Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Podsumowanie

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

W przypadku wirusów o genomach RNA o polarności dodatniej, które są patogenne dla ludzi, zwierząt i roślin, enkapsydacja potomstwa do dojrzałych i stabilnych wirionów jest kluczową fazą w procesie ustanawiania infekcji u danego gospodarza. W konsekwencji badanie enkapsydacji pozwala na odczytanie informacji dotyczących mechanizmu regulującego składanie wirusa w celu tworzenia zakaźnych wirionów. Informacje te są niezbędne przy opracowywaniu nowych metod ograniczania rozprzestrzeniania się wirusów oraz kontroli chorób. Enkapsydację wirusów można badać in vivo i in vitroEnkapsydacja genomu in vivo jest wysoce regulowanym, selektywnym procesem obejmującym oddziaływania makromolekularne oraz kompartmentyzację wewnątrzkomórkową. Dlatego też badania zmierzające do przeanalizowania zdarzeń obejmujących enkapsydację wirusa in vivo zapewni podstawową wiedzę niezbędną do zrozumienia, w jaki sposób wirusy namnażają się i składają. Ostatnio in vitro enkapsydację wykorzystano w badaniach w obszarze obrazowania biomedycznego oraz zastosowań terapeutycznych. Nieotoczkowe wirusy roślinne zajmują wiodącą pozycję w przedsięwzięciach dotyczących in vitro enkapsydacja ujemnie naładowanego materiału obcego. Wirus mozaiki bromii (BMV), nieotoczkowy wieloskładnikowy wirus RNA patogenny dla roślin, był wykorzystywany jako modelowy system do badania pakowania genomu in vivo i in vitroDo testów enkapsydacji w *Nicotiana benthamiana* rośliny, Agrobacterium transjientna ekspresja pośredniczona przez Agrobacterium, określana jako agroinfiltracja, jest wydajną i niezawodną techniką zsynchronizowanego dostarczania i ekspresji wielu komponentów do tej samej komórki. W tej metodzie zawiesina z Agrobacterium tumefaciens komórki zawierające binarne wektory plazmidowe z cDNA pożądanych wirusowych mRNA są infiltrowane do przestrzeni międzykomórkowych wewnątrz liścia przy użyciu jedynie jednorazowej strzykawki o objętości 1 ml (bez igły). Proces ten prowadzi do transferu insertu DNA do komórek roślinnych; insert T-DNA pozostaje przejściowo w jądrze, gdzie jest transkrybowany przez polimerazę II gospodarza, co prowadzi do ekspresji przejściowej. Powstały transkrypty mRNA (z czapką i ogonem poli(A)) są następnie transportowane do cytoplazmy w celu translacji. Po około 24 do 48 godzinach inkubacji fragmenty infiltrowanych liści mogą zostać pobrane do analiz mikroskopowych lub biochemicznych. Agroinfiltracja pozwala na jednoczesną transfekcję bardzo dużej liczby (od setek do tysięcy) komórek. W celu enkapsydacji in vitro oczyszczone wiriony BMV są dysocjowane do białek kapsydu poprzez dializę przeciwko buforowi dysocjującemu zawierającemu chlorek wapnia, a następnie RNA oraz niedysocjowane wiriony są usuwane poprzez wirowanie. Subjednostki białek kapsydu pozbawione genomu są następnie ponownie składane z pożądanymi komponentami genomu wirusowego lub komponentami niewirusowymi, takimi jak barwnik indocyjaninowy.

Protokół

1. Materiał roślinny

1. Rośliny Nicotiana benthamiana wykorzystywane w teście enkapsydacji powinny znajdować się w stadium 4 liści (rośliny w wieku około 3-4 tygodni).

