Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Podsumowanie

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

W przypadku wirusów o genomach RNA o polarności dodatniej, które są patogenne dla ludzi, zwierząt i roślin, enkapsydacja potomstwa do dojrzałych i stabilnych wirionów jest kluczową fazą w procesie ustanawiania infekcji u danego gospodarza. W konsekwencji badanie enkapsydacji pozwala na odczytanie informacji dotyczących mechanizmu regulującego składanie wirusa w celu tworzenia zakaźnych wirionów. Informacje te są niezbędne przy opracowywaniu nowych metod ograniczania rozprzestrzeniania się wirusów oraz kontroli chorób. Enkapsydację wirusów można badać in vivo i in vitroEnkapsydacja genomu in vivo jest wysoce regulowanym, selektywnym procesem obejmującym oddziaływania makromolekularne oraz kompartmentyzację wewnątrzkomórkową. Dlatego też badania zmierzające do przeanalizowania zdarzeń obejmujących enkapsydację wirusa in vivo zapewni podstawową wiedzę niezbędną do zrozumienia, w jaki sposób wirusy namnażają się i składają. Ostatnio in vitro enkapsydację wykorzystano w badaniach w obszarze obrazowania biomedycznego oraz zastosowań terapeutycznych. Nieotoczkowe wirusy roślinne zajmują wiodącą pozycję w przedsięwzięciach dotyczących in vitro enkapsydacja ujemnie naładowanego materiału obcego. Wirus mozaiki bromii (BMV), nieotoczkowy wieloskładnikowy wirus RNA patogenny dla roślin, był wykorzystywany jako modelowy system do badania pakowania genomu in vivo i in vitroDo testów enkapsydacji w *Nicotiana benthamiana* rośliny, Agrobacterium transjientna ekspresja pośredniczona przez Agrobacterium, określana jako agroinfiltracja, jest wydajną i niezawodną techniką zsynchronizowanego dostarczania i ekspresji wielu komponentów do tej samej komórki. W tej metodzie zawiesina z Agrobacterium tumefaciens komórki zawierające binarne wektory plazmidowe z cDNA pożądanych wirusowych mRNA są infiltrowane do przestrzeni międzykomórkowych wewnątrz liścia przy użyciu jedynie jednorazowej strzykawki o objętości 1 ml (bez igły). Proces ten prowadzi do transferu insertu DNA do komórek roślinnych; insert T-DNA pozostaje przejściowo w jądrze, gdzie jest transkrybowany przez polimerazę II gospodarza, co prowadzi do ekspresji przejściowej. Powstały transkrypty mRNA (z czapką i ogonem poli(A)) są następnie transportowane do cytoplazmy w celu translacji. Po około 24 do 48 godzinach inkubacji fragmenty infiltrowanych liści mogą zostać pobrane do analiz mikroskopowych lub biochemicznych. Agroinfiltracja pozwala na jednoczesną transfekcję bardzo dużej liczby (od setek do tysięcy) komórek. W celu enkapsydacji in vitro oczyszczone wiriony BMV są dysocjowane do białek kapsydu poprzez dializę przeciwko buforowi dysocjującemu zawierającemu chlorek wapnia, a następnie RNA oraz niedysocjowane wiriony są usuwane poprzez wirowanie. Subjednostki białek kapsydu pozbawione genomu są następnie ponownie składane z pożądanymi komponentami genomu wirusowego lub komponentami niewirusowymi, takimi jak barwnik indocyjaninowy.

Protokół

1. Materiał roślinny

1. Rośliny Nicotiana benthamiana wykorzystywane w teście enkapsydacji powinny znajdować się w stadium 4 liści (rośliny w wieku około 3-4 tygodni).

