Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Podsumowanie

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego <10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Streszczenie

Wirus grypy jest patogenem układu oddechowego, który każdego roku powoduje wysoką zapadalność i śmiertelność w wielu częściach świata. Dlatego precyzyjna diagnostyka zakażającego szczepu oraz szybki, wysokoprzepustowy screening ogromnej liczby próbek klinicznych są kluczowe dla opanowania rozprzestrzeniania się infekcji pandemicznych. Obecna diagnostyka kliniczna zakażeń grypą opiera się na testach serologicznych, reakcji łańcuchowej polimerazy, bezpośredniej immunofluorescencji preparatów oraz hodowlach komórkowych ^1,2.

W niniejszej pracy przedstawiamy opracowanie nowej techniki diagnostycznej służącej do wykrywania żywych wirusów grypy. W celu przetestowania skuteczności tej metody z wykorzystaniem komórek MDCK ⁴ zastosowaliśmy zaadaptowany do myszy ludzki wirus A/PR/8/34 (PR8, H1N1) ³. Komórki MDCK (10⁴ lub 5 x 10³ na dołek) hodowano na płytkach 96- lub 384-dołkowych, zainfekowano wirusem PR8, a następnie białka wirusowe wykrywano za pomocą przeciwciał anty-M2 oraz sprzężonego z barwnikiem IR przeciwciała wtórnego. M2 ⁵ oraz hemaglutynina ¹ to dwa główne białka markerowe stosowane w wielu różnych testach diagnostycznych. Zastosowanie przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem IR zminimalizowało autofluorescencję występującą przy użyciu innych barwników fluorescencyjnych. Użycie przeciwciał anty-M2 pozwoliło na wykorzystanie intensywności fluorescencji specyficznej dla antygenu jako bezpośredniej miary ilości wirusa. Do pomiaru intensywności fluorescencji wykorzystano skaner IR oparty na systemie LI-COR Odyssey. System ten wykorzystuje dwukanałową detekcję IR opartą na laserach w celu identyfikacji fluoroforów i odróżnienia ich od szumu tła. Pierwszy kanał wzbudza przy 680 nm i emituje przy 700 nm, co pomaga w kwantyfikacji tła. Drugi kanał wykrywa fluorofory, które wzbudzają przy 780 nm i emitują przy 800 nm. Skanowanie zakażonych PR8 komórek MDCK w skanerze IR wykazało jasną fluorescencję zależną od miana wirusa. Spójnie obserwowano dodatnią korelację intensywności fluorescencji z mianem wirusa w zakresie od 10² do 10⁵ PFU. Minimalna, lecz wykrywalna pozytywność, stale obserwowana przy mianach wirusa PR8 rzędu 10²-10³ PFU, wykazała wysoką czułość barwników bliskiej podczerwieni (near-IR). Stosunek sygnału do szumu określono poprzez porównanie z komórkami MDCK zainfekowanymi pozornie (mock-infected) lub traktowanymi przeciwciałami izotypowymi.

Wykorzystując intensywność fluorescencji z formatów płytek 96- lub 384-dołkowych, skonstruowano standardowe krzywe miareczkowania. W obliczeniach tych pierwszą zmienną był miano wirusa, a drugą zmienną intensywność fluorescencji. W związku z tym zastosowano rozkład wykładniczy do dopasowania krzywej w celu określenia zależności wielomianowej między mianami wirusów a intensywnościami fluorescencji. Podsumowując, wyciągnięto wniosek, że system detekcji białek oparty na barwnikach IR może pomóc w diagnozowaniu zakażających szczepów wirusa i precyzyjnym oznaczaniu miana zakaźnych patogenów.

Protokół

1. Hodowla komórek MDCK

1. Kulturować 5 milionów komórek MDCK przez noc w kolbie T-75 cm² w 20 ml kompletnego medium RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu oraz 0,001% β-merkaptoetanolu w inkubatorze w temperaturze 37 °C z zawartością 5,2% CO₂.

2. Zakażenie szczepem PR8 i pobieranie płynu BAL

1. Zastosuj u myszy C57BL/6 infekcję donosową, podając 5 000 PFU wirusa PR8 w sterylnym PBS w całkowitej objętości 30 μl przez jedną nozdrzę. Przeprowadź infekcje pozorowane (mock), stosując wyłącznie sterylny PBS bez wirusa.
2. Uśmierć myszy 0, 2, 4 i 7 dni po infekcji, otwórz jamę klatki piersiowej i wykonaj 1 cm nacięcie równolegle do tchawicy przez futro myszy, aby ją odsłonić.
3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na bliższej części tchawicy.
4. Wprowadź do tchawicy 0,5 ml PBS-1% BSA i odessań płyn z BAL. Płyny z BAL można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Infekcja wirusowa i detekcja wirusowego białka macierzy (M2) za pomocą systemu LI-COR Odyssey

