Artykuł metodologiczny

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

22K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3644

⸱

3 lutego 2012

 ,  , 
1Pharmazentrum Frankfurt / ZAFES, Goethe University Hospital Frankfurt

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie myszy adenowirusem wykazującym ekspresję głównego ludzkiego autoantygenu cytochromu P450 2D6 (hCYP2D6), rozpoznawanego przez surowice pacjentów cierpiących na autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu 2, prowadzi do utrwalonej formy autoimmunologicznej choroby wątroby charakteryzującej się rozległym zapaleniem wątroby, włóknieniem oraz generowaniem swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko CYP2D6.

Streszczenie

Autoimmunologiczne zapalenie wątroby jest rzadką, lecz zagrażającą życiu autoimmunologiczną chorobą wątroby o nieznanej etiologii1,2. W przeszłości podejmowano wiele prób stworzenia modelu zwierzęcego odzwierciedlającego charakterystykę choroby ludzkiej 3-5. Jednak w różnych modelach indukcja choroby była dość złożona, a zapalenie wątroby często miało charakter przejściowy3-5. Opracowaliśmy zatem prosty model mysi, w którym jako czynnik wyzwalający wykorzystuje się główny ludzki autoantygen występujący w typie 2 autoimmunologicznego zapalenia wątroby (AIH-2), mianowicie hCYP2D66. Przeciwciała typu 1 przeciwko mikroksom wątrobowo-nerkowym (LKM-1) rozpoznające hCYP2D6 są znakiem rozpoznawczym AIH-27,8. Dostarczenie hCYP2D6 do myszy szczepów FVB lub C57BL/6 typu dzikiego odbywało się za pomocą konstruktu adenowirusowego (Ad-2D6), który zapewnia bezpośrednie dostarczenie wyzwalającego antygenu do wątroby. W ten sposób następujący po tym miejscowy stan zapalny tworzy podatne podłoże9 dla późniejszego rozwoju autoimmunizacji. Kombinacja wtryskiwania Ad-2D6 dożylnie i doszczelnie jest najskuteczniejszą drogą indukcji długotrwałych autoimmunologicznych uszkodzeń wątroby (sekcja 1). Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół indukcji autoimmunologicznej choroby wątroby w modelu CYP2D6 oraz sposoby oceny różnych aspektów uszkodzenia wątroby. Po pierwsze, stężenia w surowicy markerów wskazujących na destrukcję hepatocytów, takich jak aminotransferazy, a także miana przeciwciał przeciwko hCYP2D6 są określane poprzez pobieranie krwi z splotu żylnego oczodołowego (sekcja 2). Po drugie, odpowiedź limfocytów T swoistą dla hCYP2D6 jest charakteryzowana poprzez izolację limfocytów ze śledziony i wątroby. Aby uzyskać czyste limfocyty wątrobowe, wątroby są perfundowane PBS przez żyłę wrotną (sekcja 3), trawione kolagenazą i oczyszczane w gradiencie Percoll (sekcja 4). Częstotliwość występowania limfocytów T swoistych dla hCYP2D6 jest analizowana poprzez stymulację peptydami hCYP2D6 i identyfikację komórek produkujących IFNγ za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 5). Po trzecie, naciek komórkowy i włóknienie są określane za pomocą immunohistochemii przekrojów wątroby (sekcja 6). Taki schemat analizy musi być przeprowadzany w kilku punktach czasowych po zainicjowaniu choroby, aby udowodnić chroniczny charakter modelu. Wielkość odpowiedzi immunologicznej, charakteryzowana przez częstotliwość i aktywność swoistych dla hCYP2D6 limfocytów T i/lub B, oraz stopień uszkodzenia wątroby i włóknienia muszą zostać ocenione w celu późniejszej ewaluacji możliwych terapii zapobiegających, opóźniających lub znoszących autodestrukcyjny proces w wątrobie.

