System hodowli na filmach jedwabnych do analiz in vitro i projektowania biomateriałów

Podsumowanie

Filmy jedwabne stanowią nową klasę biomateriałów, które można łatwo dostosować do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych. Przedstawiony system hodowli na filmach jedwabnych jest wysoce adaptowalny do różnorodnych analiz in vitro. System ten stanowi platformę projektowania biomateriałów, umożliwiającą optymalizację in vitro przed bezpośrednim przejściem do modeli in vivo.

Streszczenie

Filmy jedwabne są obiecującymi biomateriałami na bazie białek, które mogą być wytwarzane z wysoką precyzją i w sposób ekonomiczny w warunkach laboratorium badawczego ^1,2 . Materiały te są pożądane, ponieważ posiadają wysoce kontrolowalne charakterystyki wymiarowe i materiałowe, są biokompatybilne i wspomagają adhezję komórek, mogą być modyfikowane poprzez nadawanie topografii powierzchni lub jej chemiczną modyfikację, a także mogą służyć jako repozytorium biologicznie czynnych cząsteczek w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków ^3-8 . Ponadto filmy jedwabne są stosunkowo proste w projektowaniu specjalistycznym, mogą być opracowane tak, aby rozpuścić się w ciągu kilku minut lub degradować w ciągu wielu lat in vitro lub in vivo, a ich dodatkową zaletą jest naturalna przezroczystość, co czyni je bardzo odpowiednimi do zastosowań w obrazowaniu ^9-13. Przedstawiona tutaj metodologia systemu hodowli stanowi skalowalne podejście do szybkiej oceny oddziaływań między komórkami a powierzchnią filmu jedwabnego. Szczególnie interesujące jest wykorzystanie jedwabnych filmów z wzorowaną powierzchnią do badania różnic w proliferacji komórek oraz ich odpowiedzi w zakresie orientacji przestrzennej ^12,14 . Wysiane kultury hodowano zarówno na mikrowzorowanych, jak i płaskich podłożach z filmu jedwabnego, a następnie oceniano za pomocą obrazowania w fazowym kontraście w trybie time-lapse, skaningowej mikroskopii elektronowej oraz biochemicznej oceny aktywności metabolicznej i zawartości kwasów nukleinowych. Podsumowując, system hodowli in vitro na filmach jedwabnych oferuje konfigurowalny układ eksperymentalny odpowiedni do badania oddziaływań komórka-powierzchnia na podłożu biomateriałowym, który może zostać zoptymalizowany, a następnie przeniesiony do modeli in vivo. Obserwacje z wykorzystaniem prezentowanego tutaj systemu hodowli są obecnie stosowane w aplikacjach obejmujących zakres od podstawowych oddziaływań komórkowych po projektowanie urządzeń medycznych, przez co mają znaczenie dla szerokiego spektrum dziedzin biomedycznych.

Protokół

1. Wykonanie form z gumy silikonowej

1. Przygotować lub zakupić odpowiednią powierzchnię topograficzną do odlewu. W niniejszej publikacji opisany zostanie standardowy trawiony wafle krzemowy o średnicy 100 mm (Rycina 1).
2. Odważyć polidimetylosiloksan (PDMS) – bazę (komponent A) oraz katalizator (komponent B) w stosunku 1:9 (9 g bazy i 1 g katalizatora), zgodnie z zestawem dostarczonym w zakupionym komplecie.
3. Dokładnie wymieszać roztwory, aby rozpocząć proces utwardzania.
4. Umieścić powierzchnię wafla krzemowego w naczyniu do odlewania.
5. Nanieść 4,5 g roztworu PDMS na wafel krzemowy.
6. Rozprowadzić roztwór PDMS tak, aby pokrył obszar o średnicy 100 mm powierzchni wafla.
7. Przechylić wafel, aby równomiernie rozprowadzić roztwór PDMS.
8. Przykryć wafel pokrywką od szalki Petriego o średnicy 100 mm.
9. Umieścić zestaw do odlewania w piekarniku w temperaturze 60 °C na noc, upewniając się, że utwardzanie odbywa się na płaskiej powierzchni.
10. Przed usunięciem umieścić utwardzony PDMS/wafel krzemowy w kąpieli z 70% etanolu.
11. Rozpocząć usuwanie PDMS z wafla, używając żyletki do podważenia krawędzi (wzdłuż całego obwodu).
12. Ostrożnie odciągnąć PDMS za pomocą pincety w kąpieli z 70% etanolu, uważając, aby nie rozerwać odlewu z gumy silikonowej.
13. Wykrawać poszczególne formy PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 14 mm. Średnica ta została dobrana tak, aby pasowała do układu płytek 24-dołkowych.

