In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Podsumowanie

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

Streszczenie

Naturalne biomolekularne maszyny działają w każdej żywej komórce i wykazują różnorodność konstrukcji ^1-6. Jednak rozwój sztucznych maszyn molekularnych koncentruje się na urządzeniach zdolnych do ruchu kierunkowego, tzn. motorach molekularnych, oraz na ich zminiaturyzowanych częściach mechanicznych (kołach, osiach, zawieszkach itp.) ^7-9. Jest to naśladownictwo makro-maszyn, mimo że właściwości fizyczne kluczowe dla tych urządzeń, takie jak bezwładność i zachowanie pędu, nie mają zastosowania w środowiskach nanoskali ¹⁰. Alternatywne konstrukcje, które nie opierają się na schematach mechanicznych makro-maszyn i wykorzystują mechanizmy wypracowane w toku ewolucji cząsteczek biologicznych, mogą wykorzystać specyficzne warunki nanoskali. Ponadto adaptacja rzeczywistych cząsteczek biologicznych do celów nanoprojektowania zmniejsza potencjalne zagrożenia, jakie mogą stwarzać produkty nanotechnologii. Prezentujemy tutaj montaż i zastosowanie jednej z takich konstrukcji opartych na biologii – półsztucznego urządzenia molekularnego, które łączy naturalnie występującą maszynę molekularną z komponentami sztucznymi. Z punktu widzenia enzymologii nasza konstrukcja jest zaprojektowanym fluorescencyjnym kompleksem enzym-substrat, stworzonym w celu pełnienia konkretnej, użytecznej funkcji. Zespół ten jest z definicji maszyną molekularną, ponieważ zawiera jedną taką jednostkę ¹². Jednak jego integracja z częścią zaprojektowaną – fluorescencyjną podwójną spinką (hairpin) – przekierowuje go do nowego zadania, jakim jest znakowanie uszkodzeń DNA¹².

Nasza konstrukcja składa się z 32-merowego DNA oraz enzymu topoizomerazy I szczepu vaccinia (VACC TOPO). Następnie układ ten wykorzystuje własny materiał do wytworzenia dwóch znakowanych fluorescencyjnie jednostek detekcyjnych (Rysunek 1). Jedna z jednostek (fluorescencja zielona) posiada kowalencyjnie przyłączoną do końca 3' VACC TOPO, a druga jednostka (fluorescencja czerwona) jest wolną spinką z terminalnym 3'OH. Jednostki te są krótkotrwałe i szybko ponownie łączą się w pierwotną konstrukcję, która następnie ulega ponownemu rozcięciu. W przypadku braku pęknięć DNA dwie te jednostki nieustannie rozdzielają się i ligują w sposób cykliczny. W przekrojach tkankowych z uszkodzeniami DNA jednostka detekcyjna zawierająca topoizomerazę selektywnie przyłącza się do tępich pęknięć DNA z końcem 5'OH (pęknięcia typu DNase II)^11,12, znakując je fluorescencyjnie. Druga spinka pozbawiona enzymu, powstała po rozcięciu oligonukleotydu, liguje się do tępego pęknięcia z końcem 5'PO₄ (pęknięcia typu DNase I)^11,12, jeżeli w roztworze obecna jest ligaza DNA T4 ^13,14. Po dodaniu ligazy DNA T4 do przekroju tkankowego lub roztworu zawierającego DNA z tępymi pęknięciami 5'PO₄, ligaza reaguje z końcami DNA 5'PO₄, tworząc półstabilne kompleksy enzym-DNA. Tępe spinki oddziałują z tymi kompleksami, uwalniając ligazę i kowalencyjnie łącząc spinki z DNA, co prowadzi do znakowania tępych pęknięć DNA z końcem 5'PO₄.

Opracowanie to stanowi przykład nowego praktycznego podejścia do projektowania maszyn molekularnych i dostarcza użytecznego sensora do wykrywania apoptozy oraz uszkodzeń DNA w utrwalonych komórkach i tkankach.

Protokół

Sekcje do detekcji opartej na maszynach molekularnych należy przygotować w pierwszej kolejności, ponieważ ich przygotowanie zajmuje więcej czasu niż montaż urządzenia molekularnego. Konstrukcja ta sprawdza się przy zastosowaniu skrawków o grubości 5-6μm, wyciętych z bloków tkankowych utrwalonych w paraformaldehydzie i zatopionych w parafinie. Należy używać marek szkiełek, które dobrze utrzymują skrawki, takich jak naładowane i oczyszzczone szkiełka ProbeOn Plus (Fisher Scientific) lub podobne. Na początku zalecamy użycie tkanki o dobrze znanym wzorcu uszkodzeń DNA, zawierającej pęknięcia typu DNase I oraz DNase II, takiej jak apoptotyczny grasica szczura traktowana deksametazonem ^13,14.

