Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Podsumowanie

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Streszczenie

Kluczowym i często ograniczającym etapem w zrozumieniu funkcji białek gospodarza i wirusa jest identyfikacja oddziałujących z nimi komórkowych lub wirusowych partnerów białkowych. Istnieje wiele podejść umożliwiających identyfikację partnerów oddziałujących, w tym system drożdżowych dwuhybryd oraz testy pull-down z użyciem białek rekombinowanych i immunoprecypitacja białek endogennych z następczą identyfikacją za pomocą spektrometrii mas¹. Niedawne badania podkreśliły użyteczność oczyszczania za pośrednictwem podwójnych znaczników powinowactwa, połączonego z dwoma specyficznymi etapami elucji, w identyfikacji oddziałujących białek. Podejście to, nazwane tandemową puryfikacją powinowactwa (TAP), było początkowo stosowane u drożdży^2,3, lecz w ostatnim czasie zostało zaadaptowane do zastosowań w komórkach ssaków^4-8.

W ramach dowodu koncepcji opracowaliśmy metodę tandemowego oczyszczania powinowactwem (TAP) z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanego eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF4E^9,10. Komórkowy czynnik translacji eIF4E jest kluczowym komponentem kompleksu eIF4F zaangażowanego w zależną od czapeczki inicjację translacji¹⁰. Zastosowany w niniejszym badaniu znacznik TAP składa się z dwóch jednostek Białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę, rozdzielonych sekwencją cięcia proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV). Zastosowany w niniejszym badaniu znacznik TAP składa się z dwóch jednostek Białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę, rozdzielonych sekwencją cięcia proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV)⁸. Aby uniknąć konieczności tworzenia klonalnych linii komórkowych, opracowaliśmy szybki system oparty na ekspresji białka przynęty z znacznikiem TAP z plazmidu utrzymywanego episomalnie na bazie pMEP4 (Invitrogen). Ekspresja znakowanego mysiego eIF4E z tego plazmidu była kontrolowana za pomocą indukowalnego chlorkiem kadmu promotora metalotioneiny.

Liza komórek ekspresyjnych, a następnie oczyszczanie powinowactwem poprzez wiązanie z agaroza z IgG królika, cięcie proteazą TEV, wiązanie z agarozą sprzężoną ze streptawidyną i następująca po tym elucja biotyną pozwoliły na zidentyfikowanie licznych białek, które wydawały się specyficzne dla pull-down eIF4E (w porównaniu do kontrolnych linii komórkowych ekspresujących sam znacznik TAP). Tożsamość białek ustalono poprzez wycięcie prążków z 1D SDS-PAGE i późniejszą tandemową spektrometrię mas. Zidentyfikowane komponenty obejmowały znane białka wiążące eIF4E: eIF4G oraz 4EBP-1. Ponadto zidentyfikowano inne komponenty kompleksu eIF4F, którego częścią jest eIF4E, a mianowicie eIF4A oraz białko wiążące Poly-A. Zdolność do identyfikacji nie tylko znanych bezpośrednich partnerów wiązania, ale także wtórnych białek oddziałujących, dodatkowo podkreśla użyteczność tego podejścia w charakteryzacji białek o nieznanej funkcji.

Protokół

1. Generowanie linii komórkowych: transfekcja / ekspresja pMEP4

1. Przeprowadź transfekcję komórek wektorem ekspresyjnym pMEP4 i dokonaj selekcji za pomocą 100 μg hygromycyny B /ml (Roche), aż do całkowitego usunięcia komórek kontrolnych (mock). Plazmid pMEP4 utrzymuje się episomalnie, więc nie ma potrzeby izolowania konkretnych klonów.
2. Ekspresję w komórkach zawierających wektor pMEP4 można indukować poprzez traktowanie 10 μM CdCl₂ przez 16 godzin. Ekspresję i indukowalność należy potwierdzić w małej skali przed amplifikacją linii komórkowych. Białko z tagiem TAP można łatwo wykryć, ponieważ domeny białka G wiążą się z przeciwciałami niemal wszystkich gatunków. Do puryfikacji na dużą skalę zazwyczaj wymagane jest 10 konfluentnych kolb o powierzchni 175 cm². Odpowiada to w przybliżeniu 2 X10⁸ komórek wykazujących ekspresję.