1. Aby określić miana wirusów z użyciem przeciwciał sprzężonych z barwnikiem podczerwonym, zebrać komórki MDCK z kolb T-75 cm² i wysiać je na optyczne czarne płytki z płaskim dnem z 96 dołkami (10 000 komórek na dołek) lub 384 dołkami (5 000 komórek na dołek). Hodować komórki MDCK przez noc w temperaturze 37 °C w pełnej pożywce RPMI1640, a następnie przemyć dwukrotnie DMEM bez surowicy zawierającym BSA (0,2%, w/v), penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml), pirogronian sodu (1 mM), roztwór wodorowęglanu sodu (5% z 7,5%) oraz β-merkaptoetanol (0,001%).
2. Inkubować komórki MDCK z płynem BAL (50 μl dla płytki 96-dołkowej lub 10 μl dla płytki 384-dołkowej) lub wirusem PR8 o znanych mianach w każdym dołku z równą objętością (50 μl dla płytki 96-dołkowej lub 10 μl dla płytki 384-dołkowej) pożywki DMEM zawierającej trypsynę traktowaną L-1-tosylamido-2-fenyloetylochlorometylo-ketonem (TPCK) (0,2 μg/ml).
3. Po 1 h infekcji dodać do każdego dołka 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) pełnej pożywki RPMI1640 zawierającej 10% FBS.
4. Kontynuować hodowlę komórek MDCK przez kolejne 16 h infekcji; przemyć komórki MDCK dwukrotnie 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) roztworu PBS-1% BSA i utrwalić 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) 1% paraformaldehydu przez 5 min.
5. Po utrwaleniu inkubować komórki MDCK przez kolejne 30 min z 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) PBS-1% BSA w celu blokowania.
6. Po blokowaniu inkubować komórki MDCK przez 1 h z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko białku M2 (1:1000, rozcieńczonym w PBS-1% BSA). Użyć 50 μl na dołek w płytkach 96-dołkowych lub 20 μl rozcieńczonego przeciwciała na dołek w płytkach 384-dołkowych.
7. Przemyć komórki MDCK trzykrotnie 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) PBS zawierającego 1% BSA i inkubować przez 1 h z 50 μl (płytka 96-dołkowa) lub 20 μl (płytka 384-dołkowa) kozich przeciwciał wtórnych anty-mysich IRDye@800 (rozcieńczenie 1:200).
8. Przemyć komórki MDCK trzykrotnie 100 μl PBS zawierającego 1% BSA. Umieścić zabarwione płytki na szklanej platformie odczytowej skanera IR LI-COR Odyssey i ustawić czytnik na odczyt płytki 96- lub 384-dołkowej.
9. Dożylne dołki kontrolne ujemne można ustawić za pomocą oprogramowania LI-COR Odyssey. Ilościowo określić sygnał z całej płytki lub wybranych dołków za pomocą oprogramowania LI-COR Odyssey.
10. Za pomocą narzędzia Auto Shape Tool narysować granice obszaru docelowego (ROI) w środku dołka testowego płytek 96- lub 384-dołkowych. Utworzenie ROI pozwala oprogramowaniu porównać zdefiniowane dołki tła z próbkami o określonych mianach wirusa.
11. Aby ustawić wartość bazową dla całego testu, użyć ROI tła. Wprowadzić dwa przeciwległe krzyżyki dostarczone przez oprogramowanie Odyssey w obrębie ROI, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w całym dołku.
12. Skanować płytki w skanerze IR LI-COR Odyssey, używając kanału 780 nm do detekcji i 680 nm jako długości fali referencyjnej.
13. Po aktywacji polecenia „Read” zmierzone zostaną intensywności fluorescencji w równych odstępach ROI, a zebrane punkty danych zostaną zintegrowane. Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału ponad linią bazową, który zostanie uwzględniony w wyznaczaniu ROI.
14. Fluorescencję tła określi się na podstawie kontroli z infekcją pozorowaną (mock) lub kontroli z samym przeciwciałem wtórnym, a następnie zostanie ona wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w dołkach testowych.
15. Do obliczeń wybrać „integrated intensity”, ponieważ reprezentuje ona wypadkową objętość pikseli dla zdefiniowanego pojedynczego punktu i jest niezależna od rozmiaru cechy. Użyć krzywej wzorcowej z znanych mian wirusa do obliczenia mian wirusa w nieznanych próbkach. Użyć długiej krzywej interpolacyjnej do precyzyjnego obliczenia mian wirusa. Obliczyć miana wirusa w próbkach testowych poprzez porównanie intensywności próbek testowych z krzywą wzorcową.