1. Przygotowanie przekrojów

1. Umieścić skrawki w kasecie do slajdów i odparafinować w ksylenie przez 15 min, następnie przenieść do świeżej kąpieli z ksylenem na dodatkowe 5 minut.
2. Rehydratować, przepuszczając przez szereg stężeń etanolu: etanol 96% – 2x5 min; etanol 80% – 5 min; woda – 2x5 min.
3. Trawić skrawki Proteinazą K. Użyć 100 μL roztworu o stężeniu 50 μg/mL na skrawek. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (23° C) w komorze nawilżanej. Czas może wymagać dostosowania w zależności od rodzaju tkanki. Tkanki twarde mogą wymagać dłuższego trawienia. Zazwyczaj stosuje się czas od 15 do 25 min. Niedostateczne trawienie może skutkować słabszym sygnałem. Z kolei nadmierne trawienie prowadzi do zaniku sygnału i uszkodzenia skrawka.
4. Płukać w wodzie destylowanej przez 2x10 min.
5. Nanieść 100 μL 2% BSA na skrawek w celu wstępnego blokowania. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (23° C). W tym czasie przygotować urządzenie molekularne.

2. Montaż maszyn molekularnych

Wszystkie odczynniki są odmierzone dla całkowitej objętości 25 μL, co jest wystarczające do pojedynczej detekcji w przekroju tkanki o przeciętnej wielkości (10x10mm). Objętość można zwiększyć w zależności od potrzeb.

1. Połączyć w małej plastikowej probówce w następującej kolejności:

Woda bidestylowana; 15% glikol polietylenowy-8000; Roztwór 66 mM-Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.1 mM ditiotreitol, 1 mM ATP (tj. standardowy bufor ligazy DNA T4); 70 pmoli Oligonukleotydu 1, 215 pmoli (1.76 - 7.1 μg) VACC TOPO 10 jednostek ligazy DNA T4 (500 U/mL)

2. Wymieszaj delikatnie, pipetując. Konstrukt molekularny niemal natychmiast ulega samozłożeniu w tym roztworze i może być użyty bezzwłocznie w temperaturze pokojowej (23° C). Podniesienie temperatury do 37° C blokuje etap znakowania oparty na ligazie DNA T4.

3. Wykorzystanie maszyn molekularnych w przekrojach tkanek do podwójnego znakowania pęknięć DNA o końcach 5'OH i 5'PO4

1. Odssać roztwór blokujący i nanieść 25μL pełnej mieszaniny reakcyjnej zawierającej 70 pmoles Oligonukleotydu 1, 53 - 215 pmoles (1,76 - 7,1 μg) VACC TOPO oraz 10 jednostek ligazy DNA T4 (500 U/mL) w roztworze 66 mM-Tris HCl, pH 7,5, 5mM MgCl₂, 0,1 mM ditiotreitolu, 1 mM ATP oraz 15% glikolu polietylenowego-8000. Do detekcji pojedynczego rodzaju pęknięć DNA zamiast tego można użyć oligonukleotydu o tej samej sekwencji z pojedynczym znacznikiem FITC, Oligonukleotydu 2. W takim przypadku należy pominąć ligazę w reakcji znakowania. W tej sytuacji zamiast buforu ligazy DNA T4 można zastosować roztwór 50mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000.
2. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (23° C) w wilgotnej komorze z plastikowym szkiełkiem zakryjącym. Chronić przed światłem. Obniżenie temperatury do 16° C zmniejsza sygnał zależny od ligazy; zwiększenie temperatury do 37° C całkowicie eliminuje sygnał zależny od ligazy. W mieszaninie reakcyjnej czasami występuje częściowe hamowanie ligazy, prawdopodobnie z powodu zanieczyszczeń wprowadzonych wraz z preparatami topoizomerazy. Dlatego może być wymagana dłuższa inkubacja (2-4 godziny), szczególnie gdy obecna jest znaczna liczba pęknięć znakowanych ligazą. Chociaż na tym etapie można obserwować sygnały zarówno ligazy, jak i topoizomerazy, w wielu przypadkach sygnał ligazy można dodatkowo wzmocnić poprzez ponowne naniesienie mieszaniny reakcyjnej bez VACC TOPO i podwójnie znakowanego oligonukleotydu, ale zawierającej oligonukleotyd o kształcie spinki do włosów (Oligonukleotyd 3) (35 mg/mL) i ligazę DNA T4 (250 U/mL). Aby wzmocnić sygnał przejść do Kroku 3, aby zobaczyć reakcję bez wzmocnienia przejdź do Kroku 5.
3. Usunąć szkiełka zakryjące, delikatnie zanurzając preparaty pionowo w naczyniu Coplina zawierającym wodę w temperaturze pokojowej. Odssać nadmiar wody.
4. Wzmocnić sygnał ligazy, nanosząc 25 μL mieszaniny reakcyjnej bez VACC TOPO i Oligonukleotydu 1, ale zawierającej Oligonukleotyd 3: 66 mM-Tris HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM ditiotreitolu, 1 mM ATP oraz 15% glikolu polietylenowego-8000, 5 jednostek ligazy DNA T4, 35 mg/mL Oligonukleotydu 3 (tępo zakończona spinka do włosów). Całkowitą objętość roztworu znakującego można zwiększyć, aby dostosować ją do większych przekrojów. Inkubować przez 18 h (całą noc) w temperaturze pokojowej (23° C) w wilgotnej komorze z plastikowym szkiełkiem zakryjącym.
5. Usunąć szkiełka zakryjące, delikatnie zanurzając preparaty pionowo w naczyniu Coplina zawierającym wodę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć przekrój 3x10 min w wodzie destylowanej.
6. Przepłukać buforem wodorowęglanu sodu. Płukanie roztworem zasadowym wzmacnia fluorescencję FITC, która jest wrażliwa na pH i ulega znacznemu zmniejszeniu poniżej pH 7.
7. Przykryć przekrój roztworem przeciwblaknącym (Vectashield z DAPI), szkiełkiem zakryjącym i przeanalizować sygnał za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pęknięcia dwuniciowe DNA z 5'OH będą fluorescować na zielono, a pęknięcia 5'PO₄ – na czerwono (Rysunek 2).