2. Przygotowanie lizatu komórkowego

1. Zeskrob komórki do PBS i połącz je w jednej probówce o pojemności 50 ml. Wirować przy 1200X g przez 5 minut (powinno to dać na początku 2-3 ml osadu komórkowego, który po przemyciu zredukuje się do około 1,5 ml).
2. Przemyć komórki trzykrotnie w schłodzonym do temperatury lodowej PBS (za każdym razem 50 ml).
3. Zlizować komórki w 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5 % Glycerol, 0,2 % NP-40, 1,5 mM MgCl₂, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄ oraz inhibitor proteaz). Uwaga: NaF, Na₃VO₄ oraz inhibitory proteaz należy dodać bezpośrednio przed użyciem. Pipetować 10 razy w górę i w dół, a następnie pozostawić na 5 minut w lodzie. Przeciągać przez strzykawkę z tępą igłą 5-10 razy, a następnie ponownie pozostawić na 5 minut w lodzie. Powtórzyć przeciąganie przez strzykawkę i pozostawić na kolejne 5 minut w lodzie.
4. Przeprowadzić dwukrotny cykl zamrażania i rozmrażania lizatu (ciekły N₂ / lub suchy lód i etanol). Nie dopuścić do ogrzania próbki powyżej 4°C. Uwaga: próbkę tę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu rozpoczęcia dalszej obróbki.
5. Rozdzielić próbkę do probówek 1,5 ml i usunąć niezlizowane komórki oraz debris poprzez wirowanie (10 minut w 4°C, 16,000X g).
6. Zebrać supernatant, połączyć go w probówce Falcon o pojemności 15 ml i (opcjonalnie) przefiltrować przez filtr 0,45 μm przed pobraniem próbki 20 μl do kwantyfikacji wydajności białka. Pobrać kolejną alikwot 50 μl do dalszej analizy (Próbka 1).

3. Wiązanie do agarozy z królika IgG

(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce z chłodnicą w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Delikatnie resuspender roztwór IgG-agarosy króliczej (Sigma-Aldrich), obracając butelkę. Pobrać 380 μl IgG-agarosy (używając przyciętego końcówki do pipety 1 ml) i usunąć roztwór transportowy/konserwujący poprzez odwirowanie przez 1 minutę. Przemyć agarozę trzykrotnie w schłodzonym buforze lizującym (4°C), wykorzystując wirowanie w celu oczyszczenia. Końcowa ilość agarozy powinna wynosić około 250 μl spakowanych kulek.
2. Dodać oczyszczony lizat komórkowy z punktu 2.6 (w probówce typu falcon 15 ml) do przemytej agarosy IgG króliczej i inkubować przez 3 godziny (lub przez noc) w temperaturze 4°C przy użyciu mieszadła obrotowego.
3. Odwirować kulki agarozowe przez 5 minut w temperaturze 4°C i zebrać nadsącz do późniejszej analizy (Próbka 2). Uwaga: Białko z tagiem TAP powinno być teraz związane z kulkami.

4. Cięcie proteazą TEV

(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4oC przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Trzykrotnie przemyj koraliki agarozowe z królika IgG w schłodzonym buforze lizującym (4°C), stosując wirowanie w celu sklarowania (uwaga: bufor lizujący nie powinien zawierać inhibitorów proteaz). Należy zachować ostrożność, aby nie usunąć ani nie zgubić koralików podczas etapów płukania.
2. Koraliki przemyj dodatkowo dwukrotnie buforem do trawienia proteazą TEV (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl oraz 0.2 % NP-40), stosując wirowanie w celu sklarowania. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały płyn z koralików.
3. Przygotuj mieszaninę do trawienia proteazą TEV; dla każdej próbki dodaj 467.5 μl H₂O, 25 μl 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT oraz 2.5 μl (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Dodaj 500 μl tej mieszaniny do każdej próbki upakowanych koralików i przenieś całą zawiesinę do probówki 1.7 ml z warstwą poślizgową (Costar). Przed inkubacją pobierz aلیکwot 30 μl do późniejszej analizy (Próbka 3).
4. Inkubuj reakcję z proteazą TEV przez noc w temperaturze 4°C, korzystając z miksera obrotowego. Należy pamiętać, że w zależności od natury białka przynęty i dostępności miejsca cięcia proteazy TEV można zastosować krótszy czas inkubacji, jednak minimalny czas inkubacji powinien zostać wyznaczony empirycznie.