4. Reprezentatywne wyniki

Standaryzacja systemu wysokoprzepustowego wykrywania wirusów opartego na barwnikach IR

Wirus PR8 może zakażać komórki MDCK; dlatego wykorzystaliśmy te komórki do opracowania niniejszego testu. Miana wirusa mierzono przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko białku macierzy wirusa grypy (M2). W przeciwieństwie do innych metodologii, zastosowaliśmy przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem bliskiej podczerwieni (near-IR). Metoda ta umożliwia prostą, zautomatyzowaną ocenę miana wirusa PR8 na podstawie intensywności fluorescencji generowanej podczas wykrywania białka M2. Po zakażeniu wirusem grypy białko M2 jest translacyjnie syntetyzowane, transportowane i gromadzone w komórce gospodarza, w tym na jej powierzchni. Zatem ilość białka M2 stanowi mierzalny parametr pozwalający określić ilość wirusa. Porównanie intensywności sygnału z próbek badawczych z krzywą wzorcową pozwala na precyzyjny pomiar miana wirusa.

Aby określić skuteczność metody opartej na fluorescencji, w szkiełkach komorowych hodowano przez noc 10⁴ komórek MDCK/dołek. Do powtórzonych dołków z różną liczbą jednostek tworzących placki (PFU) dodano zapasy wirusa PR8 o znanych mianach i pozostawiono na jedną godzinę w celu adsorpcji na komórkach. Komórki inkubowano przez 16 h, aby umożliwić propagację wirusa. Następnie komórki MDCK w szkiełkach komorowych utrwalono 1% paraformaldehydem, przemyto i barwiono przeciwciałem anty-M2 przez 1 h, a następnie wtórnym przeciwciałem sprzężonym z AlexaFluor 488 przez kolejną 1 h. Analizy mikroskopowe konfokalne zakażonych komórek MDCK wykazały, że przylegająca warstwa jednorodna pozostała w dużej mierze nienaruszona, a białko M2 pochodzące z PR8 było obficie obecne wewnątrz zakażonych komórek MDCK (Ryc. 1A). Fluorescencyjne komórki można było wykryć w infekcjach przy mianach wirusa tak niskich jak 10². Analizy te wykazały również, że liczba fluorescencyjnych komórek MDCK na dołek była wprost proporcjonalna do rosnących mian wirusa PR8. Chociaż wydajność optyczna wzbudzenia fluorochromu laserem argonowym zapewnia wyraźne obrazy komórkowe, niski stosunek sygnału do szumu oraz autofluorescencja komórek sprawiają, że kwantyfikacja wirusa jest niezwykle trudna, szczególnie przy niższych mianach.

Aby zatem opracować dokładną metodę szacowania ilości wirusa, zastosowano system detekcji i kwantyfikacji oparty na barwnikach IR. Komórki MDCK (10⁴/dołek) hodowano na płytkach 96-dołkowych, zainfekowano je szczepem PR8, a białka wirusowe wykryto za pomocą przeciwciał anty-M2, a następnie wtórnego przeciwciała sprzężonego z barwnikiem IR. Zastosowanie przeciwciała anty-M2 pozwoliło na wykorzystanie fluorescencji specyficznej dla antygenu jako bezpośredniej miary ilości wirusa. Do pomiaru natężenia fluorescencji wykorzystano skaner IR LI-COR Odyssey. System ten wykorzystuje dwukanałową detekcję IR opartą na laserach w celu identyfikacji fluoroforów i ich odróżnienia od szumu tła. Pierwszy kanał wzbudza przy 680 nm i emituje przy 700 nm, co pomaga w kwantyfikacji tła. Drugi kanał wykrywa fluorofory, które wzbudzają przy 780 nm i emitują przy 800 nm. Skanowanie zainfekowanych PR8 komórek MDCK w systemie LI-COR Odyssey wykazało silną fluorescencję zależną od miana wirusa (Rysunek 1B). Fluorescencyjne komórki MDCK dodatnie pod kątem M2 były wyraźnie widoczne w dołkach (Rysunek 1B). Można było konsekwentnie zaobserwować dodatnią korelację natężenia fluorescencji z mianem wirusa w zakresie od 10² do 10⁵ PFU. Miana wirusa PR8 wyższe niż 10⁶ PFU prowadziły do śmierci komórek, co wyznacza górną granicę czułości testu. Minimalna, lecz wykrywalna pozytywność, stale obserwowana przy mianach wirusa PR8 rzędu 10²-10³ PFU, wykazała wysoką czułość barwników bliskiej podczerwieni (near-IR). Stosunek sygnału do szumu określono poprzez porównanie z komórkami MDCK w grupie kontrolnej (mock-infected) lub traktowanymi przeciwciałami izotypowymi. Obie te kontrole wykazały pomijalny lub niewykrywalny poziom fluorescencji (Rysunek 1B).