Protokół

1. Dożylna iniekcja Ad-2D6 do zatoki ocznej

  1. W warunkach sterylnych rozcieńczyć roztwór zapasowy wirusa Ad-2D6 do stężenia 5 x 109 pfu/ml w medium RPMI i przechowywać roztwór wirusa Ad-2D6 w lodzie. Wykazano, że wstrzyknięcie dwóch dawek po 5 x 108 pfu (dożylnie i dosytnnowo) pozwala na uzyskanie najbardziej wiarygodnego modelu autoimmunizacyjnego zapalenia wątroby u myszy szczepu FVB.
  2. Zanestezjować mysz przy użyciu 4% izofluranu w komorze anestezjologicznej. Ucisnąć tylną łapę, aby upewnić się, że zwierzę jest pod wpływem znieczulenia.
  3. Utrzymać mysz za kark i naciągnąć luźną skórę głowy kciukiem i środkowym palcem. W ten sposób oko zostanie lekko wysunięte wskutek pociągnięcia skóry sąsiadującej z okiem.
  4. Wprowadzić igłę pionowo w kącik przynosowy oka (miejsce połączenia powiek najbliższe nosowi zwierzęcia) i powoli wstrzyknąć 100 μl roztworu wirusa Ad-2D6. Ważne jest, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, aby uniknąć uszkodzenia naczyń i tchawicy.
  5. Powoli wycofać igłę, aby uniknąć wycieku, a następnie zamknąć powieki.
  6. Wstrzyknięcie przebiegło pomyślnie, jeśli roztwór wirusa nie wycieka przez nos, a oko wraca do pierwotnej pozycji.
  7. Niezwłocznie po wstrzyknięciu dożylnym wykonać standardowy zastrzyk dosytnnowy drugiej dawki 100 μl roztworu wirusa Ad-2D6.

Alternatywnie, wstrzyknięcie dożylne można wykonać poprzez żyłę ogonową. Jednakże wstrzyknięcie przez zatokę oczną jest znacznie łatwiejsze do przeprowadzenia i minimalizuje utratę roztworu wirusa. Wykazano, że te dwie techniki można stosować zamiennie i że obie drogi podania są równie skuteczne 10.

Zainfekowane myszy są monitorowane pod kątem działań niepożądanych oraz oczywistych oznak cierpienia i bólu, takich jak utrata apetytu, utrata masy ciała, utrata mobilności, brak pielęgnacji, zmatowiała sierść, zgarbiona postawa, a także lizanie, gryzienie, drapanie lub potrząsanie konkretnym obszarem (np. miejscem wstrzyknięcia). Chociaż w modelu CYP2D6 u myszy występuje rozległe uszkodzenie wątroby, zwierzęta te wydają się zdrowe i nie wykazują oznak cierpienia, bólu ani stresu. Niemniej jednak wskaźniki ciężkiej niewydolności wątroby, takie jak aminotransferazy surowicze, są oznaczane regularnie lub stanowią część przeprowadzanych eksperymentów. Poziomy aminotransferaz surowiczych >1000 U/l powinny pojawiać się wyłącznie jako bezpośredni skutek infekcji wirusowej, a nie w sposób chroniczny. Jeśli poziomy aminotransferaz surowiczych chronicznie przekraczają 1000 U/l (granica ciężkości stanu), myszy są uśpione.

2. Pobieranie krwi z oka myszy

  1. Zanestezować mysz 4% isofluranem w komorze anestezji. Uszczypnąć tylną kończynę, aby upewnić się, że zwierzę jest pod wpływem znieczulenia.
  2. Przytrzymać mysz za kark i ściągnąć luźną skórę głowy kciukiem oraz środkowym palcem. W ten sposób oko lekko wysuwa się na zewnątrz wskutek trakcji skóry przylegającej do oka.
  3. Umieścić końcówkę rurki kapilarnej w dolnym lub wewnętrznym kąciku oka i delikatnie, lecz stanowczo przesunąć ją wzdłuż gałki ocznej do zatoki żylnej oka. Kapilary żylne pękają, a powstały krwotok wypełnia jamę oczodołową.
  4. Lekko wycofać rurkę kapilarną, aby uwolnić końcówkę, tak aby zgromadzona krew została wciągnięta do rurki.
  5. Po zebraniu odpowiedniej ilości krwi rurkę wyjmuje się, a powieki zamyka. Krwawienie ustaje po wycofaniu rurki i przywróceniu prawidłowego ciśnienia wewnątrzgałkowego w obrębie kompleksu żylnego.
  6. Krew z rurki kapilarnej przenosi się do probówki Microtainer i inkubuje przez 30 min na lodzie.
  7. Probówkę Microtainer wiruje się przy 7500 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C.
  8. Nadosad stanowi surowicę, którą przenosi się do nowej probówki i przechowuje w temperaturze -80 °C.
  9. Surowicę można wykorzystać do oznaczenia miana przeciwciał metodą ELISA. Wskaźniki uszkodzenia wątroby, takie jak stężenia w surowicy enzymów wątrobowych: aminotransferazy alaninowej (ALT/GPT) i aminotransferazy asparaginianowej (AST/GOT), można ocenić przy użyciu odpowiednich pasków testowych firmy Roche Diagnostics (Mannheim, Niemcy) oraz analizatora Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy).