2. Przygotowanie roztworu jedwabiu

1. Zagotować 2 L wody destylowanej (dH₂O) w zlewce szklanej ⁷.
2. Pokroić 5 g kokonów jedwabnika Bombyx mori na trzy części.
3. Usunąć kokony silnie zanieczyszczone, co objawia się nadmierną ilością cząsteczek owadów pokrywających wewnętrzną powierzchnię kokonu.
4. Odważyć 4,24 g węglanu sodu.
5. Powoli dodawać węglan sodu do wrzącej wody dH₂O, aby zapobiec wykipieniu, i odczekać do całkowitego rozpuszczenia przed kontynuacją.
6. Dodać kawałki kokonów do wrzącej wody dH₂O na 40 min., mieszając kokony podczas gotowania za pomocą mieszadła magnetycznego z powłoką teflonową.
7. Po gotowaniu ostrożnie zlać dH₂O do zlewu i ręcznie wycisnąć ekstrakt jedwabny, aby usunąć nadmiar wody.
8. Przemyć ekstrakt jedwabny trzy razy po 20 min. każdy w 1 L dH₂O w zlewce laboratoryjnej, używając mieszadła do cyrkulacji cieczy w zlewce.
9. Po przemyciu ręcznie wycisnąć ekstrakt jedwabny i umieścić go w dygestorium w celu suszenia przez 12 h.
10. Następnego dnia zważyć wysuszone włókna jedwabiu, których masa zazwyczaj wynosi ~3,5 g: ___________-g
11. Przygotować roztwór LiBr 9,3 M dla 20% (m/v) roztworu jedwabiu. Wykorzystać następujące równania do obliczenia niezbędnej masy i objętości:
    1. (Masa ekstraktu jedwabnego z kroku 10) x (4) = ___________-mL całkowitej objętości roztworu LiBr 9,3 M
    2. [(807,705) x (objętość LiBr z części 11.a)]/1000 = ___________ g LiBr do dodania do dH₂O
12. Dodać odważoną masę LiBr do zlewki szklanej zawierającej następującą objętość dH₂O:
    1. (0,8) x (obliczona objętość z kroku 11.a) = ___________ mL dH₂O
13. Przelać ten roztwór do odpowiedniej wielkości cylindra miarowego i uzupełnić roztwór do objętości końcowej obliczonej w części 11.a.
14. Umieścić ekstrakt jedwabny w zlewce i zalać go roztworem LiBr, upewniając się za pomocą szpatułki laboratoryjnej, że włókna jedwabiu są całkowicie zanurzone w roztworze LiBr.
15. Umieścić rozpuszczony jedwab w suszarce w temperaturze 60 °C na 4 h:
    Godzina rozpoczęcia: ___________
    Godzina zakończenia: ___________
16. Za pomocą odpowiedniej wielkości strzykawki pobrać 12 mL roztworu jedwabiu. Na końcówce strzykawki umieścić igłę 18G, a następnie wstrzyknąć roztwór do kasety dializacyjnej (cutoff 3 500 MW, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Po napełnieniu kasety odessać z niej pozostałe powietrze za pomocą opróżnionej strzykawki.
17. Umieścić napełnioną kasetę dializacyjną w 1 L dH₂O.
18. Wymieniać dH₂O po 1 h, 4 h, 8 h, a następnie co 12 h (3x), łącznie 6 wymian:
    1. Start: ___________
    2. 1 h: ___________
    3. 4 h: ___________
    4. 8 h: ___________
    5. 12 h: ___________
    6. 12 h: ___________
    7. 12 h: ___________
    8. Koniec: ___________
19. Po dializie powoli zebrać roztwór jedwabiu z kaset za pomocą strzykawki. Przenieść roztwór do probówek wirówkowych przeznaczonych do 10 000 g.
20. Wirować roztwór dwukrotnie przy 10 000 g w temperaturze 4 °C przez 20 min za każdym razem. Po każdym wirowaniu przenieść nadsącz do nowej probówki.
21. Przechowywać roztwór jedwabiu w lodówce w temperaturze 4 °C.
22. Pipetować 2 próbki po 0,5 mL roztworu jedwabiu do małych naczynek wagowych i umieścić je w suszarce w temperaturze 60 °C na 12 godzin lub do całkowitego wyschnięcia roztworu jedwabiu.
23. Zważyć pozostałą stałą błonę jedwabną z obu próbek, aby zmierzyć procentowe stężenie białka w roztworze jedwabiu (masy do objętości):
    1. Masa połączonych 2 próbek błony jedwabnej:___________ mg
    2. (Masa z 23.a) x (100) = ___________% jedwabiu