Aby dodatkowo zwiększyć czułość i zmniejszyć wymaganą objętość próbki testowej, zainfekowano 5×10³ komórek MDCK na dołek w płytkach 384-dołkowych. Przetestowano różne wartości PFU dla PR8 w formie seryjnych rozcieńczeń dziesięciokrotnych (Ryc. 1C). Czułość detekcji w płytkach 384-dołkowych była porównywalna z czułością w testach na płytkach 96-dołkowych. Zarówno 10¹, jak i 10² PFU działały konsekwentnie lepiej w płytkach 384-dołkowych w porównaniu do płytek 96-dołkowych. Wykorzystując intensywność fluorescencji z formatów płytek 96- lub 384-dołkowych, skonstruowano standardowe krzywe miareczkowania (Ryc. 1D). W obliczeniach tych pierwszą zmienną jest miano wirusa, a drugą intensywność fluorescencji. W związku z tym zastosowano rozkład wykładniczy do dopasowania krzywej w celu określenia zależności wielomianowej między mianami wirusów a intensywnością fluorescencji. Wyniki te zwalidowano również przy użyciu innego przeciwciała skierowanego przeciwko nukleoproteinie (NP) wirusa PR8 (dane nie pokazano). Do zakażenia komórek MDCK użyto również szczepów PR8 z różnych źródeł, które przetestowano z użyciem przeciwciał anty-NP lub anty-M2 (dane nie pokazano). Podsumowując, stwierdzono, że system detekcji białek oparty na barwniku IR może pomóc w diagnostyce zakażających szczepów wirusowych oraz w precyzyjnym określeniu miana zakaźnych patogenów.

Kwestie matematyczne przy obliczaniu mian wirusa

Obliczenia matematyczne natężenia fluorescencji oraz oznaczenia miana wykonano zgodnie z poniższym opisem. Po przeprowadzeniu procedury barwienia, całą płytkę lub wybrane dołki w obrębie płytki poddano kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania LI-COR Odyssey. Za pomocą narzędzia Auto Shape Tool wyznaczono granice obszaru docelowego (ROI) w środku dołków testowych na płytkach 96- lub 384-dołkowych (Rysunek 2A i B). Utworzenie ROI umożliwia oprogramowaniu porównanie zdefiniowanych dołków tła z próbkami o określonym mianie wirusa. ROI tła wykorzystano do ustalenia wartości bazowej dla całego testu. Wewnątrz ROI wprowadzono dwa przeciwstawne celowniki (białe), aby zmierzyć natężenie fluorescencji w obrębie dołka (Rysunek 2C). Krzywe po prawej stronie i poniżej reprezentatywnych dołków na Rysunku 2C przedstawiają natężenie pikseli wzdłuż tych celowników. Natężenia fluorescencji w jednolitych odstępach ROI zostały zmierzone, a zebrane punkty danych zintegrowano. Mnożnik odchylenia standardowego określił poziom sygnału powyżej linii bazowej, który został uwzględniony w wyznaczaniu ROI. Fluorescencję tła skwantyfikowano na podstawie kontroli z infekcją pozorowaną lub kontroli zawierających wyłącznie przeciwciało wtórne i wykorzystano do oszacowania zintegrowanego natężenia w dołkach testowych. Do obliczeń wybrano natężenie zintegrowane, ponieważ reprezentuje ono wypadkową objętość pikseli dla zdefiniowanego pojedynczego punktu i jest niezależne od wielkości cechy. Ponadto natężenie zintegrowane jest w znacznym stopniu niezależne od rozdzielczości. Całkowite natężenie na piksel (I) odpowiada natężeniu sygnału pochodzącego z wybranego dołka w obszarze piksela (Is) plus sygnałowi pochodzącemu z tła obszaru piksela (b). Zatem dla piksela „i”:

Ii = Isi + bi

Objętość piksela reprezentuje zarówno wielkość sygnału, jak i obszar, w którym jest on rozłożony. Pole sygnału jest powiązane z rozkładem próbki generującej sygnał. Objętość piksela jest równa całkowitemu sygnałowi zmierzonemu w pikselu „i” na polu (a) piksela pomnożonemu przez jego wysokość (I). Zatem dla piksela „i”:

vi = aIi

Całkowita objętość pikseli jest sumą całkowitego sygnału z całego obszaru, zatem:

	n		n
V=	Σvi	=	aΣIi
	i=1		i=1

Intensywność zintegrowana jest sumą wartości intensywności wszystkich pikseli objętych obszarem cechy, pomnożoną przez pole koła/prostokąta (liczba mm²). Zatem intensywność zintegrowana =

a(ΣI_i- b )

W tym przypadku b oznacza średnią intensywność pikseli tła. Formuła ta służy do obliczenia zintegrowanych intensywności sygnału w studzienkach kontrolnych lub doświadczalnych, co pozwala na stworzenie krzywej wzorcowej. Miana wirusów w próbkach testowych obliczono przy użyciu tej krzywej wzorcowej. Stężenie (intensywności) definiuje się jako ilość fluorescencji obecną w określonym obszarze zainteresowania (ROI). Stężenia w próbkach testowych oblicza się w stosunku do określonych stężeń wzorców na tym samym obrazie. Aby obliczyć dokładne miana wirusów, nanosi się na wykres intensywność każdego wzorca stężenia i dopasowuje do nich długą krzywą interpolacyjną. Stężenia próbek testowych oblicza się poprzez porównanie intensywności obszaru w obrębie krzywej wzorcowej.