2. Dostarczanie i ekspresja funkcjonalnych komponentów genomu wirusa do komórek roślinnych za pomocą agroinfiltracji

1. Dzień 1: Szczepy Agrobacterium (np. EH 105 lub GV 3101) zawierające pCass- BMV RNA 1, BMV RNA 2 oraz BMV RNA 3^1,2 hoduje się na płytkach z agarem LB uzupełnionym o 50 mg/ml kanamycyny (selekcja wektora pCASS) i 100 mg/ml rifampicyny (selekcja Agrobacterium). Inkubację prowadzi się w temperaturze 28 °C przez dwa dni.
2. Dzień 3: Pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB przenosi się do 2 ml bulionu LB zawierającego 50 mg/ml kanamycyny i 100 mg/ml rifampicyny i inkubuje przez 1 dzień w temperaturze 28 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM.
3. Dzień 4: 50 ml bulionu LB uzupełnionego o 50 mg/ml kanamycyny, 100 mg/ml rifampicyny, 10 mM MES pH 5.6 oraz 100 mM acetosyringonu inokuluje się za pomocą 1 ml kultury w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i inkubuje przez 16 godzin w temperaturze 28 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM.
4. Dzień 5: Kulturę (po osiągnięciu OD₆₀₀ na poziomie 1.0) przenosi się do probówki Oak Ridge lub sterylnej probówki Falcon i wiruje przez 10 minut przy 5000 rpm w temperaturze 4 °C.
5. Osad rozpuszcza się w 10 ml 10 mM MgCl₂ i wiruje przez 10 minut przy 5000 RPM w temperaturze 4 °C. Krok ten powtarza się drugi raz, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyku.
6. Osad resuspensuje się w 10 ml buforu zawierającego 10 mM MgCl₂ i 10 mM MES (pH 5.6).
7. Pomiar OD₆₀₀ przeprowadza się dla każdej z kultur BMV RNA 1, RNA 2 i RNA 3, a następnie dostosowuje wartość do 0.1 OD₆₀₀ za pomocą 10 mM MgCl₂ i 10 mM MES (pH 5.6).
8. Miesza się po 1 ml każdej z trzech zawiesin kultur o OD₆₀₀ 0.1.
9. Dodaje się 100 mM acetosyringonu, miesza delikatnie i pozostawia mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
10. Zawiesinę kultury pobiera się do strzykawki 1 ml bez igły.
11. Powyższą zawiesinę kultury infiltruje się w stronę abaksjalną 2-3 w pełni rozwiniętych liści N. benthamiana (rośliny 3-4 tygodniowe, w stadium 5 liści), delikatnie dociskając strzykawkę do połowy powierzchni abaksjalnej liścia.
12. Procedurę infiltracji powtarza się na pozostałych liściach.
13. Infiltrowane rośliny przechowuje się w szklarni w temperaturze 24 °C.
14. Infiltrowane liście zbiera się od 3 do 4 dni po infiltracji (dpi).

3. Oczyszczanie wirionów BMV

1. Zebrać liście N. benthamiana po agroinfiltracji mieszaniną zawierającą wszystkie trzy agrotransformanty BMV typu dzikiego.
2. Rozetrzeć liście w sterylnym moździerzu z tłuczkiem z równą objętością (w/v) buforu do ekstrakcji BMV (0,5 M NaAc; 0,08 M MgAc, pH 4,5 oraz 1/100 objętości β-merkaptoetanolu, który należy dodać bezpośrednio przed użyciem)³. Aby zmaksymalizować wydajność wirusa, zaleca się dodanie piasku płukanego kwasem (~0,5-1 g), co ułatwia rozcieranie i efektywną dezintegrację komórek.
3. Przefiltrować ekstrakt z liści przez 2-3 warstwy tkaniny muślinowej i zebrać frakcję stałą.
4. Ponownie rozetrzeć część zatrzymaną na tkaninie muślinowej z objętością buforu do ekstrakcji BMV równą początkowej masie materiału liściowego.
5. Powtórzyć procedurę filtracji przy użyciu tkaniny muślinowej. Kroki te powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść roztwór filtratu do probówki do wirowania, dodać równą objętość schłodzonego chloroformu i mieszać w vortexie (lub wstrząsać) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aż zawiesina zmieni kolor na jasnozielony.
7. Wirować zemulgowany roztwór przez 15 minut przy 12 000 RPM w temperaturze 4 °C.
8. Zebrać fazę wodną i mieszać przez 30 minut na mieszadle magnetycznym, aby usunąć resztki chloroformu.
9. Przenieść zawiesinę do sterylnej probówki do ultrawirowania.
10. Na dno nalać 1 ml 10% sacharozy (przygotowanej w buforze do ekstrakcji wirusa) w celu stworzenia poduszki³.
11. Wirować przy 30 000 rpm przez 3 godziny w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.
12. Odlać nadsącz i zawiesić osad w pożądanej objętości buforu do zawiesin BMV (aby przygotować bufor do zawiesin, należy rozcieńczyć bufor do ekstrakcji BMV 1/10 sterylną wodą destylowaną).
13. Częściowo oczyszczony preparat wirionów z powyższego etapu poddać wirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy 10-40% przez 150 min przy 28 000 rpm w temperaturze 4 °C.
14. Zebrać prążek wirusa ręcznie lub za pomocą frakcjonatora. Prążek wirusa będzie widoczny jako niebieski przy oświetleniu białym światłem.
15. Rozcieńczyć roztwór sacharozy zawierający próbkę wirusa co najmniej 50% buforem do zawiesin wirusowych.
16. Wirować rozcieńczony roztwór sacharozy zawierający wirusa przez 3 godziny przy 30 000 rpm w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.
17. Na koniec zawiesić wysoko oczyszczony osad wirusa w pożądanej objętości buforu do zawiesin wirusowych.
18. Zmierzyć stężenie wirionów (mg/ml) za pomocą spektrofotometru przy OD₂₆₀.

