardowymi. (C) Porównanie obliczonych i oczekiwanych mian wirusów. Dopasowanie krzywej wykładniczej pod warunkiem y=9,4784e^0,0014x . Dane przedstawione w A-C są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 4. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe wirusa grypy w płynach BAL od myszy zakażonych PR8. (A) Grupy myszy zostały zakażone donosowo 5000 PFU PR8. Komórki MDCK inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami płynu BAL w końcowej objętości 50 μl przez 17 godzin na płytkach 96-dołkowych. Po zakażeniu komórki przemyto, utrwalono i wybarwiono pierwszorzędowym przeciwciałem anty-M2, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem IR. Panel po prawej stronie reprezentuje krzywą standardową. (B) Kwantyfikacja mian wirusów w płynie BAL zakażonych myszy. (C) Utrata masy ciała myszy podczas infekcji PR8 korelowała z wiremią. Dane przedstawione w A-C są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 5. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe izolatu grypy pandemicznej A(H1N1) (pdm) 2009 od pacjenta. (A) System detekcji fluorescencji przeciwciał na bazie barwnika IR w celu połowicznego miareczkowania zakażonej linii komórkowej MDCK. Wyniki fluorescencji wskazują, że test ma potencjał do wykrywania wiremii już od 10³ TCID₅₀ / ml. (B) Kwas nukleinowy wyekstrahowany z izolatu hodowli wraz z seryjnymi dziesięciokrotnymi rozcieńczeniami znanego izolatu H1N1 z mianem analizowano za pomocą testu CDC real-time PCR¹². Granica wykrywalności dla PCR w czasie rzeczywistym wynosiła 10 TCID₅₀/ml.

Discussion

Niedawny wybuch epidemii ptasiej grypy w Azji Południowo-Wschodniej i globalny strach przed pandemią świńskiej grypy stwarzają ogromne obawy dla zdrowia i bezpieczeństwa publicznego. Główny nacisk położono na opracowanie szczepionek dla istniejących i nowszych szczepów wirusa grypy. Dostępność szybkich, wysokoprzepustowych technologii do precyzyjnego wykrywania i dokładnych obliczeń miana wirusa ogromnie usprawni leczenie. Najczęściej stosowanymi technikami stosowanymi do obliczania miana wirusa są testy tworzenia blaszek miażdżycowych i hemaglutynacji grypy. Test tworzenia blaszek miażdżycowych został po raz pierwszy opracowany w celu oszacowania miana bakteriofagów i został przyjęty przez Renato Dulbecco do obliczania miana wirusa zwierzęcego ⁴. Aby przeprowadzić ten test, przygotowuje się 10-krotne rozcieńczenia preparatów grypowych lub próbek zwierzęcych, takich jak płyn BAL, a następnie zaszczepia się 0,1 ml podwielokrotności na monowarstwie komórek MDCK na płytkach 6-dołkowych. Wirus może adsorbować się na komórkach MDCK, a następnie dodaje się pożywkę i agarozę. Podczas inkubacji pierwotne zakażone komórki uwalniają potomstwo wirusa, które rozprzestrzenia się tylko na sąsiednie komórki. Cytopatogenne działanie infekcji wirusowej grypy wytwarza okrągłą strefę zakażonych komórek zwaną blaszką miażdżycową. Każda blaszka miażdżycowa powstaje przypuszczalnie po zakażeniu pojedynczej komórki pojedynczą cząsteczką wirusa, po której następuje replikacja wirusa. Kontrast między żywymi komórkami a blaszkami może być wzmocniony przez barwniki, takie jak fiolet krystaliczny. Główną wadą tego testu jest brak odtwarzalności i ogromne różnice w eksperymentach. Innym testem stosowanym do określenia miana wirusa grypy jest test hemaglutynacji. Białko hemaglutyniny obecne na powierzchni wirusa grypy skutecznie wiąże się z białkami zawierającymi kwas N-acetyloneuraminowy na czerwonych krwinkach ssaków i ptaków ¹. Ta interakcja między wirusem grypy a erytrocytami prowadzi do aglutynacji w postaci siatki. Poziom aglutynacji służy do oszacowania miana wirusa grypy w próbkach testowych. Test aglutynacji erytrocytów służy wyłącznie do określenia miareczkowania znanego wirusa i nie może być stosowany do celów identyfikacji szczepu. Ponieważ test ten nie rozróżnia żywych i martwych wirusów, trudno jest uzyskać dokładne obliczenie miana wirusa.