Oznaczanie mian wirusa z płynu BAL myszy zainfekowanych grypą

Wykrywanie żywych cząstek wirusa grypy w próbkach klinicznych i laboratoryjnych ma krytyczne znaczenie. W związku z tym sprawdziliśmy, czy można wykorzystać tę metodę do oznaczenia mian wirusa w próbkach laboratoryjnych. Płyny z BAL pobrano od nieuodpornionych myszy i wzbogacono znaną ilością wirusa PR8. Wzbogacone płyny z BAL poddano liniowemu mianowaniu w celu wyznaczenia miana wirusa. Alikwoty wzbogaconych płynów z BAL wykorzystano do zakażenia komórek MDCK w płytkach 96-dołkowych, które następnie utrwalono i zabarwiono przeciwciałami anty-M2 oraz sprzężonymi z barwnikiem IR przeciwciałami wtórnymi. Wyniki przedstawione na Rysunku 3A wykazują, że miana wirusa w wzbogaconym płynie z BAL były wykrywalne i korelowały z mianami PR8 na krzywej wzorcowej. Z wykorzystaniem krzywej wzorcowej określono dokładną liczbę wirusów w wzbogaconym i mianowanym płynie z BAL. Obliczenia dopasowania krzywej wykładniczej pozwoliły na wyznaczenie mian wirusa w wzbogaconym płynie z BAL (Rysunek 3B). Dzięki tej metodzie uzyskano doskonałą korelację między obliczonymi a dodanymi mianami wirusa, co potwierdza zasadność tego podejścia (Rysunek 3C).

Następnie przeanalizowano płyn z BAL pobrany od myszy zainfekowanych szczepem PR8. PR8 jest szeroko stosowany w modelach mysich w celu zrozumienia patologii ludzkiej oraz odporności przeciwwirusowej³. Grupy myszy zainfekowano donosowo dawką 5 000 PFU PR8. Monitorowano utratę masy ciała, występowanie zgarbionych pleców, zjeżonego futra oraz innych objawów klinicznych. W dniach 0, 2, 4, 7 i 10 po infekcji myszy zostały uśmiercone, a następnie pobrano płyny z BAL. W celu analizy tych próbek laboratoryjnych, komórki MDCK inkubowano z rozcieńczeniami seryjnymi płynu z BAL w końcowej objętości 50 μl przez 17 h w płytkach 96-dołkowych. Jako kontrolę, w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, wykorzystano dołki z komórkami MDCK zainfekowane znanymi mianami wirusa PR8 z zapasu. Po infekcji komórki przemyto, utrwalono i barwiono przeciwciałem pierwszorzędowym anty-M2, a następnie przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem bliskiej podczerwieni (near-IR). Komórki MDCK poddane infekcji pozorowanej (mock-infected) lub traktowane kontrolami izotypowymi po infekcji posłużyły do określenia tła fluorescencji dla obliczeń miana.

Analizy płynu z BAL wykazały, że wirus PR8 w preparacie laboratoryjnym jest wykrywalny za pomocą systemu analizy opartego na barwniku IR. Znaczący wzrost ładunku wirusowego w płynie z BAL zaobserwowano w 2. i 4. dniu po infekcji (Rycina 4A). Obliczenia całkowitej intensywności wskazały, że płyny z BAL pobrane w 2. i 4. dniu po infekcji zawierały istotne poziomy wirusa PR8 (Rycina 4B). Nasze wyniki pokazują stopniowy, ale znaczący spadek masy ciała w wczesnej fazie infekcji PR8, co świadczy o ciężkości przebiegu choroby. Niemniej jednak większość myszy zaczęła wracać do zdrowia i przybierać na wadze 7 dni po infekcji (Rycina 4C). W 10. dniu po infekcji u myszy nie stwierdzono obecności wirusa PR8, co wskazuje na jego eliminację, co korelowało również ze wzrostem masy ciała i znacznym zmniejszeniem objawów choroby.

Aby dalej rozszerzyć zastosowanie tego testu, zbadaliśmy ludzki izolat grypy A(H1N1) z 2009 roku przy użyciu systemu detekcji przeciwciał opartego na barwnikach IR i porównaliśmy go z testem real-time PCR. Próbka kliniczna została wyizolowana z połączonego wymazu z nosogardzieli i gardła pobranego od podejrzanego pacjenta. Izolat został namnożony w linii komórkowej MDCK w laboratorium Milwaukee Health Department. Wyniki testów porównano w celu sprawdzenia czułości metody opartej na barwnikach IR w stosunku do testów real-time PCR (Rycina 5). Wyniki wskazują, że system detekcji przeciwciał oparty na barwnikach IR ma potencjał do wykrywania ładunku wirusowego tak niskiego jak 10³ TCID₅₀/ml, co jest porównywalne z testem opartym na PCR (10 TCID₅₀/ml) i mieści się w zakresie istotności klinicznej dla większości próbek pacjentów. Wyniki te stanowią silny dowód na to, że system testowy oparty na barwnikach IR posiada wystarczającą czułość i potencjał do zastosowania w oznaczaniu miana wirusa w laboratoriach badawczych oraz w warunkach klinicznych.