Alternatywnie pobieranie krwi można przeprowadzić z żyły ogonowej lub z powierzchownej żyły skroniowej11.

3. Perfuzja wątroby myszy

Uwaga: Ten krok jest istotny, aby uniknąć zanieczyszczenia wyizolowanych limfocytów wątrobowych limfocytami krwi

  1. Uśmierć mysz przy użyciu letalnych dawek CO2, a następnie przeprowadź zwichnięcie stawuż łopatkowego.
  2. Umieść zwierzę na plecach na styropianowej płytce. Użyj igieł 23 G do unieruchomienia kończyn.
  3. Nawilż i zdezynfekuj mysz za pomocą 70 % EtOH.
  4. Około 1 cm od tylnych łap wykonaj nacięcie skóry i warstwy mięśniowej. Wykonaj cięcia po obu stronach ciała zwierzęcia, kierując się w stronę przepony.
  5. Po dotarciu do przepony skórę można odchylić do tyłu.
  6. Oddziel przeponę od żeber, a następnie przetnij żyłę główną.
  7. Przesuń żołądek i jelita na bok, aby odsłonić żyłę wrotną.
  8. W żyłę wrotną wprowadź igłę 27 G połączoną z strzykawką 5 ml wypełnioną zimnym PBS. Pozostaw PBS, aby powoli wypłukał krew z wątroby.
  9. Wypreparuj wątrobę, chwytając za przeponę i oddzielając ją od ciała.
  10. Przenieś wątrobę do szalki Petriego i usuń przeponę, pęcherzyk żółciowy oraz wszelkie inne tkanki wciąż połączone z wątrobą.
  11. Przenieś wątrobę do 10 ml PBS w probówce 50 ml na lodzie lub zamknij w związku OCT.

4. Izolacja limfocytów wątrobowych

  1. Przygotować następujące roztwory zapasowe:
    • Zapas kolagenazy IV (100 mg/ml) w PBS. (Przygotować małe aliquoty i przechowywać w -20 °C).
    • Zapas DNazy (25 mg/ml) w PBS. (Przygotować małe aliquoty i przechowywać w -20 °C).
    • Bufor kolagenazowy: PBS zawierający 0,2 mg/ml kolagenazy IV, 0,02 mg/ml DNazy oraz 5% FCS; dla jednej wątroby zmieszać 9,5 ml schłodzonego na lodzie PBS, 20 μl kolagenazy IV (zapas 100 mg/ml), 8 μl DNazy (zapas 25 mg/ml) i 500 μl inaktywowanej termicznie FCS.
    • 35 % Percoll; zmieszać 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS zapas; 305 ml PBS.
    • RPMIcomplete = RPMI zawierający 10% inaktywowanej termicznie FCS, 100 μ/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy.
  2. Przenieść przepłukaną wątrobę (patrz sekcja 3) do 10 ml świeżego PBS w szalce Petriego na lodzie i pociąć na małe kawałki za pomocą nożyczek.
  3. Przenieść do sita komórkowego o oczkach 70 μm i przecisnąć fragmenty wątroby za pomocą szklanego tłuczka lub tłoczka z 2 ml strzykawki. Ostrożnie dodać 10 ml zimnego buforu kolagenazowego i przecisnąć przez sito. Zebrać zawiesinę i przefiltrować przez sito jeszcze dwa razy.
  4. Przenieść zawiesinę do świeżej probówki 50 ml na lód. Przetworzyć kolejną wątrobę.
  5. Inkubować zawiesinę komórek wątroby w 37 °C przez 60 min, delikatnie mieszając co 15 min.
  6. Wirować przy 30 x g przez 3 min w 4 °C.
  7. Przenieść nadsącz do nowej probówki, pozostawiając 5 mm cieczy nad pelletem.
  8. Wirować przy 650 x g przez 10 min w 4 °C.
  9. Odlać nadsącz, pozostawiając 3 mm nad pelletem.
  10. Resuspender pellet w 20 ml buforu Percoll.
  11. Wirować przy 600 x g przez 20 min w 4 °C.
  12. Odlać nadsącz i resuspender pellet poprzez energiczne potrząsanie probówką.
  13. Przemyć pellet 1 x w PBS.
  14. Przemyć pellet 1 x w RPMIcomplete.
  15. Resuspender pellet w 3 ml RPMIcomplete i policzyć komórki w rozcieńczeniu 1:10.
  16. Resuspender komórki do stężenia ~107 komórek/ml w RPMIcomplete i przenieść probówkę na lód.

5. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICCS)

5.1 Stymulacja:

  1. Przygotować limfocyty wątrobowe w stężeniu ~107 komórek/ml w RPMIcomplete zgodnie z opisem. Wysiać 100 μl (106 komórek)/do studzienki na płaską płytkę 96-dołkową, która nie jest przeznaczona do hodowli tkanek.
  2. Dodać 50μl RPMIcomplete zawierającego 2μg/ml Brefeldyny A, a następnie dodać 50μl RPMIcomplete zawierającego 2 μg/ml stymulującego peptydu CYP2D6 (tj. immunodominującego epitopu CD4 CYP2D641-60 PGLGNLLHVDFQNTPYCFDQ12 lub immunodominującego epitopu CD8 CYP2D6193-212 RRFEYDDPRFLRLLDLAQEG12). Wymieszać poprzez pipetowanie.
  3. Inkubować przez 5 h w 37°C (optymalny czas stymulacji, jednak inkubacja przez noc również jest skuteczna).

5.2. Barwienie:

  1. Przygotować następujące roztwory zapasowe:
    • bufor FACS: PBS zawierający 1% płodowej surowicy bydlęcej (FCS).
    • bufor do fiksacji i permeabilizacji: bufor FACS zawierający 0,1% saponiny i 4% paraformaldehydu
    • bufor do płukania FACS/saponina: bufor FACS zawierający 0,1% saponiny
    • bufor FACS/PFA: bufor FACS zawierający 1% paraformaldehydu (PFA)
  2. Przenieść komórki do płytki mikrotitracyjnej z dnem w kształcie litery V (96-dołkowej) i wirować przy 460 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C. Odlać medium i wymieszać płytkę w wortexie.
  3. Dodać 150 μl buforu FACS i odwirować przy 460 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C. Odlać medium i wymieszać płytkę w wortexie. Powtórzyć etap płukania.
  4. W razie potrzeby zablokować powierzchniowe receptory FcR (przy użyciu przeciwciał wtórnych) za pomocą koktajlu αCD16/32 (blokada FcR) w stężeniu 1 μg/ml w buforze FACS przez 15 min w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć 2 x za pomocą 150 μl buforu do barwienia (460 x g przez 2 min w 4 °C).
  5. Przeprowadzić barwienie cząsteczek powierzchniowych: np. przeciwciało monoklonalne (mAb) Anti-CD8a-FITC 10 μg/ml w 50 μl buforu FACS przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Dodać 100 μl buforu FACS i wirować przy 460 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyć komórki 2 x za pomocą 150 μl buforu FACS (460 x g; 3 min; 4 °C). Wymieszać płytkę w wortexie.
  8. Utrwalić i permeabilizować komórki za pomocą 100 μl buforu do fiksacji i permeabilizacji przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Wirować przy 460 x g przez 7 min w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że ważne jest wydłużenie czasu wirowania do 7 min, ponieważ etapy fiksacji i permeabilizacji zmieniają ogólną gęstość komórek. Wymieszać płytkę w wortexie.
  10. Przemyć 2 x za pomocą 150 μl buforu do płukania FACS/saponina (460 x g; 7 min; 4 °C). Wymieszać płytkę w wortexie.
  11. Przeprowadzić barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych: np. przeciwciało monoklonalne (mAb) Anti-IFNγ-PE 10 μg/ml w 50 μl buforu do płukania FACS/saponina przez 30 min w temperaturze 4 °C.
  12. Dodać 100 μl buforu do płukania FACS/saponina i wirować przy 460 x g przez 7 min w temperaturze 4 °C.
  13. Przemyć komórki 2 x za pomocą 150 μl buforu do płukania FACS/saponina (460 x g; 7 min; 4 °C). Wymieszać płytkę w wortexie.
  14. Przemyć komórki 1 x buforem FACS (460 x g; 7 min; 4 °C). Wymieszać płytkę w wortexie.
  15. Resuspendować komórki w 200 μl buforu FACS/PFA, przenieść do probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu przeprowadzenia analizy cytometrycznej. Zazwyczaj używamy aparatów FACSCanto II lub FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy).