3. Przygotowanie błon jedwabnych i konfiguracja systemu hodowli

1. Przygotować powierzchnie do odlewania PDMS, oczyszczając je za pomocą przezroczystej taśmy w celu usunięcia kurzu.
2. Oczyścić podłoża PDMS poprzez namoczenie w 70% EtOH i przemyć trzykrotnie dH₂O.
3. Umieścić 14 mm formy PDMS na płytce uchwytu, którą zazwyczaj jest pokrywa płytki 24-dołkowej.
4. Aby uzyskać film o grubości 50 μm, rozprowadzić 70 μls 8% roztworu jedwabiu na formach PDMS za pomocą narzędzia do rozprowadzania cieczy, którym zazwyczaj jest końcówka strzykawki 1 mL ².
5. Pozostawić filmy jedwabne do wyschnięcia bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy ciśnieniu 150 Pa przez 90 min lub do czasu wyschnięcia filmów.
6. Po wyschnięciu filmów umieścić cały zestaw, w tym formy PDMS, w komorze do wyżarzania w wodzie na >4 h, aby uzyskać film nierozpuszczalny w wodzie. Zazwyczaj jest to pusta komora eksykatora z wodą w dolnym zbiorniku, w której wytworzono próżnię 25 kPa ¹⁵.
7. Wyjąć filmy jedwabne z komory do wyżarzania w wodzie i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
8. Przygotować kąpiel z 70% EtOH w szalce Petriego 35 mm i umieścić w niej podłoża kontrolne (np. powierzchnie szklane lub plastikowe) oraz pierścienie ze stali nierdzewnej na co najmniej 10 min w celu sterylizacji.
9. Wyjąć filmy jedwabne z form PDMS za pomocą pęsety, zanurzyć je w 70% EtOH i umieścić próbkę w płytce 24-dołkowej wypełnionej uprzednio 1 mL 70% EtOH, upewniając się, że strona wzorowana jest skierowana do góry, aby umożliwić adhezję komórek.
10. Po umieszczeniu każdej próbki filmu jedwabnego w odpowiednim dołku, nałożyć na górę obciążniki w postaci pierścieni ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 11,65 mm, średnica zewnętrzna 15,45 mm i grubość 1,18 mm).
11. Inkubować próbki z pierścieniami przez 10 minut, aby zapewnić sterylność.
12. Usunąć EtOH i przemyć każdą próbkę 3x 1 mL PBS. Pozostawić każdy płukanie na 5 min, aby umożliwić pełną dyfuzję.
13. Usunąć PBS za pomocą szklanej pipety aspiracyjnej, dbając o usunięcie większości pęcherzyków powietrza spod próbek filmu jedwabnego.
14. Przygotować linię komórkową do wysiewu. Przykładowo, poddać linię komórek nabłonka rogówkowo-limbalnego człowieka (HCLE) trypsynizacji za pomocą 0,25% roztworu trypsyny i kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA) przez 7 min. Dezaktywować trypsynę, dodając objętość 1:1 pożywki DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) z dodatkiem 10% FBS. Odwirować trypsynizowane komórki HCLE, dodać 8 mL pożywki bezsurowiczej dla keratynocytów (K-SFM) do osadu komórkowego, delikatnie wymieszać w celu zdyspergowania komórek HCLE i przeprowadzić zliczanie komórek.
15. Nanieść 500 μL zawiesiny HCLE na dołek, zazwyczaj stosując gęstość 10,000 cells/cm².
16. Umieścić hodowle w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ i przeprowadzić wybrany protokół eksperymentalny.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający podsumowany 10-etapowy proces produkcji filmu jedwabnego i przygotowania systemu hodowlanego.

