Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Podsumowanie

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Streszczenie

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury, które nazwaliśmy MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), i wykorzystaliśmy je do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu badania interakcji komórka-komórka. Naszym nadrzędnym celem było opracowanie modeli odtwarzających architekturę przedinwazyjnych zmian w piersi, aby zbadać ich progresję do fenotypu inwazyjnego. W szczególności opracowaliśmy modele do analizy interakcji między wariantami przednowotworowych komórek nabłonkowych piersi a innymi typami komórek mikrośrodowiska guza, które są zaangażowane w przyspieszanie lub hamowanie progresji przedinwazyjnych komórek nabłonkowych piersi do inwazyjnego raka przewodowego. Innymi badanymi do tej pory typami komórek są komórki mioepitelialne, fibroblasty, makrofagi oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego krwi i limfy. Oprócz modeli MAME, zaprojektowanych w celu odtworzenia interakcji komórkowych w piersi podczas progresji nowotworu, opracowaliśmy analogiczne modele dla progresji raka prostaty.

W niniejszym materiale przedstawiamy procedury tworzenia 3D kokultur wraz z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz funkcjonalnego testu proteolizy w celu śledzenia przejścia kokultur komórek raka przewodowego piersi in situ (DCIS) i fibroblastów w fenotyp inwazyjny w czasie, w tym przypadku przez dwadzieścia trzy dni hodowli. Kokultury MAME składają się z wielu warstw. Fibroblasty są zatopione w dolnej warstwie kolagenu typu I. Na niej umieszcza się warstwę zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM), na której wysiewa się komórki DCIS. Ostatnią, górną warstwę stanowi 2% rBM, która jest uzupełniana przy każdej wymianie pożywki. Aby zobrazować proteolizę związaną z progresją do fenotypu inwazyjnego, stosujemy fluorescencyjne białka macierzy z wygaszonym sygnałem (DQ) (DQ-collagen I zmieszany z warstwą kolagenu I oraz DQ-collagen IV zmieszany z middle layer rBM) i obserwujemy żywe kultury za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przekroje optyczne są rejestrowane, przetwarzane i rekonstruowane w 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji Volocity. W ciągu 23 dni w kokulturach MAME komórki DCIS proliferują i zlewają się w duże struktury inwazyjne. Fibroblasty migrują i zostają włączone w te struktury inwazyjne. Fluorescencyjne fragmenty proteolityczne kolagenów znajdują się w sąsiedztwie powierzchni struktur DCIS, wewnątrzkomórkowo, a także są rozproszone w całej otaczającej macierzy. Leki celowane w szlaki proteolityczne, chemokinowe/cytokinowe i kinazowe lub modyfikacje w składzie komórkowym kokultur mogą zmniejszać inwazyjność, co sugeruje, że modele MAME mogą być wykorzystywane jako badania przesiewowe w fazie przedklinicznej dla nowych podejść terapeutycznych.

Protokół

1. Przygotowanie substratów DQ

1. Pozostaw liofilizowane substraty DQ do ogrzania do temperatury pokojowej przed otwarciem fiolek, przygotuj roztwór zapasowy substratu DQ o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, podziel go na aliquoty po 50 μl i przechowuj w temperaturze 4 °C.

Może być konieczne poddanie substratu DQ działaniu kąpieli wodnej w myjce ultradźwiękowej przez ok. 5 min i podgrzanie do 50 °C w celu ułatwienia dyspersji.

2. Odmrozić rBM na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C; z rBM należy obchodzić się na lodzie przez cały czas.
3. Aby przygotować 10X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), rozpuścić 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na₂HPO₄ (1 M) oraz 2,4 g KH₂PO₄ (0,02 M) w 800 ml wody ultrapure. Dostosować pH roztworu buforu PBS do wartości 7,4 za pomocą 1,0 M HCl. Uzupełnić objętość do 1 litra i wysterylizować poprzez filtrację.
4. Przygotować roztwór kolagenu I na lodzie: 8 części schłodzonego kolagenu I na 1 część schłodzonego 10X PBS. Dostosować pH mieszaniny do wartości 7,2-7,6 za pomocą sterylnego 0,1 M NaOH. Sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych i uzupełnić objętość końcową do 10 części sterylną wodą.
5. Przygotować matrycę DQ-collagen I:collagen I poprzez rozcieńczenie DQ-collagen I w roztworze kolagenu I w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 2,4 mg/ml.
6. Przygotować matrycę DQ-collagen IV:rekonstytuowana błona podstawna (rBM) poprzez rozcieńczenie DQ-collagen IV w rBM (Cultrex lub Matrigel) w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 12-15 mg/ml. Mieszać na lodzie, delikatnie pipetując, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.