5. Wiązanie do kulek Ultralink Immobilized Streptavidin Plus

(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że wskazano inaczej)

1. Odwiruj mieszaninę reakcji cięcia TEV zawierającą paciorki agarozowe z przeciwciałem rabbit IgG przez 5 minut przy 1200X g (4°C). Pobierz 20 μl alikwotu oczyszczonego supernatantu do analizy (Próbka 4)
2. Przenieś pozostały supernatant (około 480 μl) do nowej, nasmarowanej probówki 1,5 ml (Costar) i pozostaw na lodzie. Nie wylewaj tego supernatantu – zawiera on białko przynęty cięte przez TEV oraz wszelkie powiązane białka wiążące.
3. Dodaj 500 μl schłodzonego buforu do lizy (Sekcja 2.3) do pozostałych paciorków agarozowych z rabbit IgG i resuspenduj. Odwiruj tę mieszaninę, aby oczyścić paciorki, a następnie usuń supernatant i połącz go z supernatantem z kroku 5.2. Pozostaw tę probówkę na lodzie (powinna teraz zawierać ~980 μl próbki).
4. Zachowaj paciorki agarozowe z rabbit IgG do późniejszej analizy (Próbka 5). Uwaga: jeśli ta próbka zostanie poddana elektroforezie SDS-PAGE (lub western blotowi), pojawi się dużo tła ze względu na obecność ciężkich i lekkich łańcuchów IgG.
5. W międzyczasie delikatnie zresuspenduj paciorki agarozowe Ultralink Immobilized Streptavidin Plus (Pierce), obracając butelką. Używając końcówki do pipety 200 μl z odciętym końcem, odmierz 70 μl paciorków streptawidynowych na próbkę do nasmarowanych probówek 1,5 ml i usuń roztwór transportowy/konserwujący poprzez wirowanie. Uwaga: paciorki te są bardzo małe, dlatego można użyć końcówek „dziubastych” lub płaskich/wąskich, aby zminimalizować stratę paciorków podczas płukania.
6. Trzykrotnie przemyj paciorki streptawidynowe schłodzonym buforem do lizy (4°C), stosując wirowanie w celu oczyszczenia. W każdej probówce powinno pozostać około 45-50 μl upakowanych paciorków.
7. Przenieś supernatant po cięciu proteazą TEV (tj. 980 μl próbki z kroku 5.3) do probówki zawierającej przemyte paciorki streptawidynowe i inkubuj przez 3 godziny (lub przez noc) w 4°C, używając mieszadła obrotowego.
8. Odwiruj paciorki streptawidynowe przez 5 minut w 4°C i usuń supernatant do późniejszej analizy (Próbka 6). Trzykrotnie przemyj paciorki streptawidynowe schłodzonym buforem do lizy (4°C), stosując wirowanie w celu oczyszczenia. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały pozostały bufor do płukania.

6. Elucja biotynowa peptydu wiążącego streptawidynę i białka przynęty

(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)

1. Eluuj białka z znacznikiem z kulek streptawidynowych, dodając 500 μl PBS:Biotyny (1 mM D-biotyny) i inkubując w 4°C przez 3 godziny (lub przez noc) przy użyciu miksera rotacyjnego.
2. Odwiruj kulki streptawidynowe przez 5 minut w 4°C i przenieś supernatant do wcześniej nasmarowanej probówki 1,5 ml (Uwaga: jest to końcowa próbka/elucja (Próbka 7)).
3. Dodaj kolejne 500 μl Biotyny:PBS do pozostałych kulek streptawidynowych i inkubuj w 4°C przez 2-3 godziny (lub przez noc) przy użyciu miksera rotacyjnego.
4. Powtórz krok 6.2 i połącz obie elucje (Próbka 7). Tę końcową elucję można przechowywać w -80°C.
5. Aby ocenić wydajność elucji biotyną, zamroź pozostałe kulki streptawidynowe, a następnie zagotuj je w buforze do próbek SDS (Próbka 8) (rekomendacja: LaneMarker 5x reducing sample buffer od Fisher).

7. Stężenie białka

1. Końcowy eluat (Próbka 7) musi zostać skoncentrowany przed analizą ze względu na niskie stężenie białek i stosunkowo dużą objętość. Można to osiągnąć, używając kolumn wirówkowych Vivaspin o niskiej masie cząsteczkowej (<5 KDa) (Vivascience). Należy dążyć do skoncentrowania objętości do mniej niż 100 μl. Taka końcowa próbka może zostać podgrzana do wrzenia i przechowywana w buforze do próbek białkowych (zaleca się: LaneMarker 5x reducing sample buffer od Fisher).