Rysunek 2. (A) Macierz 21 barwników z topografiami powierzchni w formie wzorowanych linii, wytworzona na wafelku krzemowym o średnicy 90 mm z wykorzystaniem standardowych technik fotolitografii i trawienia suchego. (B) Filmy jedwabne zachowują oryginalne cechy wzoru równoległych linii po odlewaniu na powierzchniach form z PDMS. (C) Schemat przedstawiający projekt rozmiaru cech wybrany w celu promowania wyrównania komórkowego. (D) Przekrój poprzeczny filmu jedwabnego ilustrujący zachowaną wzorowaną powierzchnię z równoległymi liniami.

Rysunek 3. Mikrografie z skaningowej mikroskopii elektronowej linii komórek HCLE przylegających do (A) wzorcowanych i (B) płaskich filmów jedwabnych w 2. dniu hodowli. Hodowle HCLE nadal proliferują do momentu osiągnięcia konfluencji na (C) wzorcowanych i (D) płaskich powierzchniach do 8. dnia hodowli.

Rysunek 4. (A, D, G) Wzorcowane i (B, E, H) płaskie błony jedwabne z hodowlą komórek HCLE w porównaniu do (C, F, I) szklanych podłoży kontrolnych w (A-C) 1. dniu, (D-F) 4. dniu oraz (G-I) 8. dniu hodowli. (J) Zawartość kwasów nukleinowych wyznaczona testem CyQuant oraz (K) dane z testu aktywności metabolicznej MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolium bromide), wykazujące żywotność HCLE na obu typach podłoży z błon jedwabnych (wzorcowanych i płaskich) w porównaniu do szklanych powierzchni kontrolnych w czasie (paski skali = 100 μm).

Wideo 1. Obrazowanie w fazowym kontraście w trybie time-lapse przedstawiające migrację komórek HCLE po powierzchni wzorowanej błony jedwabnej w okresie 18 hr. Komórki wysiano z gęstością 10k/cm² i inkubowano przez 2 hr. przed obrazowaniem. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Wideo 2. Obrazowanie w fazowym kontraście w trybie time-lapse komórek HCLE migrujących po płaskiej kontrolnej powierzchni TCP w okresie 18 hr. Komórki wysiano z gęstością 10k/cm² i inkubowano przez 2 hr. przed obrazowaniem. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Stosowanie regenerowanych błon jedwabnych jako podłoża do hodowli komórkowych zyskało popularność w ciągu ostatnich dwóch dekad dzięki szczegółowej charakterystyce właściwości materiałowych tego białka oraz zwiększonemu zrozumieniu jego użyteczności jako biomateriału ^3,8. Opisany tutaj system hodowli stanowi nowatorski system testowy in vitro do oceny oddziaływań komórek z powierzchnią na wzorowanych podłożach z biomateriału w postaci błon jedwabnych ⁷. System ten umożliwia pogłębioną analizę oddziaływań komórkowych w czasie, którą można łatwo zaadaptować do wysokoprzepustowego gromadzenia danych. Jest to w dużej mierze możliwe dzięki temu, że błony jedwabne posiadają szereg regulowanych właściwości biomateriałowych, które można modyfikować, aby bezpośrednio wpływać na funkcje komórek ^8,9,12, w tym: kontrolę mikro- i nanotopografii powierzchni ⁷; różnorodną chemię powierzchni poprzez modyfikację kowalencyjną lub adsorpcję biologicznie czynnych cząsteczek ¹³; wytrzymałe właściwości mechaniczne ^15,16; kontrolę hydrofilowości/hydrofobowości materiału ¹⁶; ładowanie związków biologicznych w całej objętości materiału w celu ich uwalniania ^4,8,17 oraz kontrolowane tempo rozpuszczania/degradacji enzymatycznej poprzez kontrolę struktury drugorzędowej (zawartości struktur beta-kartka) ^11,18,19.