2. Przygotowanie kokultur MAME

Schematyczny rysunek kokultur przedstawiono na Ryc. 1.

1. Umieścić dwa prostokątne plastikowe szkiełka nakrywkowe (sterylizowane w 70% alkoholu przez 10 min i wysuszone na powietrzu) w 35-mm szalce hodowlanej lub użyć IbiTreat 35-mm μ-Dish. Niniejsze instrukcje dotyczą zarówno szkiełek nakrywkowych, jak i μ-Dishes, których używamy do badań przy użyciu mikroskopu biologicznego. Do badań przy użyciu mikroskopu odwróconego stosujemy wyłącznie μ-Dishes.
2. Wymieszać odpowiednią liczbę fibroblastów z macierzą DQ-collagen I:collagen I. Dla długoterminowych kokultur przedstawionych na rysunkach 2 i 3 stosujemy 500 fibroblastów w 10 μl pożywki oraz 60 μl macierzy DQ-collagen I:collagen I.
3. Za pomocą mikropipety 100-μl ostrożnie nanieść i rozprowadzić 70 μl mieszaniny fibroblastów i macierzy DQ-collagen I:collagen I na całej powierzchni każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie pozostawić w 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem, bez CO₂, na 30 min w celu zestalenia.
4. Przenieść szalki 35-mm ze szkiełkami nakrywkowymi do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 10 min w celu równoważenia.
5. Wyjąć z inkubatora i pozostawić szalki 35-mm pod dygestorium, aż osiągną temperaturę pokojową.
6. Dodać 60 μl macierzy DQ-collagen IV:rBM na wierzch zestalonej macierzy DQ-collagen I:collagen I z zatopionymi fibroblastami. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie i równomiernie rozprowadzić macierz DQ-collagen IV:rBM, unikając zarysowania macierzy fibroblastów i DQ-collagen I:collagen I.
7. Przenieść szalki 35-mm ze szkiełkami nakrywkowymi do inkubatora w 37 °C z 5% CO₂ na 10 min w celu zestalenia. Podczas zestalania macierzy DQ-collagen IV:rBM należy przeprowadzić trypsynizację i policzyć komórki nabłonkowe.
8. Nanieść 50 μl zawiesiny komórek nabłonkowych/nowotworowych na szkiełka nakrywkowe pokryte macierzą DQ-collagen IV:rBM. Umieścić szalki 35-mm ze szkiełkami w inkubatorze w 37 °C. Pozostawić od 40 do 60 min, aby komórki przytwierdziły się do macierzy DQ-collagen IV:rBM. Dla długoterminowych kokultur przedstawionych na rysunkach 2 i 3 stosujemy 2500 komórek nabłonkowych lub nowotworowych.
9. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej 2% rBM do każdej szalki 35-mm. W przypadku stosowania leków należy je dodać na tym etapie.
10. Inkubować przez pożądany czas przed obrazowaniem. W przypadku kultur długoterminowych pożywkę należy wymieniać co 3-4 dni. Komórki można utrzymywać w ich standardowej pożywce hodowlanej. Dla kokultur MAME linii komórek piersi stosujemy Epithelial Basal Medium (MEBM-PRF) uzupełnione o MEGM SingleQuots.

