Identyfikacja partnerów oddziałujących z białkami za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa

Summary

Tandemowe oczyszczanie powinowactwa jest solidnym podejściem do identyfikacji partnerów wiążących białka. Jako dowód słuszności koncepcji, metodologia ta została zastosowana do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu współwytrącenia czynników komórki gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metodę tę można łatwo dostosować do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Abstract

Krytycznym i często ograniczającym krokiem w zrozumieniu funkcji białek gospodarza i wirusa jest identyfikacja oddziałujących na siebie komórkowych lub wirusowych partnerów białkowych. Istnieje wiele podejść, które umożliwiają identyfikację oddziałujących partnerów, w tym systemu hybrydowego drożdży dwa, a także testy ściągające z wykorzystaniem białek rekombinowanych i immunoprecypitacji białek endogennych, a następnie identyfikację za pomocą spektrometrii mas¹. Ostatnie badania podkreśliły użyteczność oczyszczania za pośrednictwem znacznika o podwójnym powinowactwie, w połączeniu z dwoma specyficznymi etapami elucji w identyfikacji oddziałujących białek. To podejście, zwane tandemowym oczyszczaniem powinowactwa (TAP), było początkowo stosowane u drożdży^2,3, ale ostatnio zostało przystosowane do stosowania w komórkach ssaków^4-8.

Jako dowód słuszności koncepcji opracowaliśmy metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) przy użyciu dobrze scharakteryzowanego eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF4E^9,10. Komórkowy czynnik translacyjny eIF4E jest krytycznym składnikiem komórkowego kompleksu eIF4F biorącego udział w inicjacji translacji zależnej od czapeczki¹⁰. Znacznik TAP użyty w obecnym badaniu składa się z dwóch jednostek białka G i peptydu wiążącego streptawidynę, oddzielonych sekwencją rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Znacznik TAP użyty w obecnym badaniu składa się z dwóch jednostek białka G i peptydu wiążącego streptawidynę, oddzielonych sekwencją⁸ rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Aby zrezygnować z konieczności generowania klonalnych linii komórkowych, opracowaliśmy szybki system, który opiera się na ekspresji białka przynęty znakowanego TAP z episomalnie utrzymywanego plazmidu opartego na pMEP4 (Invitrogen). Ekspresję znakowanego mysiego eIF4E z tego plazmidu kontrolowano za pomocą indukowanego chlorkiem kadmu promotora metalotioneiny.

Liza komórek wyrażających ekspresję i późniejsze oczyszczenie powinowactwa poprzez wiązanie z agarozą IgG królika, rozszczepienie proteazy TEV, wiązanie z agarozą związaną ze streptawidyną i późniejsza elucja biotyny zidentyfikowały liczne białka najwyraźniej specyficzne dla ściągania eIF4E (w porównaniu do linii komórek kontrolnych wyrażających sam znacznik TAP). Tożsamość białek uzyskano przez wycięcie prążków z 1D SDS-PAGE, a następnie tandemową spektrometrię mas. Zidentyfikowane komponenty obejmowały znane białka wiążące eIF4E, eIF4G i 4EBP-1. Ponadto zidentyfikowano inne składniki kompleksu eIF4F, którego składnikiem jest eIF4E, a mianowicie eIF4A i białko wiążące Poly-A. Zdolność do identyfikacji nie tylko znanych bezpośrednich partnerów wiążących, ale także drugorzędowych białek oddziałujących dodatkowo podkreśla użyteczność tego podejścia w charakterystyce białek o nieznanej funkcji.

Protocol

1. Generowanie linii komórkowych: transfekcja / ekspresja pMEP4

1. Transfekować komórki wektorem ekspresyjnym pMEP4 i wybierać za pomocą 100 μg higromycyny B / ml (Roche), aż wszystkie pozorowane transfekowane komórki zostaną uśmiercone. Plazmid pMEP4 jest utrzymywany episomalnie, więc nie ma potrzeby izolowania określonych klonów.
2. Komórki zawierające wektor pMEP4 można indukować przez traktowanie 10 μM CdCl₂ przez 16 godzin. Ekspresja i indukowalność powinny być potwierdzone na małą skalę przed amplifikacją linii komórkowych. Białko znakowane TAP można łatwo wykryć, ponieważ domeny białka G wiążą się z przeciwciałami prawie wszystkich gatunków. Do oczyszczania na dużą skalę zwykle wymagane jest 10 zlewających się 175 cm² kolb komórek. Odpowiada to około 2 komórkom X10⁸ wykazującym ekspresję.