8. Analiza

1. Próbki 1-8 można analizować metodą western blot w celu określenia wydajności procesu pull down. Uwaga: Większość przeciwciał wtórnych wykazuje reaktywność krzyżową z domenami białka G białka fuzyjnego, jednak zostają one usunięte po trawieniu proteazą TEV.
2. Próbkę 7 można analizować za pomocą 1D lub 2D SDS-PAGE. Barwienie można przeprowadzić metodą srebrową lub Coomassie (zalecane zestawy: SilverQuest Silver staining oraz Colloidal Blue Coomassie staining od firmy Invitrogen). Identyfikację białek można przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas.

9. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy 1D SDS-PAGE końcowego eluatu (Próbka 7) z niniejszego protokołu w celu identyfikacji partnerów wiążących eIF4E znakowany TAP przedstawiono na Ryc. 2. Ten reprezentatywny żel odzwierciedla złożony i liczny charakter oddziaływań eIF4E z innymi białkami w komórce. Porównanie z kontrolą negatywną, również pokazaną na Ryc. 2, wygenerowaną z linii komórkowej wykazującej jedynie znacznik TAP, ilustruje specyficzność tego procesu pull-down z użyciem przynęty eIF4E. W tym przypadku 15% skoncentrowanego końcowego eluatu (Próbka 7) poddano analizie 1D SDS-PAGE przy użyciu dostępnych komercyjnie gotowych żeli gradientowych, a następnie barwiono zestawem do barwienia srebrem Silverquest firmy Invitrogen.

Zazwyczaj od 50 do 85% pozostałego stężonego eluatu końcowego (Próbka 7) analizuje się za pomocą barwienia Colloidal Coomassie (Invitrogen). Próbki (wycinki żelu/prążki) z całej ścieżki zostały następnie wyekstrahowane i poddane analizie metodą spektrometrii mas.

Białka zidentyfikowane w wyniku immunoprecypitacji eIF4E przefiltrowano poprzez odrzucenie partnerów wiążących występujących w kontroli negatywnej, aby wyeliminować niespecyficzne oddziaływania. Końcowy zestaw białek zidentyfikowanych za pomocą tej metody znacznikowania TAP białka eIF4E przedstawiono na Rysunku 2, który jest reprezentatywny dla białek wykrytych tą techniką. Dodatkowo zidentyfikowano również szereg podjednostek eIF3 (dane nie zostały przedstawione).

Rysunek 1. Schemat procedury tandemowego oczyszczania powinowactwem. Sześciostopniowy protokół tandemowego oczyszczania powinowactwem (TAP) obejmuje generowanie linii komórkowej, lizę komórek, immunoprecypitację przy użyciu agarozy z IgG królika, cięcie proteazą TEV, oczyszczanie powinowactwem przy użyciu kulek ze streptawidyną i na koniec elucję biotyny.

Rysunek 2. Tandemowa puryfikacja powinowactwa białka eIF4E myszy. Partnerzy oddziałujący z eIF4E z tagiem TAP na końcu N-końcowym zostali oczyszczeni z eukariotycznych komórek HEK293 zgodnie z załączonym protokołem. Frakcję 20% końcowego eluatu (Próbka 7) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE na gotowym żelu gradientowym 4-12% (ścieżka TAP-eIF4E). Analogiczna analiza została przeprowadzona dla samego tagu (ścieżka TAP). Białka zidentyfikowano za pomocą barwienia srebrem. Białka zidentyfikowane następnie metodą spektrometrii mas z tej samej próbki zostały wyróżnione na tym żelu.
Skróty: eIF4G; eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 gamma, PABP; białko wiążące poliA, eIF4A: eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 alfa, SBP-eIF4e; pozostałe białko przynęty TAP zawierające peptyd wiążący streptawidynę połączony z eukariotycznym czynnikiem inicjacji translacji 4E, 4EBPs; eukariotyczne białka wiążące czynnik inicjacji translacji 4E, eIF4eNiF1l eukariotyczny czynnik importu jądrowego czynnika inicjacji translacji 4E 1, SBP; pozostały peptyd wiążący streptawidynę z peptydu TAP po odcięciu przez TEV.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj technika znakowania TAP demonstruje wysoce specyficzną i rygorystyczną metodę izolacji partnerów wiążących białka przynęty w komórkach eukariotycznych. Podejście to można zastosować zarówno do białek komórkowych, jak i wirusowych. Z naszej wiedzy wynika, że jest to pierwszy przypadek zastosowania takiej techniki w odniesieniu do czynnika inicjacji translacji eIF4E. Identyfikacja znanych białek wiążących eIF4E, takich jak eIF4G i 4EBPs, przy użyciu tej techniki potwierdza zasadność takiego podejścia. Dodatkowo, identyfikacja pozostałego składnika kompleksu eIF4F, a mianowicie eIF4A, oraz PABP potwierdza, że oddziaływania pośrednie i kompleksy trzeciorzędowe pozostają nienaruszone podczas procesu oczyszczania. Wyraźna była również identyfikacja wielu izoform kanonicznych białek wiążących eIF4e. Są one opisane bardziej szczegółowo na Rysunku 2.