Przezroczystość filmów jedwabnych uzyskuje się poprzez wyżarzanie filmów przez określony czas w próżni w obecności pary wodnej ^7,15. To podejście procesowe umożliwia formowanie wtórnej struktury harmonijki β, co sprzyja nierozpuszczalności materiału w wodzie, jednocześnie minimalizując dyfrakcję światła ¹⁵. Przezroczystość tych filmów jest kluczowa dla umożliwienia bezpośredniego obrazowania żywych komórek, które może być stosowane w wielu trybach obrazowania (np. szerokopolowym i fluorescencyjnym) z wykorzystaniem dowolnych systemów mikroskopowych ^12,20. Oprócz obrazowania żywych komórek, filmy jedwabne można łatwo usunąć z układu hodowlanego, co pozwala na dodatkową fiksację i analizę. Tym samym szeroka gama bezpośrednich ocen eksperymentalnych, które można przeprowadzić w tym systemie, ma zastosowanie do wielu rodzajów źródeł komórek/tkanek w wielu dziedzinach technicznych ^{3,8,9,12,13,21}. Wyniki obrazowania time-lapse ilustrują sposób gromadzenia danych z hodowli w czasie rzeczywistym i zostały wykorzystane jako przykład do pokazania, jak topografia powierzchni wpływa na interakcje komórkowe. Reprezentatywne wyniki demonstrują, w jaki sposób biomateriały z filmów jedwabnych mogą być wykorzystywane do wspierania wzrostu hodowli HCLE i że są one podatne na szereg standardowych testów proliferacji komórkowej i metabolicznych (Rys. 4). Dodatkowo, hodowle są fiksowane i przetwarzane do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej lub innych protokołów (Rys. 3).

Podłoża z błon jedwabnych są wytwarzane w laboratorium z wysoką precyzją i powtarzalnością, przy stosunkowo niskim koszcie (Rys. 1). Umożliwia to odtwarzalność zarówno w konfiguracji systemu hodowli, jak i w wynikach eksperymentalnych. Wykazano, że proces wyżarzania w wodzie pozwala na otrzymanie stabilnego materiału z błony jedwabnej do hodowli, który charakteryzuje się określonymi tempami degradacji zależnymi od stężenia proteaz w roztworze ^2,15,22. W konsekwencji materiały te mogą być stosowane przez dłuższy czas w długoterminowych hodowlach komórkowych lub pozostawać zaimplantowane przez miesiące lub lata, w zależności od lokalizacji fizjologicznej ⁸. Ponadto niedawne prace wykazały, że zarówno struktura białkowa, jak i właściwości materiałowe wyżarzanych w wodzie błon jedwabnych są spójne między partiami, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników hodowli, co potwierdzono za pomocą różnych metod badań mechanicznych i biofizycznych ^15,16. Dodatkowo powierzchnia materiału wykazała dużą jednorodność między partiami błon, co potwierdzono w badaniach SEM, mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz badaniach hodowli komórkowych {Lawrence:2008wr, Omenetto:2008tc, Bray:2011kq}^7,23,24. Stabilność i spójność materiału są istotnymi czynnikami wpływającymi na to, w jaki sposób komórka będzie wykrywać podłoże hodowlane poprzez różne szlaki mechanotransdukcji, co w ostateczności prowadzi do pożądanej lub niepożądanej odpowiedzi komórkowej ^25,26.

Historyczne standardy podłoży hodowlanych, takie jak szkło lub plastik traktowany do hodowli tkankowej, zapewniają odpowiednie podłoża do adhezji komórek. Materiały te nie nadają się jednak do dalszego zastosowania in vivo. Można założyć, że biomateriał w postaci filmu jedwabnego może zostać dostosowany in vitro, a po osiągnięciu oczekiwanych rezultatów eksperymentalnych, tak zmodyfikowany film może zostać bezpośrednio przeniesiony do modelu in vivo. Takie powiązanie projektowania eksperymentów in vitro i in vivo stanowi ogromną zaletę implantowalnych biomateriałów jedwabnych w porównaniu z innymi podłożami rutynowo stosowanymi in vitro.