Obecne rozpoznania kliniczne zakażeń grypą opierają się na testach serologicznych, reakcji łańcuchowej polimerazy, immunofluorescencji próbki bezpośredniej i hodowli komórkowej ^1,6. Opisana tu nowa metoda ma również potencjał diagnostyczny kliniczny i laboratoryjny. Zestawy do wykrywania grypy Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) i BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) wykorzystują test immunochromatograficzny do wykrywania antygenu wirusowego, takiego jak nukleoproteina ⁷. Korzystając z tych zestawów, wykrycie wirusa można osiągnąć w ciągu 15 minut; Jednak wszystkie próbki ujemne muszą zostać poddane dalszym badaniom przesiewowym metodą hodowli komórkowych. Różne badania wykazały również niską wrażliwość tych zestawów, szczególnie gdy infekcja była łagodna lub niska ⁸. W naszej metodzie konsekwentnie wykrywamy wirusa na poziomie zaledwie 100 PFU. Sugeruje to, że nasza technika jest przydatna w wykrywaniu wirusa H1N1 w próbkach klinicznych, nawet jeśli infekcja jest łagodna. Opisano metodę wykrywania antygenów wirusowych opartą na fluorescencji, w której próbki aspiratu nosowo-gardłowego były bezpośrednio analizowane lub inokulowane na monowarstwie podatnych komórek w celu namnażania wirusa i późniejszych analiz ⁹. Metody te są jednak ograniczone do celów diagnostycznych i nie nadają się do obliczania miana wirusa. Q-PCR pomaga zidentyfikować obecność wirusowego RNA i nie szacuje zakaźności żywych wirusów. W porównaniu z tymi testami, system testów oparty na barwniku IR pomoże w wykrywaniu i oznaczaniu miana wirusa w próbkach klinicznych i laboratoryjnych. W przypadku wybuchu epidemii grypy bardzo ważne jest zdiagnozowanie tysięcy próbek w krótkim czasie. Nasza metoda oparta na 384-dołkowej płytce i skanerze w podczerwieni może skanować 6 płytek jednocześnie (>2 000 próbek), oferując tym samym większą przewagę nad innymi metodami bezpośredniej fluorescencji. Możliwość szybkiego przetwarzania tysięcy próbek klinicznych może zmniejszyć zmienność testów, czas trwania testu i koszty. Zastosowanie przeciwciała swoistego dla M2 ma tę zaletę, że jest niezależne od różnic w szczepach w białkach H i N. Białko M2 jest stosunkowo konserwatywne w większości szczepów grypy infekujących ludzi. Jeśli przeciwciała specyficzne dla krążących barwników zostaną połączone z naszym systemem, można zmierzyć zarówno miano wirusa, jak i zidentyfikować szczep. Ponieważ jednak M2 jest celem dla leków podobnych do amantadyny, mogą powstać mutanty, które mogą zmienić miejsce wiązania zastosowanego tutaj mAb. Stanowi to potencjalne ograniczenie dla tego systemu u osób, które są leczone tymi lekami.

Do wyliczenia mian wirusa grypy w próbkach testowych stosuje się wiele testów. Do obliczenia miana wirusa powszechnie stosuje się 50% dawkę zakaźną w hodowli tkankowej (TCID₅₀) i testy na bazie płynu omocznikowego jaj ^1,10. Jednak wymagania dotyczące wielu dni sprawiają, że metody te są mniej niezawodne. Co więcej, w tych metodach obliczenia oparte na 50% zmianie liczby blaszek dostarczają teoretycznych, ale niedokładnych miareczkowania wirusa. Testy tworzenia się płytki nazębnej można wykonać w ciągu 96 godzin; Jednak brak odtwarzalności jest głównym problemem w obliczeniach miana wirusa. Opisywana tutaj obecnie technika posiada kilka wyraźnych zalet. Po pierwsze, jest to wysoce powtarzalna technika ze spójnymi wynikami. Po drugie, obliczenia miana wirusa opierają się na prostej kwantyfikacji intensywności fluorescencji, które są porównywane ze zdefiniowanymi krzywymi standardowymi. Po trzecie, dwa lub więcej przeciwciał pierwszorzędowych można użyć do zdiagnozowania wielu serotypów w danej próbce. Ponadto przeciwciała sprzężone z barwnikiem IR mają minimalną autofluorescencję i zostały wykorzystane do obrazowania komórek ¹¹. Promieniowanie UV lub wzrokowe (300-600 nM) powoduje wysoką autofluorescencję komórkową ze względu na obecność endogennych fluoroforów o wysokiej wydajności kwantowej. Należą do nich aminokwasy aromatyczne, lipopigmenty, nukleotydy pirydynowe (NADPH), elastyna, kolagen i koenzymy flawinowe. Ta wewnętrzna właściwość komórek utrudnia wykorzystanie tych źródeł promieniowania jako sond do ilościowego określenia ekspresji określonych białek. Natomiast barwniki bliskiej podczerwieni wzbudzają i emitują w zakresie 670-1000 nm. Wiele cząsteczek komórkowych gospodarza i węglowodorów poliaromatycznych nie wzbudza się na tej długości fali, a ze względu na zmniejszone rozpraszanie światła emituje wyjątkowo niską fluorescencję tła. Co więcej, okno między tłem a specyficzną detekcją jest znacznie ulepszone ze względu na wysoki współczynnik ekstynkcji fluoroforów bliskiej podczerwieni. Fotostabilność, doskonały stosunek sygnału do szumu, jest niezwykle istotna w ilościowym określaniu miana wirusa. Zastosowanie komór mikroprzepływowych zautomatyzuje proces badań przesiewowych za pomocą zrobotyzowanych elementów sterujących i pozwoli nam z łatwością testować wysoce zakaźne próbki kliniczne. W związku z tym wykorzystanie barwników bliskiej podczerwieni w tych metodach jest idealne i wysoce niezawodne do oznaczania mian wirusów w próbkach tkanek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina surowicy bydlęcej	Atlanta Biologicals	Wirus S11750
PR8			Od dr Thomasa M Morana
Kozia anty-mysia IRDye@800	LI-COR Biosciences	926-32210	1:200 rozcieńczenie
LI-COR Odyssey Skaner IR	LI-COR Biosciences	9201-01
384-dołkowa płaska płyta denna	Nalge Nunc international	164730
96-dołkowa płaska płyta	denna Nalge Nunc international	165305
DMEM medium	Invitrogen	11965126
RPMI medium	Invitrogen	11875135
Wodorowęglan sodu	Invitrogen	25080
L-glutamina 100x	Invitrogen	25030
Trypson-EDTA	Invitrogen	R001100
Pirogronian sodu	Invitrogen	11360070
przeciwciało			Od dr Thomasa M Morana
Anty-NP mAb	CDC	V2S2208	Uzyskiwany za pomocą MTA