2. Przygotowanie lizatu komórkowego

1. Zeskrobać komórki do PBS i połączyć w jedną probówkę o pojemności 50 ml. Wiruj 1200X g przez 5 minut (powinno to dać 2-3 ml upakowanych komórek na początek, co po umyciu zmniejsza się do około 1,5 ml).
2. Umyj komórki trzy razy w lodowatym PBS (za każdym razem 50 ml).
3. Lizuj komórki w 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl₂, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄ i inhibitor proteazy). Uwaga: NaF, Na₃VO₄ i inhibitory proteazy należy dodawać świeże. Pipetę w górę i w dół 10 razy przed pozostawieniem na 5 minut na lodzie. Strzykawkę w górę i w dół 5-10 razy za pomocą igły przed ponownym pozostawieniem na lodzie na 5 minut na lodzie. Powtórzyć strzykawkę i pozostawić na kolejne 5 minut na lodzie.
4. Dwukrotnie zamrozić i rozmrozić lizat (płynny N₂ / lub suchy lód i etanol). Nie pozwól, aby próbka osiągnęła temperaturę wyższą niż 4°C. Uwaga: możesz przechowywać tę próbkę w temperaturze -80°C, dopóki nie będziesz mieć czasu na przetworzenie.
5. Porcję próbki rozlać do probówek o pojemności 1,5 ml i usunąć niezlizowane komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie (10 minut w temperaturze 4°C, 16 000 razy więcej niż g).
6. Odzyskać supernatant, połączyć w probówce Falcon o pojemności 15 ml i (opcjonalnie) przepuścić przez filtr 0,45 μm przed pobraniem próbki o objętości 20 μl w celu ilościowego określenia wydajności białka. Pobrać kolejne 50 μl podwielokrotności do dalszej analizy (próbka 1).

3. Wiązanie z króliczą IgG-agarozą

(Uwaga: Wszystkie wirowania powinny być wykonywane przy 1200X g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Delikatnie zawiesić roztwór króliczej IgG-agarozy (Sigma-Aldrich) za pomocą wirującej butelki. Weź 380 μl agarozy IgG (używając naciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml) i usuń płyn transportowy/konserwujący przez odwirowywanie przez 1 minutę. Przemyć agarozę trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy (4°C) za pomocą wirowania w celu sklarowania. Ostateczny plon agarozy powinien wynosić około 250 μl zapakowanych kulek.
2. Dodać oczyszczony lizat komórkowy z 2,6 (w 15 ml probówce sokoła) do umytej agarozy króliczej IgG i inkubować przez 3 godziny (lub noc) w temperaturze 4°C przy użyciu mieszalnika obrotowego.
3. Odwirowywać kulki agarozy przez 5 minut w temperaturze 4°C i usunąć supernatant do dalszej analizy (próbka 2). Uwaga: Białko oznaczone tagiem TAP powinno być teraz powiązane z kulkami.

4. Rozszczepienie proteazy TEV

(Uwaga: Wszystkie wirowania powinny być wykonywane przy 1200X g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4oC przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Umyć koraliki agarozy IgG królika trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy (4°C) za pomocą wirowania w celu sklarowania (uwaga: bufor do lizy nie powinien zawierać inhibitorów proteazy). Należy uważać, aby nie usunąć ani nie zgubić żadnych koralików podczas etapów prania.
2. Przemyć kulki jeszcze dwa razy buforem rozszczepienia TEV-proteazy (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl i 0,2% NP-40) za pomocą wirówki w celu sklarowania. Po ostatnim praniu ostrożnie usuń cały płyn z koralików.
3. Przygotuj mieszankę rozszczepienia proteazy TEV; dla każdej próbki należy dodać 467,5 μl_H2O, 25 μl 20x bufor TEV (Invitrogen), 5 μl 0,1 M DTT i 2,5 μl (25 U) proteazy TEV (Invitrogen). Dodać 500 μl tej mieszanki do rozszczepiania TEV do każdej próbki upakowanych kulek i przenieść całą mieszankę do wstępnie nasmarowanej probówki o pojemności 1,7 ml (Costar). Przed inkubacją pobrać 30 μl podwielokrotności do dalszej analizy (próbka 3).
4. Inkubować reakcję proteazy TEV przez noc w temperaturze 4°C za pomocą mieszalnika obrotowego. Należy zauważyć, że można stosować krótsze czasy inkubacji w zależności od charakteru białka przynęty i dostępności miejsca rozszczepienia proteazy TEV, ale minimalny czas inkubacji powinien być określony empirycznie.