Rycina 1. Detekcja immunologiczna wirusa grypy oparta na barwniku IR. (A) Analizy mikroskopowe konfokalne komórek MDCK zainfekowanych grypą w szkiełkach z komorami 8-dołkowymi. Analizy mikroskopowe immunofluorescencyjne wykazują, że przylegająca monowarstwa MDCK jest w dużej mierze nienaruszona i obciążona białkiem M2 pochodzącym z wirusa. (B-C) Ilościowe oznaczenie miana wirusa w oparciu o barwnik IR i system LI-COR Odyssey. (D) Generowanie krzywych wzorcowych i profili dopasowania krzywej wykładniczej. Dane przedstawione w A-D są reprezentatywne dla pięciu niezależnych eksperymentów.

Rycina 2. Metodyka oznaczania mian wirusa przy użyciu barwników IR. (A) Pomiary zintegrowanej intensywności fluorescencji. Wewnątrz dołków testowych wyznaczono obszar (ROI) w celu pomiaru intensywności fluorescencji. Za pomocą narzędzia Auto Shape Tool wyrysowano granice ROI w środku dołków testowych na płytkach 96- lub 384-dołkowych. Fluorescencję mierzono jako poszczególne piksele (pixel=n) w obrębie ROI. Zintegrowana intensywność jest sumą wartości intensywności wszystkich pikseli zamkniętych wewnątrz figury, pomnożoną przez pole koła/prostokąta (count mm²). (B) Wyznaczanie zintegrowanych intensywności fluorescencji w dołkach testowych. Utworzenie ROI pozwoliło skanerowi LI-COR na porównanie wyznaczonych dołków tła z próbkami o mierzonym mianie wirusa. Fluorescencję tła określono na podstawie kontroli z infekcją pozorowaną (mock-infected) lub z samym przeciwciałem wtórnym i wykorzystano ją do oszacowania zintegrowanej intensywności w dołkach testowych. (C) Gromadzenie punktów danych w obrębie ROI. Wewnątrz ROI wprowadzono dwa przeciwległe krzyże celownicze (białe), aby zmierzyć intensywność fluorescencji w poprzek dołka. Krzywe po prawej stronie i poniżej reprezentatywnych dołków przedstawiają intensywność pikseli wzdłuż tych krzyży celowniczych.

Rysunek 3. Detekcja i kwantyfikacja mian wirusa w płynach BAL z dodatkiem PR8. (A) Komórki MDCK hodowano przez noc w płytkach 96-dołkowych, a następnie dodano płyn BAL z dodatkiem PR8. Płytki odczytano w systemie LI-COR Odyssey. (B) Płyn BAL z egzogennym dodatkiem porównano z krzywymi wzorcowymi. (C) Porównanie obliczonych i oczekiwanych mian wirusa. Dopasowanie krzywej wykładniczej dało wynik y=9,4784e^0,0014x . Dane przedstawione w A-C są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 4. Detekcja i kwantyfikacja wirusa grypy w płynie BAL od myszy zainfekowanych PR8. (A) Grupy myszy zainfekowano donosowo dawką 5 000 PFU PR8. Komórki MDCK inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami płynu BAL w końcowej objętości 50 μl przez 17 h w płytkach 96-dołkowych. Po infekcji komórki przemyto, utrwalono i zabarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym anty-M2, a następnie przeciwciałem wtórnym sprzężonym z barwnikiem IR. Panel po prawej stronie przedstawia krzywą wzorcową. (B) Kwantyfikacja miana wirusa w płynie BAL zainfekowanych myszy. (C) Utrata masy ciała myszy podczas infekcji PR8 w korelacji z ładunkiem wirusowym. Dane przedstawione w A-C są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów.

Rycina 5. Detekcja i kwantyfikacja izolatu pandemicznej (pdm) grypy A(H1N1) z 2009 roku pobranego od pacjenta.** (A) Detekcja systemem fluorescencji przeciwciał opartym na barwniku IR dla dwukrotnych rozcieńczeń zainfekowanej linii komórkowej MDCK. Wyniki fluorescencji wskazują, że test ma potencjał do wykrywania miana wirusa tak niskiego jak 10³ TCID₅₀/ml. (B) Kwas nukleinowy wyekstrahowany z izolatu hodowlanego wraz z dziesięciokrotnymi rozcieńczeniami seryjnymi izolatu H1N1 o znanym mianie zostały przeanalizowane za pomocą testu CDC real-time PCR¹². Granica wykrywalności dla real-time PCR wyniosła 10 TCID₅₀/ml.