3. Wykonanie obrazowania 4D (3D + czas) żywych kokultur MAME przy użyciu mikroskopii konfokalnej

1. W przedstawionych badaniach dowodzących słuszności koncepcji kokultury MAME znakowano fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek zgodnie z naszą opublikowaną procedurą¹. Po przemyciu PBS-em kokultury inkubowano z 5 μM CellTracker Orange w medium MEGM przez 45 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C, ponownie przemyto PBS-em, a następnie inkubowano w podgrzanym medium MEGM przez 30 min w inkubatorze w 37 °C z 5% CO₂ przed obrazowaniem.
2. Obrazowanie żywych kokultur MAME należy przeprowadzić przy małym powiększeniu (10X, obiektyw immersyjny wodny) przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM-510 META.
3. Przekroje optyczne rejestruje się w odstępach przez całą głębokość struktur. W naszych badaniach przekroje optyczne rejestrowano w odstępach 10 μm.
4. Na podstawie przekrojów optycznych należy zrekonstruować obrazy w 3D. Do generowania rekonstrukcji 3D wykorzystujemy oprogramowanie Volocity.
5. Z rekonstrukcji 3D należy przygotować filmy, aby umożliwić wizualizację struktur, oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań z otaczającymi macierzami. Filmy przygotowywaliśmy za pomocą programu QuikTime Player 7.

4. Reprezentatywne wyniki

Opracowane przez nas kokultury MAME stanowią przystępny model eksperymentalny do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, pozwalający na badanie interakcji między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi guz piersi i jego mikrośrodowisko. W niniejszej pracy demonstrujemy zdolność modeli MAME do odtworzenia interakcji międzykomórkowych podczas progresji raka piersi oraz możliwość wykorzystania obrazowania żywych komórek do śledzenia tych interakcji w czasie. Ilustrujemy możliwość obrazowania interakcji między preinwazyjną ludzką linią komórkową raka piersi MCF10.DCIS a ludzką linią fibroblastów związanych z rakiem piersi WS-12Ti w okresie ponad trzech tygodni hodowli. Kokultury obrazowano w 3., 16. i 23. dniu. Przekroje optyczne przez całą objętość kokultur zrekonstruowano w 3D, a reprezentatywne przykłady dla każdego z trzech punktów czasowych przedstawiono na Rysunku 2. Czerwona fluorescencja na Rysunku 2 reprezentuje komórki MCF10.DCIS i WS-12Ti. Aby rozróżnić dwa typy komórek w długoterminowych kokulturach, można przed utworzeniem kultur przeprowadzić transfekcję lub transdukcję poszczególnych typów komórek białkami fluorescencyjnymi. Kokulturę MAME komórek MCF10.DCIS i WS-12Ti, które zostały różnicowo oznakowane białkami fluorescencyjnymi w celu ich identyfikacji, przedstawiono na Rysunku 3.

Poprzez wprowadzenie substratów, w tym przypadku kolagenów DQ, do kokultur MAME, możemy oceniać i ilościowo określać zmiany w proteolizie związane z przejściem w fenotyp inwazyjny w czasie. Opracowaliśmy metody ilościowego oznaczania fluorescencyjnych produktów rozszczepienia powstałych w wyniku degradacji kolagenu DQ^2,3. Normalizujemy produkty degradacji w całej objętości 3D kokultur MAME w przeliczeniu na pojedynczą komórkę poprzez znakowanie i liczenie jąder komórkowych. Ponadto możemy zlokalizować degradację w przedziałach zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych oraz ilościowo określić całkowitą ilość produktów degradacji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, zgodnie z naszymi wcześniejszymi opisami². Zielona fluorescencja na Rysunkach 2 i 3 reprezentuje produkty rozszczepienia dwóch substratów kolagenu DQ. Obecnie niedostępne są kolageny z różnymi znacznikami, które pozwoliłyby nam odróżnić degradację kolagenu typu IV od degradacji kolagenu typu I.