5. Wiązanie z koralikami Ultralink Immobilized Streptavidin Plus

(Uwaga: Wszystkie wirowania powinny być wykonywane przy 1200X g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Odwirować reakcję rozszczepienia TEV zawierającą kulki agarozy IgG królika przez 5 minut w temperaturze 1200 x g (4°C). Pobrać 20 μl podwielokrotności sklarowanego supernatantu do analizy (próbka 4)
2. Pozostały sklarowany sklaratysz (około 480 μl) przenieść do świeżej, wstępnie nasmarowanej probówki o pojemności 1,5 ml (Costar) i pozostawić na lodzie. Nie wyrzucaj tego supernatantu – zawiera on białko przynęty TEV i wszelkie związane z nim białka wiążące.
3. Dodać 500 μl schłodzonego buforu do lizy (sekcja 2.3) do pozostałych kulek agarozy króliczej IgG i zawiesić. Odwirować tę mieszaninę w celu sklarowania kulek przed usunięciem supernatantu i połączeniem go z supernatantem z kroku 5.2. Pozostaw tę probówkę na lodzie (powinna teraz zawierać ~980 μl próbki).
4. Zachować kulki agarozy IgG królika do późniejszej analizy (próbka 5). Uwaga: jeśli przeprowadzisz tę próbkę na żelu SDS-PAGE (lub western blot), da ona dużo tła ze względu na obecność ciężkich i lekkich łańcuchów IgG.
5. W międzyczasie delikatnie wymieszaj kulki agarozowe Ultralink Immobilized Streptavidin Plus (Pierce), obracając butelkę. Używając końcówki pipety o pojemności 200 μl z nacięciem końcowym, rozatrakować 70 μl kulek streptawidyny na próbkę do wstępnie nasmarowanych probówek o pojemności 1,5 ml i usunąć roztwór transportowy/konserwujący przez odwirowanie. Uwaga: te koraliki są bardzo małe, więc można użyć końcówek "z kaczym dziobem" lub płaskich/wąskich końcówek, aby zminimalizować utratę koralików podczas prania.
6. Umyć kulki streptawidyny trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy (4°C) za pomocą wirowania w celu sklarowania. Powinno to pozostawić około 45-50 μl zapakowanych kulek na tubę.
7. Przenieść supernatant rozszczepienia proteazy TEV (tj. 980 μl próbki z kroku 5.3) do probówki zawierającej przemyte kulki streptawidyny i inkubować przez 3 godziny (lub noc) w temperaturze 4 °C przy użyciu mieszalnika obrotowego.
8. Odkręcać kulki streptawidyny przez 5 minut w temperaturze 4°C i usunąć supernatant do dalszej analizy (próbka 6). Umyć kulki streptawidyny trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy (4°C) za pomocą wirowania w celu sklarowania. Po ostatnim praniu ostrożnie usuń cały pozostały bufor do mycia.

6. Elucja biotyny peptydu wiążącego streptawidynę i białka przynęty

(Uwaga: Wszystkie wirowania powinny być wykonywane przy 1200X g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Elute znakowane białka z kulek streptawidyny należy usunąć, dodając 500 μl PBS:Biotyny (1 mM D-biotyny) i inkubując w temperaturze 4°C przez 3 godziny (lub noc) za pomocą mieszalnika obrotowego.
2. Odkręcać kulki streptawidyny przez 5 minut w temperaturze 4°C i usunąć supernatant do wstępnie nasmarowanej probówki o pojemności 1,5 ml (Uwaga: to jest twoja końcowa próbka/elucja (próbka 7).
3. Dodaj kolejne 500 μl Biotyny:PBS do pozostałych kulek streptawidyny i inkubuj w temperaturze 4°C przez 2-3 godziny (lub noc) za pomocą mieszalnika obrotowego.
4. Powtórzyć krok 6.2 i połączyć dwie eluty (próbka 7). Ta końcowa elucja może być przechowywana w temperaturze -80°C.
5. Aby ocenić skuteczność elucji biotyny, należy zamrozić pozostałe kulki streptawidyny i zagotować je później w buforze próbki SDS (próbka 8) (zalecenia: LaneMarker 5x redukujący bufor próbki firmy Fisher).

7. Stężenie białka

1. Końcowy eluat (próbka 7) musi zostać zagęszczony przed analizą ze względu na niskie stężenie białka i stosunkowo dużą objętość. Można to osiągnąć za pomocą kolumn wirowych Vivaspin o niskiej masie cząsteczkowej (<5 KDa) (Vivascience). Staraj się skoncentrować objętość poniżej 100 μl. Ta końcowa próbka może być gotowana i przechowywana w buforze do próbek białkowych (zalecenia: LaneMarker 5x redukujący bufor do próbek firmy Fisher).