6. Immunohistochemia

6.1. Barwienie H&E w celu oceny ogólnej patologii wątroby:

  1. Pobrać wątrobę, zanurzyć w Tissue-Tek O.C.T. w jednorazowej formie podstawowej i szybko zamrozić na suchym lodzie.
  2. Przygotować skrawki tkanki wątroby o grubości 7 μm przy użyciu kriostatu Leica ustawionego na -17 °C i nanieść skrawki na szkiełka przedmiotowe Superfrost Plus. Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.
  3. Utrwalić krioskrawki w schłodzonym EtOH przez 15 min w temperaturze -20 °C. Pozostawić do wyschnięcia na 10 min.
  4. Przemyć 2 x wodą destylowaną przez 2 min w temperaturze pokojowej (następne kroki, 6.1.5 - 6.1.13, wykonuje się w temperaturze pokojowej).
  5. Barwić w roztworze hematoksyliny Meyera przez 8 min.
  6. Przemyć w ciepłej (30 °C) wodzie z kranu przez 10 min. Wodę wymieniać kilkakrotnie.
  7. Opłukać wodą destylowaną.
  8. Opłukać w 95% EtOH przez 20 sec.
  9. Wybarwić kontrastowo w roztworze eosyny G/Y przez 40 sec.
  10. Odwodnić 2 x w 95% EtOH przez 5 min na każdą inkubację.
  11. Odwodnić 2 x w 100% EtOH przez 5 min na każdą inkubację.
  12. Przejaśnić w ksylenie 2 x przez 5 min na każde przejaśnianie.
  13. Zamontować w Roti-Histokitt.

6.2. Immunohistochemia w celu oceny odkładania kolagenu I:

  1. Pobrać wątrobę, zanurzyć w Tissue-Tek OCT w jednorazowej formie podstawowej i szybko zamrozić na suchem lodzie.
  2. Przyciąć przekroje tkanki wątroby o grubości 7 μm za pomocą kriostatu Leica ustawionego na -17 °C i przymocować przekroje tkankowe do szkiełek mikroskopowych Superfrost Plus. Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  3. Utrwalić krioprzekroje w zimnym EtOH przez 15 min w temperaturze -20 °C. Pozostawić do wyschnięcia przez 10 min.
  4. Przemyć 2 x w PBS przez 2 min w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować w PBS zawierającym 0.3% H2O2 i 0.1% Na-azide przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć 2 x w PBS przez 2 min w temperaturze pokojowej.
  7. Zablokować przy użyciu zestawu blokującego awidyna-biotyna zgodnie z wytycznymi producenta.
  8. Zablokować 10 % FCS w PBS (FCS/PBS) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  9. Przeciwciało pierwszorzędowe to królicze przeciwciało anty-mysi kolagen I rozcieńczone 1:200 w 10 % FCS/PBS. Inkubować przekroje z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 2 h w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć przekroje 3 x w PBS przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  11. Rozcieńczyć biotynlowane przeciwciało anty-królicze do stężenia 1:500 i inkubować z przekrojami przez 1,5 h w temperaturze pokojowej.
  12. Przemyć przekroje 3 x w PBS przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  13. Reakcję barwną przeprowadzić poprzez sekwencyjną inkubację z koniugatem awidyna-peroksydaza oraz diaminobenzydyną i nadtlenkiem wodoru zgodnie z wytycznymi producenta.
  14. Barwić przeciwbarwnikiem w roztworze hematoksyliny Meyera przez 5 min, przemyć 2 x w PBS przez 2 min w temperaturze pokojowej i zamontować w Aquatex.

7. Reprezentatywne wyniki

Zakażenie myszy wirusem Ad-2D6 indukuje dwa odrębne etapy uszkodzenia wątroby. W pierwszych dniach po zakażeniu infekcja wirusowa wątroby powoduje gwałtowny wzrost poziomu aminotransferaz w surowicy, co jest wskaźnikiem śmierci hepatocytów6. Ten pierwszy, ostry etap występuje niezależnie od ekspresji hCYP2D6 i można go zaobserwować również po zakażeniu pustym wirusem kontrolnym (Ad-Control) lub wirusem wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (Ad-GFP). Z kolei drugi etap jest zapośredniczony przez mechanizmy autoimmunologiczne i zależy od ekspresji cząsteczki wyzwalającej hCYP2D6. Ten etap autoimmunologiczny pojawia się w ciągu 2–4 tygodni po zakażeniu i utrzymuje się przez kilka miesięcy6.