Dyskusja

Niedawny wybuch epidemii grypy ptaków w Azji Południowo-Wschodniej oraz globalny strach przed pandemią grypy świń budzą ogromne obawy w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa publicznego. Kluczową uwagę poświęcono opracowaniu szczepionek przeciwko istniejącym i nowym szczepom wirusa grypy. Dostępność szybkich technologii wysokoprzepustowych do precyzyjnej detekcji i dokładnych obliczeń miana wirusa znacząco usprawni leczenie. Do najczęściej stosowanych technik służących do obliczania miana wirusa należą testy tworzenia placków oraz testy hemaglutynacji wirusa grypy. Metodę tworzenia placków opracowano pierwotnie w celu oszacowania miana bakteriofagów, a następnie została ona zaadaptowana przez Renato Dulbecco do obliczania miana wirusów zwierzęcych ⁴. Aby wykonać ten test, przygotowuje się 10-krotne rozcieńczenia zapasu wirusa grypy lub próbek zwierzęcych, takich jak płyn z BAL, a następnie 0,1 ml aliquoty inokuluje się na monowarstwę komórek MDCK w płytkach 6-dołkowych. Wirusowi pozwala się zaadsorbować na komórkach MDCK, po czym dodaje się pożywkę odżywczą i agarozę. Podczas inkubacji pierwotnie zakażone komórki uwalniają potomstwo wirusa, które rozprzestrzenia się wyłącznie na komórki sąsiednie. Efekt cytopatogenny infekcji wirusem grypy powoduje powstanie kolistej strefy zakażonych komórek, zwanej plackiem. Każdy plack powstaje prawdopodobnie po zakażeniu pojedynczej komórki pojedynczą cząsteczką wirusa, a następnie w wyniku replikacji wirusa. Kontrast między żywymi komórkami a plackami można wzmocnić za pomocą barwników, takich jak fiolet krystaliczny. Główną wadą tej metody jest brak powtarzalności i duże różnice w obrębie poszczególnych doświadczeń. Innym testem stosowanym do określania miana wirusa grypy jest test hemaglutynacji. Białko hemaglutynina obecne na powierzchni wirusa grypy efektywnie wiąże się z białkami zawierającymi kwas N-acetyloneuraminowy w erytrocytach ssaków i ptaków ¹. Oddziaływanie to między wirusem grypy a erytrocytami prowadzi do aglutynacji w formie sieci. Poziom aglutynacji jest wykorzystywany do oszacowania miana wirusa grypy w badanych próbkach. Test aglutynacji erytrocytów jest stosowany wyłącznie do określania miana znanego wirusa i nie może być użyty do identyfikacji szczepów. Ponieważ test ten nie odróżnia wirusów żywych od martwych, trudno jest uzyskać precyzyjne obliczenia miana wirusów.

Obecna diagnostyka kliniczna zakażeń grypą opiera się na badaniach serologicznych, reakcji polimerazy łańcuchowej, bezpośredniej immunofluorescencji próbek oraz hodowli komórkowych ^1,6. Nowa metoda opisana w niniejszej pracy posiada również potencjał diagnostyczny w warunkach klinicznych i laboratoryjnych. Zestawy do wykrywania grypy Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) oraz BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) wykorzystują test immunochromatograficzny do wykrywania antygenów wirusowych, takich jak nukleoproteina ⁷. Przy użyciu tych zestawów wykrycie wirusa jest możliwe w ciągu 15 min; jednak wszystkie próbki negatywne muszą zostać poddane dalszej weryfikacji metodą hodowli komórkowych. W różnych badaniach zgłaszano również niską czułość tych zestawów, szczególnie w przypadkach przebiegu łagodnego lub niskiego poziomu zakażenia ⁸. W naszej metodzie konsekwentnie wykrywamy ładunek wirusa już na poziomie 100 PFU. Sugeruje to, że nasza technika jest użyteczna w wykrywaniu wirusa H1N1 w próbkach klinicznych, nawet przy łagodnym przebiegu infekcji. Opisano metodę opartą na fluorescencji do wykrywania antygenów wirusowych, w której analizowano bezpośrednio aspiraty z nosogardzieli lub inokulowano je na monowarstwę podatnych komórek w celu namnożenia wirusa i późniejszych analiz ⁹. Jednak metody te mają ograniczone zastosowanie diagnostyczne i nie nadają się do obliczania miana wirusa. qPCR pomaga zidentyfikować obecność wirusowego RNA, ale nie szacuje zakaźności żywych wirusów. W porównaniu z tymi analizami, system testowy oparty na barwniku IR pomoże w wykrywaniu i oznaczaniu miana wirusa w próbkach klinicznych i laboratoryjnych. W przypadku epidemii grypy kluczowe jest zdiagnozowanie tysięcy próbek w krótkim czasie. Nasza metoda, oparta na płytce 384-dołkowej i skanerze IR, umożliwia skanowanie 6 płytek jednocześnie (>2 000 próbek), co daje znaczną przewagę nad innymi bezpośrednimi metodami fluorescencyjnymi. Możliwość szybkiego przetwarzania tysięcy próbek klinicznych mogłaby zmniejszyć zmienność testów, czas trwania analizy oraz koszty. Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla białka M2 daje korzyść w postaci niezależności od różnic szczepowych w białkach H i N. Białko M2 jest stosunkowo konserwatywne w większości szczepów grypy zakażających ludzi. Jeśli przeciwciała specyficzne dla krążących szczepów zostaną połączone z naszym systemem, można będzie zmierzyć miano wirusa oraz zidentyfikować szczep. Jednakże, ponieważ M2 jest celem dla leków podobnych do amantadyny, mogą pojawić się mutanty, które mogą zmienić miejsce wiązania dla użytego tutaj mAb. Stanowi to potencjalne ograniczenie tego systemu u osób leczonych tymi lekami.