2. Dostarczenie i ekspresja funkcjonalnych komponentów genomu wirusowego do komórek roślinnych za pomocą agroinfiltracji

1. Dzień 1: Szczepy Agrobacterium (np. EH 105 lub GV 3101) zawierające pCass- BMV RNA 1, BMV RNA 2 i BMV RNA 3^1,2 hoduje się na płytkach z agarem LB z dodatkiem 50 mg/ml kanamycyny (selekcja wektora pCASS) i 100 mg/ml rifampicyny (selekcja Agrobacterium). Inkubację przeprowadza się w temperaturze 28 °C przez dwa dni.
2. Dzień 3: Pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB szczepia się do 2 ml pożywki LB zawierającej 50 mg/ml kanamycyny i 100 mg/ml rifampicyny na 1 dzień w temperaturze 28 °C w inkubatorze orbitalnym przy 250 RPM.
3. Dzień 4: Szczepi się 50 ml pożywki LB z dodatkiem 50 mg/ml kanamycyny, 100 mg/ml rifampicyny, 10 mM MES pH 5,6 oraz 100 mM acetosyringonu, dodając 1 ml kultury do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml; inkubację prowadzi się przez 16 godzin w temperaturze 28 °C w inkubatorze orbitalnym przy 250 RPM.
4. Dzień 5: Kulturę (po osiągnięciu OD₆₀₀ na poziomie 1,0) przenosi się do probówki Oak Ridge lub sterylnej probówki Falcon i wiruje przez 10 minut przy 5000 rpm w temperaturze 4 °C.
5. Osad rozpuszcza się w 10 ml 10 mM MgCl₂ i wiruje przez 10 minut przy 5000 RPM w temperaturze 4 °C; krok ten powtarza się raz jeszcze, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyku.
6. Osad resuspendsuje się w 10 ml buforu zawierającego 10 mM MgCl₂ i 10 mM MES (pH 5,6).
7. Pomiar OD₆₀₀ wykonuje się dla każdej z kultur BMV RNA 1, RNA 2 i RNA 3, a następnie dostosowuje się wartość do 0,1 OD₆₀₀ za pomocą 10 mM MgCl₂ i 10 mM MES (pH 5,6).
8. Miesza się po 1 ml każdej z trzech zawiesin kultur o OD₆₀₀ 0,1.
9. Dodaje się 100 mM acetosyringonu, delikatnie miesza i pozostawia mieszaninę w spokoju w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
10. Zawiesinę kultury pobiera się do strzykawki 1 ml bez igły.
11. Powyższą zawiesinę kultury infiltruje się w stronę abaksjalną 2-3 dobrze rozwiniętych liści N. benthamiana (rośliny 3-4 tygodniowe, na etapie 5 liści), delikatnie dociskając strzykawkę do połowy powierzchni abaksjalnej liścia.
12. Procedurę infiltracji powtarza się na pozostałych liściach.
13. Infiltrowane rośliny przechowuje się w szklarni w temperaturze 24 °C.
14. Infiltrowane liście zbiera się od 3 do 4 dni po infiltracji (dpi).

3. Oczyszczanie wirionów BMV

1. Zebrać liście N. benthamiana poddane agroinfiltracji mieszaniną zawierającą wszystkie trzy agrotransformanty BMV typu dzikiego.
2. Rozetrzeć liście w sterylnym moździerzu z tłuczkiem z równą objętością (w/v) buforu do ekstrakcji BMV (0,5 M NaAc; 0,08 M MgAc, pH 4,5 oraz 1/100 objętości β-merkaptoetanolu, który należy dodać bezpośrednio przed użyciem)³. Aby zmaksymalizować wydajność wirusa, zaleca się dodanie piasku płukanego kwasem (~0,5-1 g), co ułatwia rozcieranie i efektywną dezintegrację komórek.
3. Przefiltrować ekstrakt z liści przez 2-3 warstwy tkaniny muślinowej i zebrać frakcję płynną.
4. Ponownie rozetrzeć część zatrzymaną na tkaninie muślinowej z objętością buforu do ekstrakcji BMV równą początkowej masie materiału liściastego.
5. Powtórzyć procedurę filtracji przy użyciu tkaniny muślinowej. Kroki te należy przeprowadzać w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść roztwór filtratu do probówki do wirowania, dodać równą objętość schłodzonego chloroformu i mieszać w vorteksie (lub wstrząsać) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aż zawiesina zmieni kolor na jasnozielony.
7. Wirować zemulgowany roztwór przez 15 minut przy 12 000 RPM w temperaturze 4 °C.
8. Zebrać fazę wodną i mieszać przez 30 minut na mieszadle magnetycznym w celu usunięcia resztek chloroformu.
9. Przenieść zawiesinę do sterylnej probówki do ultrawirowania.
10. Na dnie umieścić 1 ml 10% sacharozy (przygotowanej w buforze do ekstrakcji wirusa) jako poduszkę³.
11. Wirować przy 30 000 rpm przez 3 godziny w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.
12. Odlać supernatant i resuspender osad w pożądanej objętości buforu do zawieszenia BMV (aby przygotować bufor do zawieszenia, należy rozcieńczyć bufor do ekstrakcji BMV 10-krotnie sterylną wodą destylowaną).
13. Uzyskany w poprzednim kroku preparat częściowo oczyszczonych wirionów poddać wirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy 10-40% przez 150 min przy 28 000 rpm w temperaturze 4 °C.
14. Zebrać prążek wirusa ręcznie lub za pomocą frakcjonatora. Prążek wirusa będzie widoczny jako niebieski pod białym światłem.
15. Rozcieńczyć roztwór sacharozy zawierający próbkę wirusa co najmniej 50% buforem do zawieszenia wirusa.
16. Wirować rozcieńczony roztwór sacharozy z wirusem przez 3 godziny przy 30 000 rpm w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.
17. Na koniec resuspender wysoko oczyszczony osad wirusowy w pożądanej objętości buforu do zawieszenia wirusa.
18. Zmierzyć stężenie wirionów (mg/ml) za pomocą spektrofotometru przy OD₂₆₀.