Schemat badania z zastrzykami u myszy; śledzi dane dotyczące surowicy i wątroby w analizie infekcji CYP2D6.

Rysunek 1. Model CYP2D6. Myszy FVB lub C57BL/6 typu dzikiego otrzymują dwie dawki Ad-2D6 (dożylnie i dosytnnowłoczniowo). W wyznaczonym czasie pobiera się wątrobę oraz surowicę, a następnie ocenia stopień uszkodzenia wątroby oraz obecność przeciwciał i limfocytów T specyficznych dla hCYP2D6.

Poniższe cechy są charakterystyczne dla uporczywego autoimmunologicznego zapalenia wątroby rozwijającego się po zakażeniu myszy typu dzikiego FVB lub C57BL/6 wirusem Ad-2D6 w modelu CYP2D6: Po pierwsze, wątroba wykazuje aberracyjnie zmienioną morfologię. W szczególności płaty wątroby są zlane, w całej wątrobie pojawiają się rozproszone guzki hiperplastyczne oraz widoczne jest masywne włóknienie torebkowe (rycina 2).

Porównanie morfologii wątroby; Ad-Control vs Ad-2D6; zmiany komórkowe; badania eksperymentalne.

Rysunek 2. Morfologia wątroby. Typowe uszkodzenie wątroby wywołane przez Ad-2D6, wykryte w 4. tygodniu po zakażeniu. Zauważalny jest zrost poszczególnych płatów wątroby (groty strzałek). Guzki hiperplastyczne są rozproszone w całej wątrobie (strzałki). Zakażenie kontrolnym adenowirusem niewyrażającym hCYP2D6 nie wpływa na morfologię wątroby.

Po drugie, w obszarach okołowrotowych i miąższowych wątrób myszy zakażonych Ad-2D6, ale nie tych zakażonych Ad-Control, pojawiają się rozległe i trwałe nacieki komórkowe (rycina 3A). Włóknienie rozwija się głównie w obszarze podtorebkowym, przy czym niektóre pęczki kolagenu wnikają do miąższu (rycina 3B).

Porównanie histologiczne, przekroje tkanki wątroby; immunobarwienie, skupienie na strukturze komórkowej; schemat.


Rycina 3. Histologia wątroby. A: Barwienie H&E przekroju tkanki wątroby myszy FVB zainfekowanych Ad-Control lub Ad-2D6 w 4. tygodniu po infekcji. Zauważalnie znaczne nacieki komórek jednojadrowych występują tylko u myszy zainfekowanych Ad-2D6 (pojedyncze strzałki). Potrójne strzałki wskazują większe nacieki komórkowe w miąższu wątroby, tworzące mostki między sąsiednimi drogami wrotnymi. B: Przedstawienie immunohistochemiczne włóknienia wątroby w 4. tygodniu po infekcji Ad-2D6 lub Ad-control. Przekroje wątroby zbarwiono na kolagen przy użyciu przeciwciała antykolagen I. Zauważalna jest wielowarstwowa depozycja kolagenu pod torebką wątroby (potrójne strzałki), z niektórymi pęczkami wnikającymi do miąższu (pojedyncze strzałki), a także obecność dużych skupisk komórek naciekających (groty strzałek). Dla każdego stanu zaprezentowano dwa reprezentatywne przekroje wątroby. Paski skali: 100μm.

Trzecią cechą jest generowanie wysokich mian przeciwciał anty-CYP2D6, które wykazują podobną specyficzność epitopową do ludzkich przeciwciał LKM-1 6,13. Ostatnim elementem jest generowanie swoistych dla hCYP2D6 limfocytów T CD4 i CD8, które migrują głównie do wątroby. Takie swoiste dla hCYP2D6 limfocyty T można wykryć poprzez stymulację immunodominującymi peptydami hCYP2D6 i następujący pomiar ekspresji IFNγ za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (ICCS) (rycina 4). Swoiste dla hCYP2D6 limfocyty T CD8 niszczą zakażone Ad-2D6 komórki docelowe in vivo 12.

Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej; epitopy CD4/CD8; analiza ekspresji IFNγ; badanie odpowiedzi immunologicznej.

Rysunek 4. Limfocyty T specyficzne dla hCYP2D6. Analiza cytometryczna limfocytów T specyficznych dla hCYP2D6. Limfocyty wątrobowe wyizolowano w 4. tygodniu po zakażeniu Ad-2D6 i stymulowano przez noc epitopem hCYP2D6 immunodominującym dla CD4 lub CD8. Produkcja IFNγ została wykryta za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin i przeanalizowana metodą cytometrii przepływowej przy użyciu FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy). Wskazano procentowy udział specyficznych dla hCYP2D6 komórek CD4 i CD8.

Dyskusja

W poprzednich badaniach często zgłaszano, że eksperymentalne zapalenie wątroby ma charakter jedynie przejściowy, a wiele obecnych modeli autoimmunologicznych chorób wątroby opiera się na dość złożonych protokołach indukcji choroby (przeglądy literatury patrz 3,5). Na przykład niektóre modele wykorzystują myszy transgeniczne wykazujące ekspresję specyficznych antygenów docelowych oraz adoptywnie przeniesione limfocyty T specyficzne dla antygenu docelowego, głównie transgeniczne TcR14,15. Często niezbędna jest dodatkowa infekcja wirusami hepatotropowymi, bakteriami lub pasożytami, aby wywołać chorobę16-18. Alternatywnie, w celu indukcji zapalenia wątroby stosuje się wakcynację DNA plazmidami kodującymi antygeny docelowe, w tym CYP2D619. Wymagana jest jednak dodatkowa wakcynacja plazmidami kodującymi cytokiny prozapalne, takie jak IL-1220. Niestety, z kilkoma wyjątkami15,20, zapalenie wątroby ma charakter jedynie przejściowy.

Model CYP2D66,21 wykorzystuje prostą metodę indukowania autoimmunologicznego zapalenia wątroby poprzez zakażenie myszy adenowirusem ekspresującym hCYP2D6, główny autoantygen w AIH-27,8. Dostarczenie CYP2D6 za pomocą konstrukcji adenowirusowej gwarantuje zarówno bezpośrednie celowanie w wątrobę, jak i miejscowy stan zapalny, który sprzyja przełamaniu tolerancji. Należy jednak zauważyć, że zarówno miano wirusa, jak i droga podania mają kluczowe znaczenie dla tego modelu. Z jednej strony Ad-2D6 jest wirusem z defektem replikacji, w związku z czym wymagane jest wystarczająco wysokie miano wirusa, aby wygenerować krytyczną ilość antygenu w wątrobie. Z drugiej strony zbyt wysokie miano może doprowadzić do śmiertelnej ostrej niewydolności wątroby. Ponadto wcześniej wykazano, że zakażenie myszy wysokimi mianami adenowirusa prowadzi do funkcjonalnego wyczerpania odpowiedzi immunologicznej22. W naszym modelu zastosowaliśmy połączenie zakażenia dożylnego i dosytchniczego, aby uzyskać zarówno przewlekłą infiltrację komórkową, jak i rozległą włóknicę. Zaobserwowaliśmy, że samo zakażenie dożylne nadal powoduje masywną infiltrację komórkową, ale nie wywołuje włóknicy w obszarze podtorebkowym, co wskazuje, że zapalenie otrzewnej spowodowane wstrzyknięciem dosytchniczym może być zaangażowane w ciągłą podtorebkową akumulację kolagenu (Hintermann & Christen, manuskrypt w przygotowaniu). Należy jednak podkreślić, że obserwowana włóknica wątroby jest specyficzna dla antygenu, ponieważ nie stwierdzono aktywacji komórek gwiaździstych wątroby ani odkładania kolagenu po zakażeniu równymi mianami wirusów Ad-GFP lub Ad-Control23.