Interakcje w kokulturach MAME są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Aby uzyskać informacje czasowe i dynamiczne, ten sam obszar widzenia może być obrazowany, a przekroje optyczne całej objętości preparatu mogą być wykonywane wielokrotnie w okresie od kilku minut do kilku tygodni, co pozwala na gromadzenie danych w 4-D. Na Rysunku 2 ilustrujemy dość gwałtowne zmiany zachodzące w ciągu 23 dni: zmiany w liczbie komórek, migrację i interakcje komórkowe, objętości struktur, kształty struktur, odchylenia struktur od sferyczności, przerosty inwazyjne oraz proteolizę. Ponadto wykazujemy ogólną zmianę objętości wynikającą z degradacji otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej przez kokultury MAME w tym okresie. W trzecim dniu, jak pokazano na Rysunku 2A, objętość wynosi 110,000 μm³. W przeciwieństwie do tego, objętość kokultur MAME w 16. i 23. dniu wynosi zaledwie 46,250 μm³, co zilustrowano na Rysunkach 2B i C.

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja kokultur MAME. Plastikowa szkiełko zakrywkowe jest powlekane kolagenem I, zawierającym DQ-collagen I oraz fibroblasty (kolor magenta). Dodawana jest druga warstwa zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM) zawierająca DQ-collagen IV. Komórki nowotworowe (kolor czerwony) są wysiewane na wierzch, a przy każdej wymianie pożywki nakładana jest warstwa 2% rBM w pożywce hodowlanej (białe kropki). Kolor zielony reprezentuje fluorescencyjne produkty rozkładu DQ-collagen I i IV.

Rycina 2. Kokultury MAME ludzkich komórek raka piersi MCF10.DCIS i ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti. Fibroblasty osadzono w kolagenie I/DQ-kolagenie I i przykryto rBM zawierającym DQ-kolagen IV. Następnie komórki DCIS wysiano na rBM i przykryto pożywką zawierającą 2% rBM. W ciągu 23 dni kokultury przedstawionych tutaj zaobserwowano proliferację komórek, degradację DQ-kolagenu IV i I (zielony) oraz macierzy kolagenowych, o czym świadczył spadek objętości kokultur. Komórki zlokalizowano poprzez znakowanie CellTracker Orange in situ przed obrazowaniem (czerwony). Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej w 3, 16 i 23 dniu kokultury. Uzyskane przekroje optyczne zrekonstruowano w 3D przy użyciu oprogramowania Volocity. Powiększenie 10X.

Rycina 3. 16-dniowe kokultury MAME ludzkich komórek piersi MCF10.DCIS oraz ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti, które wykazują ekspresję odpowiednio RFP (czerwony) i YFP (biały). Kokultury ustanowiono i analizowano analogicznie jak na Rycini 2. Przedstawione tutaj dwa typy komórek zostały jednak poddane różnicowemu znakowaniu, aby można było je od siebie odróżnić. Obrazy przy większym powiększeniu na tej rycinie, w porównaniu do tych na Rycini 2, ilustrują proteolizę DQ-collagen IV na powierzchni komórek DCIS oraz rozproszoną proteolizę DQ-collagen I w obszarach sąsiadujących z fibroblastami. Powiększenie, 20X.

Dyskusja

Jak wykazano, kokultury MAME mogą być wykorzystywane do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu analizy oddziaływań między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi guz piersi i jego mikrośrodowisko. W prowadzonych w naszym laboratorium badaniach wykorzystaliśmy kokultury MAME do identyfikacji szlaków proteolitycznych związanych z przejściem z DCIS do naciekającego raka przewodowego, a także do analizy oddziaływań między szlakami proteolitycznymi a innymi szlakami zaangażowanymi w ten proces, takimi jak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rekonstruowana błona podstawna (Cultrex)	Trevigen Inc.	3445-005-01	Porównywalna z Matrigel (BD Biosciences)
Kolagen I	Cohesion Laboratories	5005-B
Substraty DQ (kolagen I, IV)	Invitrogen	DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052
Plastikowe szkiełka nakrywkowe 22-mm	Fisher Scientific	12-547	Przeciąć na pół, pozostawić w 70% etanolu na 10 min i wysuszyć na powietrzu przed użyciem.
Pożywka do hodowli komórkowej	Lonza Inc.	MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136	Bez czerwieni fenolowej
ibiTreat μ-Dish	Ibidi	80136
Oprogramowanie Volocity	PerkinElmer, Inc.	Wersja 5.5	Do generowania rekonstrukcji 3D i filmów można użyć oprogramowania do obrazowania innych marek.