W odniesieniu do ograniczeń tej metody, należy zachować ostrożność przy wyborze białka przynęty oraz decyzji o umieszczeniu znacznika TAG na terminusie N- lub C-. Przed pełnoskalową puryfikacją zaleca się przeprowadzenie testu funkcjonalnego lub zbadanie lokalizacji białka fuzyjnego za pomocą mikroskopii, aby upewnić się, że pochodna z znacznikiem jest funkcjonalna. Białka błonowe lub jądrowe mogą nie zostać uwolnione w stosunkowo łagodnych warunkach detergentowych opisanych w etapie lizy. Podobnie jak w przypadku wszystkich immunoprecypitacji i podobnych testów pull-down, można modyfikować rodzaj i stężenie detergentu w buforze do lizy w celu zwiększenia wydajności lizy. Można również zmodyfikować stężenie jonowe buforów do lizy i płukania, aby zwiększyć lub zmniejszyć rygorystyczność puryfikacji. Istnieje również możliwość przeprowadzenia wstępnej puryfikacji w standardowych, łagodnych warunkach (opisanych powyżej), a następnie podzielenia kulek z streptawidyną (sekcja 5.8) na 4-5 aliquotów, które mogą być następnie płukane w coraz silniejszych warunkach jonowych. Może to pozwolić użytkownikowi na zidentyfikowanie optymalnych warunków usuwających niespecyficznie oddziałujące białka. Cały proces można również przeprowadzić z wykorzystaniem transfekcji przejściowej, gdy partnerzy oddziałujące są znani, a ich obecność lub brak jest określana wyłącznie za pomocą późniejszego western blotu. W takim przypadku sugerujemy użycie dwóch szalek z komórkami o powierzchni 100cm², z których każda zostanie transfektowana 8 μg plazmidu ekspresyjnego. Ta zmodyfikowana procedura jest szczególnie użyteczna przy badaniu zdolności pochodnych mutantów białka fuzyjnego TAP do oddziaływania ze znanymi partnerami wiążącymi.

Analiza próbek od 1 do 8 na żelach SDS-PAGE barwionych srebrem (lub metodą western blot, jeśli dostępny jest odpowiedni przeciwciało) stanowi doskonały sposób na rozwiązywanie problemów w przypadku, gdy technika ta nie przynosi zadowalających wyników. Wykorzystując to systematyczne podejście do pobierania próbek, można przeanalizować wydajność każdej precypitacji opartej na powinowactwie oraz specyficznej elucji. Próbki od pierwszej do ósmej należy pobierać podczas optymalizacji protokołu dla każdej nowej przynęty.

Technika znakowania TAP stanowi potężną i niezawodną alternatywę dla innych podejść, takich jak metody pull-down z użyciem GST, testy drożdżowego systemu dwuhybrydowego itp. Etapy podwójnego oczyszczania powinowactwa oraz specyficznej elucji (cięcie TEV i elucja biotynowa) zapewniają wysoką specyficzność i rygorystyczność, które są utrzymywane przez cały proces oczyszczania. Co kluczowe, technikę tę można zastosować do dowolnego białka, co czyni ją doskonałą metodą identyfikacji partnerów wiążących dla interesującego badacza białka docelowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hygromycyna B	Roche Group	10843555001
Agaroza z IgG królika	Sigma-Aldrich	A2909
Proteaza AC-TEV	Invitrogen	12575-015
Koktajl inhibitorów proteaz	Calbiochem	539134
Kulkowe nośniki Ultralink Immobilized Streptavidin Plus	Pierce, Thermo Scientific	53116
Koncentrator wirówkowy Vivaspin 500 (5KDa)	Vivaspin	V50112
Zestaw do barwienia srebrem SilverQuest	Invitrogen	LC6070
Zestaw do barwienia Coomassie Novex Colloidal Blue	Invitrogen	LC6025
Probówki smarowane 1,7 ml	Costar	3207
Końcówki do pipet mikrokapilarnych	VWR international	37001-150
Gradientowe żele NuPage 4-12% Bis-Tris	Invitrogen	NP0322BOX
CdCl2	Sigma-Aldrich	202908
5x bufor do próbek SDS	Fisher Scientific	PN39000