8. Analiza

1. Próbki 1-8 można analizować za pomocą western blot w celu określenia skuteczności ściągania. Uwaga: Większość przeciwciał drugorzędowych będzie reagować krzyżowo z domenami białka G białka fuzyjnego, ale jest to usuwane po rozszczepieniu proteazy TEV.
2. Próbka 7 może być analizowana przez 1D lub 2D SDS-PAGE. Barwienie można wykonać przy użyciu srebra lub Coomassie (zalecenia: zestawy do barwienia SilverQuest Silver i Colloidal Blue Coomassie firmy Invitrogen). Identyfikację białek można przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas.

9. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy 1D SDS-PAGE końcowej elucji (Próbka 7) z tego protokołu w celu identyfikacji partnerów wiążących TAP oznaczony jako eIF4E znajduje się na rysunku 2. Ten reprezentatywny żel odzwierciedla złożony i obfity charakter interakcji eIF4E z innymi białkami w komórce. Porównanie z kontrolą ujemną również pokazaną na rysunku 2, wygenerowaną z linii komórkowej wyrażającej tylko znacznik TAP, ilustruje specyficzność tego ściągania z przynętą eIF4E. W tym przypadku 15% skoncentrowanej końcowej elucji (próbka 7) zostało przeanalizowane przez 1D SDS-PAGE przy użyciu dostępnych na rynku wstępnie obrobionych żeli gradientowych przed barwieniem przy użyciu zestawu do barwienia srebra Silverquest firmy Invitrogen.

Zazwyczaj 50-85% pozostałej skoncentrowanej końcowej elucji (Próbka 7) jest analizowane za pomocą koloidalnego barwnika Coomassie (Invitrogen). Próbki (plastry/pasma żelu) z całego pasa zostały następnie wyekstrahowane i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas.

Białka zidentyfikowane w pull-down eIF4E zostały przefiltrowane względem partnerów wiążących z kontroli negatywnej w celu zidentyfikowania niespecyficznych partnerów wiążących. Końcowe białka zidentyfikowane za pomocą tego procesu znakowania TAP eIF4E można zobaczyć na rysunku 2, który jest reprezentatywny dla normalnych białek zidentyfikowanych za pomocą tej techniki. Ponadto zidentyfikowano również szereg podjednostek eIF3 (dane nie pokazane).

Rysunek 1. Schemat procedury oczyszczania powinowactwa w tandemie. Sześcioetapowy protokół tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) obejmuje generowanie linii komórkowych, lizę komórek, immunoprecypitację agarozy IgG królika, rozszczepianie proteazy TEV, oczyszczanie powinowactwa kulek streptawidyny i wreszcie elucję biotyny.

Rysunek 2. Tandemowe oczyszczanie powinowactwa mysiego białka eIF4E. Oddziałujący partnerzy N terminalnie oznaczonego TAP eIF4E zostali oczyszczeni z eukariotycznych komórek HEK293 przy użyciu dołączonego protokołu. 20% frakcję końcowej elucji (próbka 7) analizowano za pomocą SDS-PAGE na wstępnie wylanym żelu o gradiacji 4-12% (pas TAP-eIF4E). Analogiczną analizę przeprowadzono dla samego znacznika (pas TAP). Białka zidentyfikowano za pomocą barwienia srebrem. Białka zidentyfikowane następnie za pomocą spektrometrii mas tej samej próbki są podświetlane na tym żelu.
Skróty: eIF4G; eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 gamma, PABP; białko wiążące poliA, eIF4A: eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 alfa, SBP-eIF4e; pozostałe białko przynęty TAP zawierające peptyd wiążący streptawidynę połączony z eukariotycznym czynnikiem inicjującym translację 4E, 4EBP; białka wiążące eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E, eIF4eNiF1l eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E, czynnik importu jądrowego 1, SBP; pozostały peptyd wiążący streptawidynę z nieskondensowanego peptydu TAP TEV.