Uwaga: Na podstawie zawartości RNA współczynnik ekstynkcji dla BMV wynosi 5⁴.

19. Zweryfikuj czystość wirionów, obserwując je pod TEM (Ryc. A)

4. Przygotowanie podjednostek białka kapsydu do montażu in vitro

1. Przygotować 1 Liter 1x buforu do dysocjacji wirusa (0,5 M CaCl₂; 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 1,0 mM EDTA; 1,0 mM DTT oraz 0,5 mM PMSF)⁵.
2. Przygotować membranę dializacyjną zgodnie z metodą Sambrook et al ⁶.
3. Przenieść wymaganą koncentrację oczyszczonego wirusa do worka dializacyjnego.
4. Umieścić worek dializacyjny zawierający wirusa w zlewce z 1x buforem do dysocjacji wirusa.
5. Dializować przez 24 godziny w temperaturze 4°C przy ciągłym mieszaniu.
6. Zebrać roztwór z worka dializacyjnego po 24 godzinach i odwirować przy 12 000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na oddzielenie RNA BMV od dysocjowanych wirionów.
7. Zebrać supernatant i odwirować przy 35 000 rpm w wirówce Beckman przez 3 godziny w temperaturze 4°C, aby osadzić wszelkie niedysocjowane cząsteczki wirusa.
8. Zebrać supernatant.
9. Na tym etapie niezbędne jest usunięcie wszelkich zanieczyszczających RNA wirionów z dysocjowanych podjednostek białek kapsydu. W tym celu supernatant z kroku 8 należy poddać kolejnej rundzie nocnego składania podjednostek białek kapsydu bez dodawania RNA (w 1x buforze do składania RNA, patrz poniżej), a następnie poddać szybkiemu wirowaniu (30 000 rpm przez 3 h w 4 °C), aby osadzić wszelkie złożone wiriony. Po tym etapie składania supernatant zawierający podjednostki białek otoczki powinien być wolny od resztkowych zanieczyszczeń RNA. Aby jednak mieć pewność, zaleca się przeprowadzenie dodatkowego składania in vitro z samymi podjednostkami białek otoczki przy użyciu 1x buforu do składania RNA. Po nocnym składaniu preparat musi być wolny od złożonych wirionów (zweryfikować za pomocą TEM).
10. Wyznaczyć stężenie podjednostek białek kapsydu, mierząc absorbancję przy OD 254 i 280 nm lub innymi metodami, takimi jak test Bradforda.
11. Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w żelu 12-15%, a następnie western blot, aby ocenić integralność dysocjowanych podjednostek białek kapsydu.