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Półsztuczna maszyna molekularna wykrywa dwa rodzaje uszkodzeń DNA in situ. Fluorescencyjna maszyna ulega samomontażowi, gdy VACC TOPO wiąże się z 32-merem o strukturze podwójnej spinki do włosów. Maszyna rozpoczyna pracę, dzieląc się na dwie jednostki detekcyjne poprzez nacięcie wykonane przez topoizomerazę na końcu 3' sekwencji rozpoznawczej. Prowadzi to do procesu cyklicznego, w którym jednostka znakowana FITC stale oddziela się i ponownie liguje z jednostką znakowaną rodamina. Proces ten trwa do momentu napotkania wykrywalnego pęknięcia DNA. Gdy w przekroju tkanki obecny jest taki alternatywny akceptor (pęknięcie DNA z tępym końcem 5'OH), część FITC liguje się do niego. Pozostała część rodamina przyłącza się do pęknięć DNA z tępymi końcami 5' PO₄ przy pomocy ligazy DNA T4. W konsekwencji oba rodzaje pęknięć DNA są wykrywane jednocześnie.

Rysunek 2. Maszyna molekularna podwójnie znakuje dwa rodzaje pęknięć DNA w przekroju tkanki grasicy traktowanej deksametazonem. Tępe pęknięcia DNA typu DNase I i DNase II są wykrywane w obszarach korowych grasicy podlegających apoptozie. Zielona fluorescencja cytoplazmatyczna (pęknięcia DNA 5'OH) znakuje makrofagi korowe trawiące materiał jądrowy apoptotycznych tymocytów. Sygnał ten jest generowany przez VACC TOPO i lokalizuje się w fagolizosomach z DNA zawierającym pęknięcia dwuniciowe 5'OH ^11,12. Czerwona fluorescencja (pęknięcia 5'PO₄) znakuje jądra apoptotycznych tymocytów, które nie zostały pochłonięte przez makrofagi. Masowe liczby tymocytów jednocześnie przechodzą apoptozę, której towarzyszy powstawanie pęknięć dwuniciowych 5'PO₄, wizualizowanych za pomocą znakowania opartego na ligazie. Pęknięcia te znajdują się na obrzeżach jądra, tworząc wzory w kształcie pierścieni. Wszystkie jądra komórkowe są wizualizowane poprzez przeciwbarwienie DAPI (fluorescencja niebieska).

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, jak składać i wykorzystywać dwuetykietowy czujnik uszkodzeń DNA. Czujnik ten jest maszyną molekularną napędzaną przez biomolekularny silnik – białko VACC TOPO kodowane przez wirusa, połączone z komponentami sztucznymi. Przedstawiona konstrukcja egzemplifikuje podejście biologiczne, które opowiada się za adaptowaniem struktur biologicznych, architektur oraz faktycznych części i komponentów komórek do projektowania nietoksycznych urządzeń w skali molekularnej ^12,15. Podejście to rozwi...