Model CYP2D6 odzwierciedla wiele aspektów ludzkiego AIH1,2, takich jak przewlekłe zapalenie wątroby charakteryzujące się uporczywą naciekowością komórkową i włóknieniem wątroby6. Ponadto obecność przeciwciał anty-CYP2D6 o wysokim mianie, z podobną specyficznością epitopową i rozprzestrzenianiem się13 do przeciwciał LKM-1 występujących u pacjentów z AIH-2, wskazuje na obecność wspólnej przewlekłej reaktywności autoimmunologicznej. CYP2D6 jest głównym antygenem w AIH-2, lecz nie jest rozpoznawany przez pacjentów z diagnozą częściej występującego typu 1 AIH. Ponadto pacjenci cierpiący na inne choroby wątroby o etiologii autoimmunologicznej, takie jak pierwotna marskość żółciowa (PBC) lub pierwotne stwardniałe zapalenie dróg żółciowych (PSC), wytwarzają charakterystyczne autoprzeciwciała specyficzne dla odrębnych autoantygenów wątrobowych, a ich wątroby wykazują inne cechy patologiczne, koncentrujące się na małych (PBC) lub dużych (PSC) drogach żółciowych. Niemniej jednak modele CYP2D6 dają możliwość analizy immunopatogennych mechanizmów zaangażowanych w przewlekłe procesy zapalne wątroby, jakie występują podczas autoimmunologicznych chorób wątroby, zidentyfikowania kluczowych czynników napędzających autoimmunologiczną destrukcję hepatocytów oraz oceny możliwych interwencji terapeutycznych w celu wyleczenia choroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsza praca jest wspierana przez Szpital Uniwersytecki Goethego we Frankfurcie oraz grant z Niemieckiej Fundacji Badawczej przyznany U.C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
igła 23GBD Biosciences300800
igła 27½GVWR international612-0151
igła 30½ GBD Biosciences304000
paski testowe do oznaczania aminotransferazy alaninowej (GPT/ALT)Roche Group10 745 138 202
paski testowe do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej (GOT/AST)Roche Group10 745 120 202
urządzenie do znieczulenia Univentor 400figure-materials-1 AgnTho’s
jednorazowe formy do osadzania, 37x24x10 mmVWR international720-0208
sitko do komórek 70 mmVWR international734-0003
kriostatLeica MicrosystemsCM1850 UV
kapilary heparynowaneFisher Scientific3123987
szkiełka przedmiotowe Superfrost PlusMenzel-GlaserJ1800AMNZ
probówki Microtainer SSTBD Biosciences365951
płytki mikrotitracyjne z dnem w kształcie VVWR international391-1924
Reflotron PlusRoche GroupOznaczanie AST/ALT w surowicy
królicze przeciwciało anty-mysie przeciwkolagenowe typu I IgG,Chemicon InternationalAB765P
biotynilowane kozie przeciwciało anty-królicze IgGVector LaboratoriesVC-BA-1000-MC15
przeciwciało anty-mysie CD8a koniugowane z FITCSouthernBiotech1550-02
przeciwciało anty-mysie IFNγ koniugowane z PEBD Biosciences554412
przeciwciało anty-mysie CD16/CD32 koniugowane z PE (blokada FcR)BD Biosciences553141
AquatexVWR international1.08562.0050
zestaw blokujący awidyna/biotynaVector LaboratoriesVC-SP-2001-KI01
Brefeldyna ASigma-AldrichB6542
kolagenaza IVSigma-AldrichC5138-100MG
zestaw substratu DAB 3’,3’-diaminobenzydynaVector LaboratoriesVC-SK-4100-KI01
DNazaSigma-AldrichDN-25
odczynnik Elite ABCVector LaboratoriesVC-PK-7100-L050
roztwór eozyny G/YCarl Roth GmbhX883.1
płodowa surowica cielęca (FCS)Biochrom AGS 0115
izofluranForeneB506
roztwór hematoksyliny Meyer’aAppliChemA4840,1000
związek OCTSakura Finetek4583
formaldehyd 10% w buforze PBSCarl Roth GmbhA146.3
PercollAmersham17-0891-01
Roti-HistokitCarl Roth Gmbh6638.1
RPMIInvitrogen61870
saponina z kory QuillajaSigma-AldrichS7900

Bibliografia

  1. Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
  2. Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
  3. Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
  4. Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
  5. Czaja, A. J. Animal models of autoimmune hepatitis. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).
  6. Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
  7. Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
  8. Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
  9. von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
  10. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).
  11. Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
  12. Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
  13. Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
  14. Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
  15. Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
  16. Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
  17. Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
  18. Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
  19. Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
  20. Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
  21. Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
  22. Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
  23. Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model autoimmunologicznego zapalenia wątrobykonstrukt adenowirusowyperfuzja wątrobyizolacja limfocytówanaliza cytometrycznaocena immunohistochemicznaoczyszczanie w gradiencie Percolltrawienie kolagenaząpobieranie krwi z żyły zatomkowej
Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.