Do oznaczania mian wirusa grypy w próbkach testowych stosuje się wiele testów. W celu obliczenia miana wirusa powszechnie wykorzystuje się 50% zakaźną dawkę tkankową (TCID₅₀) oraz testy oparte na płynie allantoicznym jaj ^1,10. Jednakże konieczność prowadzenia badań przez wiele dni sprawia, że metody te są mniej wiarygodne. Co więcej, w tych metodach obliczenia oparte na 50% zmianie liczby placków dają wyniki teoretyczne, a nie dokładne miana wirusa. Testy tworzenia placków można przeprowadzić w ciągu 96 godzin, jednak głównym problemem w obliczeniach miana wirusa jest brak powtarzalności. Opisana tutaj technika posiada kilka wyraźnych zalet. Po pierwsze, jest to technika wysoce powtarzalna, dająca spójne wyniki. Po drugie, obliczenia miana wirusa opierają się na prostej kwantyfikacji intensywności fluorescencji, które są porównywane z określonymi krzywymi wzorcowymi. Po trzecie, do diagnostyki wielu serotypów w danej próbce można użyć dwóch lub więcej przeciwciał pierwszorzędowych. Ponadto przeciwciała sprzężone z barwnikami IR wykazują minimalną autofluorescencję i są stosowane do obrazowania komórek ¹¹. Promieniowanie UV lub światło widzialne (300-600 nM) powoduje wysoką autofluorescencję komórkową ze względu na obecność endogennych fluoroforów o wysokiej wydajności kwantowej. Należą do nich aromatyczne aminokwasy, lipopigmenty, nukleotydy pirydynowe (NADPH), elastyna, kolagen i koenzymy flawinowe. Ta immanentna właściwość komórek utrudnia wykorzystanie tych źródeł promieniowania jako sond do ilościowego oznaczania ekspresji specyficznych białek. W przeciwieństwie do nich, barwniki bliskiej podczerwieni (near-IR) pobudzają i emitują światło w zakresie 670-1000 nm. Wiele cząsteczek komórkowych gospodarza i węglowodorów poliaromatycznych nie ulega pobudzeniu przy tej długości fali i ze względu na zredukowane rozpraszanie światła emituje niezwykle niską fluorescencję tła. Co więcej, okno między tłem a specyficzną detekcją jest znacznie szersze dzięki wysokiemu współczynnikowi ekstynkcji fluoroforów bliskiej podczerwieni. Fotostabilność oraz lepszy stosunek sygnału do szumu są niezwykle istotne w kwantyfikacji mian wirusa. Zastosowanie komór mikroprzepływowych zautomatyzuje proces przesiewowy dzięki sterowaniu robotycznemu i mogłoby umożliwić nam łatwe badanie wysoce zaraźliwych próbek klinicznych. Zatem wykorzystanie barwników bliskiej podczerwieni w tych metodach jest optymalne i wysoce wiarygodne w celu oznaczania mian wirusa w próbkach tkanek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Seryjna albumina wołowa	Atlanta Biologicals	S11750
Wirus PR8			Od dr. Thomasa M. Morana
Kozie przeciwciało anty-mysie IRDye@800	LI-COR Biosciences	926-32210	roztwór 1:200
Skaner IR LI-COR Odyssey	LI-COR Biosciences	9201-01
Płytka 384-dołkowa z płaskim dnem	Nalge Nunc international	164730
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem	Nalge Nunc international	165305
Pożywka DMEM	Invitrogen	11965126
Pożywka RPMI	Invitrogen	11875135
Wodorowęglan sodu	Invitrogen	25080
L-glutamina 100x	Invitrogen	25030
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	R001100
Piwczan sodu	Invitrogen	11360070
Przeciwciało anty-M-2			Od dr. Thomasa M. Morana
mAb anty-NP	CDC	V2S2208	Uzyskano na podstawie MTA