Uwaga: W oparciu o zawartość RNA, współczynnik ekstynkcji dla BMV wynosi 5⁴.

19. Zweryfikować czystość wirionów, obserwując je pod TEM (Ryc. A)

4. Przygotowanie podjednostek białka kapsydu do montażu in vitro

1. Przygotować 1 Liter 1x buforu do dysocjacji wirusa (0.5 M CaCl₂; 50 mM Tris HCl, pH 7.5; 1.0 mM EDTA; 1.0 mM DTT oraz 0.5 mM PMSF)⁵.
2. Przygotować membranę dializacyjną zgodnie z procedurą Sambrook et al ⁶.
3. Przenieść oczyszczony wirus o wymaganym stężeniu do worka dializacyjnego.
4. Umieścić worek dializacyjny zawierający wirusa w zlewce z 1x buforem do dysocjacji wirusa.
5. Dializować przez 24 godziny w temperaturze 4°C przy ciągłym mieszaniu.
6. Po 24 godzinach zebrać roztwór z worka dializacyjnego i wirować przy 12,000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na oddzielenie RNA BMV od zdysocjowanych wirionów.
7. Zebrać nadsącz i wirować przy 35,000 rpm w wirówce Beckman przez 3 godziny w temperaturze 4°C, aby osadzić wszelkie niezdysocjowane cząsteczki wirusa.
8. Zebrać nadsącz.
9. Na tym etapie konieczne jest usunięcie zanieczyszczającego RNA wirionów z zdysocjowanych podjednostek białka kapsydu. W tym celu nadsącz z kroku 8 należy poddać kolejnej rundzie nocnej reasemblacji podjednostek białka kapsydu bez dodawania RNA (w RNA 1x buforze do montażu, patrz poniżej), a następnie wirowaniu przy wysokiej prędkości (30,000 rpm przez 3 h w 4 °C), aby osadzić wszelkie zmontowane wiriony. Po tym etapie reasemblacji nadsącz zawierający podjednostki białka otoczki powinien być wolny od resztkowego zanieczyszczającego RNA. Aby jednak mieć to pewności, zaleca się przeprowadzenie dodatkowej reasemblacji in vitro z samymi podjednostkami białka otoczki przy użyciu RNA 1x buforu do montażu. Po nocnej reasemblacji preparat musi być wolny od zmontowanych wirionów (potwierdzić za pomocą TEM).
10. Oznaczyć stężenie podjednostek białka kapsydu, mierząc absorbancję przy OD 254 i 280 nm lub innymi metodami, takimi jak test Bradforda.
11. Przeprowadzić 12-15% SDS-PAGE, a następnie western blot, aby ocenić integralność zdysocjowanych podjednostek białka kapsydu.