Discussion

Przedstawiona tutaj technika znakowania TAP demonstruje wysoce specyficzną i rygorystyczną metodę izolowania partnerów wiążących białka przynęty w komórkach eukariotycznych. Takie podejście można zastosować zarówno do białek komórkowych, jak i wirusowych. O ile nam wiadomo, jest to pierwszy raz, kiedy taka technika została zastosowana do czynnika inicjacji translacji eIF4E. Identyfikacja znanych białek wiążących eIF4E, eIF4G i 4EBP przy użyciu tej techniki, potwierdza słuszność takiego podejścia. Ponadto identyfikacja pozostałego składnika kompleksu eIF4F, a mianowicie eIF4A, oraz PABP potwierdza, że oddziaływanie pośrednie i kompleksy trzeciorzędowe pozostają nienaruszone podczas procesu oczyszczania. Oczywista była również identyfikacja wielu izoform kanonicznych białek wiążących eIF4e. Są one opisane bardziej szczegółowo na rysunku 2.

Jeśli chodzi o ograniczenia tego podejścia, należy zachować pewną ostrożność w odniesieniu do wyboru białka przynęty oraz tego, czy umieścić znacznik TAG na końcu N lub C. Wskazane może być przeprowadzenie testu funkcjonalnego lub zbadanie lokalizacji białka fuzyjnego za pomocą mikroskopii przed pełnym oczyszczaniem, aby upewnić się, że oznakowana pochodna jest funkcjonalna. Integralne białka błonowe lub jądrowe niekoniecznie muszą być uwalniane w stosunkowo łagodnych warunkach detergentu opisanych na etapie lizy. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów immunoprecypitacyjnych i podobnych testów typu pull-down, można wprowadzić modyfikacje charakteru i stężeń detergentu w buforze do lizy w celu zwiększenia wydajności lizy. Stężenie jonowe do lizy i płukania może być również modyfikowane w celu zwiększenia lub zmniejszenia rygorystyczności oczyszczania. Możliwe jest również przeprowadzenie wstępnego oczyszczania w standardowych łagodnych warunkach (opisanych powyżej), ale następnie podzielenie kulek streptawidyny (sekcja 5.8) na 4-5 podwielokrotności, które można następnie przepłukać w rosnących warunkach jonowych. Może to umożliwić użytkownikowi zidentyfikowanie optymalnych warunków, które usuwają niespecyficzne białka oddziałujące. Cały proces może być również przeprowadzony przy użyciu transfekcji przejściowej, w której partnerzy oddziałujący na siebie są znani, a ich obecność lub brak zależy tylko od kolejnego western blot. W tym przypadku zasugerowalibyśmy dwie 100 cm² szalki komórek, z których każda jest transfekowana 8 μg plazmidu ekspresyjnego. Ta zmodyfikowana procedura jest szczególnie przydatna podczas badania zdolności zmutowanych pochodnych białka fuzyjnego TAP do interakcji ze znanymi partnerami wiążącymi.

Analiza próbek od 1 do 8 na zabarwionych srebrem żelach SDS-PAGE (lub metodą western blot, jeśli dostępne jest przeciwciało) jest doskonałym sposobem rozwiązywania problemów, jeśli technika nie przyniesie akceptowalnych wyników. Wydajność każdego wytrącania opartego na powinowactwie i specyficznej elucji można analizować przy użyciu tego systematycznego podejścia do pobierania próbek. Próbki od jednej do ośmiu powinny być pobierane podczas optymalizacji protokołu dla każdej nowej przynęty.

Technika znakowania TAP stanowi potężną i solidną alternatywę dla innych podejść, takich jak ściąganie GST, testy hybrydowe drożdży itp. Oczyszczanie o podwójnym powinowactwie i specyficzne etapy elucji (rozszczepienie TEV i elucja biotyny) zapewniają specyficzność i rygorystyczność, które należy utrzymać na wysokim poziomie przez cały proces oczyszczania. Co najważniejsze, technika ta może być zastosowana do dowolnego białka i dlatego stanowi doskonałą metodę identyfikacji partnerów wiążących dla białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hygromycyna B	Grupa Roche	10843555001
Królik IgG Agaroza	Sigma-Aldrich	A2909
AC-TEV Proteaza	Invitrogen	12575-015
Koktajl inhibitorów proteazy	Calbiochem	539134
Ultralink Unieruchomione koraliki Streptawidin Plus	Pierce, Thermo Scientific	53116
Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 500 (5KDa)	Vivaspin	V50112
SilverQuest Zestaw do barwienia	Invitrogen	LC6070
Novex Colloidal Blue Coomassie	Invitrogen	LC6025
1,7 ml wstępnie nasmarowane probówki	Costar	3207
Końcówki do pipet mikrokapilarnych	VWR international	37001-150
NuPage 4-12% Bis-Tris Gradient Gels	Invitrogen	NP0322BOX
CdCl2	Sigma-Aldrich	202908
5x SDS Sample Buffer	Fisher Scientific	PN39000