5. Montaż wirionów zawierających RNA in vitro

1. Przygotować transkrypty RNA do ponownego złożenia w wiriony i obliczyć ich stężenie⁷.
2. Wymieszać podjednostki białka kapsydu i transkrypty RNA w stosunku 1:5 (masowo/masowo)⁵.
3. Przenieść powyższą mieszaninę do worka dializacyjnego i odpowiednio zabezpieczyć, aby uniknąć wycieków.
4. Przygotować 1 000 ml 1x buforu do składania RNA (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,2; 10 mM KCl; 5 mM MgCl₂, 1,0 mM DTT)⁵.
5. Umieścić worek dializacyjny zawierający mieszaninę reakcyjną w zlewce z 1x buforem do składania i mieszać.
6. Prowadzić dializę reakcji ponownego składania w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przy łagodnym mieszaniu.
7. Zebrać mieszaninę z worka dializacyjnego po 24 godzinach i dodać 1,5 ml buforu do składania RNA.
8. Przepuścić tę mieszaninę przez kolumnę Centricon-100, wirując z niską prędkością (2 000x g) przez 30 minut.
9. Przemyć kolumnę raz 1,5 ml buforu do składania w temperaturze 4 °C przez 30 min.
10. Powtórzyć powyższy etap płukania dwukrotnie.
11. Na koniec eluować ponownie złożone wiriony poprzez wirowanie przy 10 000g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
12. Oszacować stężenie wirionów przy OD 260 nm.

6. Fabrykacja optycznych wydmuszek wirusowych (OVGs)

1. Dodać zieleń indocyjaninową (ICG)⁸ do oczyszczonego białka kapsydu w żądanym stosunku stężeń (stosunek wagowy zieleni indocyjaninowej do białka kapsydu zastosowany w niniejszym raporcie wynosił 1:10) i wymieszać dokładnie za pomocą pipety.
2. Dializować roztwór białka kapsydu i ICG przeciwko buforowi do montażu OVG (1 M NaCl; 50 mM NaAc; 1 mM EDTA; oraz 1 mM DTT, pH4,8) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
3. Po 24 godzinach zebrać roztwór z worka dializacyjnego (wielkość porów 12 kDa) i wirować przy 90 000 rpm przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C (Rys. B).
4. Usunąć nadsącz i zawiesić osad w buforze do zawiesiny BMV poprzez wirowanie w wortexie lub pozostawiając go do samoistnego zawieszenia w buforze do zawiesiny BMV przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Zweryfikować morfologię OVG za pomocą TEM (Rys. C).
6. Zmierzyć absorbancję w zakresie od 240 nm do 950 nm za pomocą spektrofotometru (Cary 50, Varian Inc.); obecność ICG potwierdza się poprzez charakterystyczne piki absorbancji w okolicach 700 nm i 790 nm⁸. (Rys. D)
7. Typowe piki fluorescencji ICG przy ~700 nm i ~800 nm można zaobserwować po wzbudzeniu roztworu OVG falą o długości 620 nm (Rys. D) przy użyciu spektrofluorometru (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek A. Obraz TEM wirionów BMV barwionych negatywnie, oczyszczonych z roślin N. benthamiana poddanych agroinfiltracji mieszaniną trzech agrokonstruktów BMV typu dzikiego (pasek skali = 100 nm).

Rysunek B. Osad z zmontowanych in vitro ICG zawierających OVGs po wirowaniu z dużą prędkością.

Rycina C. Obraz TEM OVGs zawierających ICG barwionych negatywnie (pasek skali = 100 nm).

Rycina D. Widma absorbancji (góra) i fluorescencji (dół) OVG. Długość fali wzbudzenia użyta do emisji OVG wynosiła 620 nm.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda agroinfiltracji może mieć szerokie zastosowanie w odniesieniu do wielu wirusów roślin. Kluczową cechą tego podejścia jest zsynchronizowane dostarczenie wielu agrokonstruktów do tej samej komórki, co stanowi główną wadę powszechnie stosowanej rutynowej inokulacji mechanicznej wirusów roślin. Badania nad montażem wirionów in vivo i in vitro z wykorzystaniem wirusa mozaiki jęczmienia (BMV) jako modelu można przeprowadzić efektywnie, stosując się do kilku wskazówek: (i) aby uzyska...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sole MES sodowe	Sigma-Aldrich	M2993
Zieleń indocyjaninowa	Sigma-Aldrich	I2633
Ultrawirówka Beckman	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Kolumna Centricon-100	EMD Millipore	YM-100
Spektrofotometr	Varian, Inc.	Numer części 10068900
Spektrofluorometr	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Numer części FL3-21