5. Montaż wirionów zawierających RNA in vitro

1. Przygotować transkrypty RNA do ponownego montażu w wiriony i obliczyć ich stężenie⁷.
2. Wymieszać podjednostki białek kapsydu i transkrypty RNA w stosunku 1:5 (masowych)⁵.
3. Przenieść powyższą mieszaninę do worka dializacyjnego i odpowiednio zabezpieczyć, aby uniknąć wycieków.
4. Przygotować 1 000 ml 1x buforu do montażu RNA (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7.2; 10 mM KCl; 5 mM MgCl₂, 1,0 mM DTT)⁵.
5. Umieścić worek dializacyjny zawierający mieszaninę reakcyjną w zlewce z 1x buforem do montażu i mieszać.
6. Prowadzić dializę reakcji ponownego montażu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przy łagodnym mieszaniu.
7. Zebrać mieszaninę z worka dializacyjnego po 24 godzinach i dodać 1,5 ml buforu do montażu RNA.
8. Przepuścić tę mieszaninę przez kolumnę Centricon-100, wirując z niską prędkością (2 000x g) przez 30 minut.
9. Przemyć kolumnę raz 1,5 ml buforu do montażu w 4 °C przez 30 min.
10. Powtórzyć powyższy etap przemywania dwukrotnie.
11. Na koniec eluować ponownie zmontowane wiriony poprzez wirowanie przy 10 000g w 4 °C przez 5 min.
12. Oszacować stężenie wirionów przy OD 260 nm.

6. Fabrykacja optycznych wydmuszek wirusowych (OVGs)

1. Dodać zieleń indocyjaninową (ICG)⁸ do oczyszczonego białka kapsydu w pożądanym stosunku stężeń (stosunek wagowy zieleni indocyjaninowej do białka kapsydu zastosowany w niniejszym raporcie wyniósł 1:10) i wymieszać dokładnie za pomocą pipety.
2. Dializować roztwór białka kapsydu i ICG przeciwko buforowi montażowemu OVG (1 M NaCl; 50 mM NaAc; 1 mM EDTA; oraz 1 mM DTT, pH 4,8) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
3. Po 24 godzinach zebrać roztwór z worka dializacyjnego (rozmiar porów 12 kDa) i wirować przy 90 000 rpm przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C (Ryc. B).
4. Usunąć nadsącz i zawiesić osad w buforze suspensyjnym BMV poprzez mieszanie w wortexie lub pozostawiając go do samoistnego zawieszenia w buforze suspensyjnym BMV przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Zweryfikować morfologię OVG za pomocą TEM (Ryc. C).
6. Zmierzyć absorbancję w zakresie od 240 nm do 950 nm przy użyciu spektrofotometru (Cary 50, Varian Inc.); obecność ICG potwierdza się charakterystycznymi pikami absorbancji w okolicach 700 nm i 790 nm⁸. (Ryc. D)
7. Typowe piki fluorescencji ICG przy ~700 nm i ~800 nm można zaobserwować po wzbudzeniu roztworu OVG przy 620 nm (Ryc. D) przy użyciu spektrofluorometru (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

7. Reprezentatywne wyniki

Rycina A. Obraz TEM wirionów BMV barwionych negatywnie, oczyszczonych z roślin N. benthamiana poddanych agroinfiltracji mieszaniną trzech agrokonstruktów BMV typu dzikiego (pasek skali = 100 nm).

Rysunek B. Osad zmontowanego in vitro ICG zawierającego OVGs po wirowaniu przy wysokiej prędkości.

Rysunek C. Obraz TEM z negatywnym barwieniem ICG zawierającego OVGs (pasek skali = 100 nm).

Rycina D. Widma absorbancji (góra) i fluorescencji (dół) OVG. Długość fali wzbudzenia użyta do emisji OVG wynosiła 620 nm.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda agroinfiltracji może mieć szerokie zastosowanie w odniesieniu do wielu wirusów roślin. Kluczową cechą tego podejścia jest zsynchronizowane dostarczenie wielu agrokonstruktów do tej samej komórki, co stanowi główną wadę powszechnie stosowanej rutynowej inokulacji mechanicznej wirusów roślin. Badania nad montażem wirionów in vivo i in vitro z wykorzystaniem wirusa mozaiki jęczmienia (BMV) jako modelu można przeprowadzić efektywnie, stosując się do kilku wskazówek: (i) aby uzyska...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sole MES sodowe	Sigma-Aldrich	M2993
Zieleń indocyjaninowa	Sigma-Aldrich	I2633
Ultrawirówka Beckman	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Kolumna Centricon-100	EMD Millipore	YM-100
Spektrofotometr	Varian, Inc.	Numer części 10068900
Spektrofluorometr	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Numer części FL3-21