Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Podsumowanie

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Streszczenie

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury, które nazwaliśmy MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), i wykorzystaliśmy je do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu badania interakcji komórka-komórka. Naszym nadrzędnym celem było opracowanie modeli odtwarzających architekturę przedinwazyjnych zmian w piersi, aby zbadać ich progresję do fenotypu inwazyjnego. W szczególności opracowaliśmy modele do analizy interakcji między wariantami przednowotworowych komórek nabłonkowych piersi a innymi typami komórek mikrośrodowiska guza, które są zaangażowane w przyspieszanie lub hamowanie progresji przedinwazyjnych komórek nabłonkowych piersi do inwazyjnego raka przewodowego. Innymi badanymi do tej pory typami komórek są komórki mioepitelialne, fibroblasty, makrofagi oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego krwi i limfy. Oprócz modeli MAME, zaprojektowanych w celu odtworzenia interakcji komórkowych w piersi podczas progresji nowotworu, opracowaliśmy analogiczne modele dla progresji raka prostaty.

W niniejszym materiale przedstawiamy procedury tworzenia 3D kokultur wraz z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz funkcjonalnego testu proteolizy w celu śledzenia przejścia kokultur komórek raka przewodowego piersi in situ (DCIS) i fibroblastów w fenotyp inwazyjny w czasie, w tym przypadku przez dwadzieścia trzy dni hodowli. Kokultury MAME składają się z wielu warstw. Fibroblasty są zatopione w dolnej warstwie kolagenu typu I. Na niej umieszcza się warstwę zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM), na której wysiewa się komórki DCIS. Ostatnią, górną warstwę stanowi 2% rBM, która jest uzupełniana przy każdej wymianie pożywki. Aby zobrazować proteolizę związaną z progresją do fenotypu inwazyjnego, stosujemy fluorescencyjne białka macierzy z wygaszonym sygnałem (DQ) (DQ-collagen I zmieszany z warstwą kolagenu I oraz DQ-collagen IV zmieszany z middle layer rBM) i obserwujemy żywe kultury za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przekroje optyczne są rejestrowane, przetwarzane i rekonstruowane w 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji Volocity. W ciągu 23 dni w kokulturach MAME komórki DCIS proliferują i zlewają się w duże struktury inwazyjne. Fibroblasty migrują i zostają włączone w te struktury inwazyjne. Fluorescencyjne fragmenty proteolityczne kolagenów znajdują się w sąsiedztwie powierzchni struktur DCIS, wewnątrzkomórkowo, a także są rozproszone w całej otaczającej macierzy. Leki celowane w szlaki proteolityczne, chemokinowe/cytokinowe i kinazowe lub modyfikacje w składzie komórkowym kokultur mogą zmniejszać inwazyjność, co sugeruje, że modele MAME mogą być wykorzystywane jako badania przesiewowe w fazie przedklinicznej dla nowych podejść terapeutycznych.

Protokół

1. Przygotowanie substratów DQ

1. Pozostaw liofilizowane substraty DQ do ogrzania się do temperatury pokojowej przed otwarciem fiolek, przygotuj roztwór zapasowy DQ-substratu o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, podziel go na aliquoty po 50 μl i przechowuj w temperaturze 4 °C.

Może być konieczne poddanie substratu DQ działaniu kąpieli wodnej w myjce ultradźwiękowej przez ~5 min i podgrzanie do 50 °C w celu ułatwienia dyspersji.

2. Rozmrozić rBM na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C; rBM należy zawsze przechowywać i przetwarzać na lodzie.
3. Aby przygotować 10X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), rozpuścić 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na₂HPO₄ (1 M) oraz 2,4 g KH₂PO₄ (0,02 M) w 800 ml wody ultrapure. Dostosować pH roztworu buforowego PBS do wartości 7,4 za pomocą 1,0 M HCl. Uzupełnić objętość do 1 litra i wysterylizować poprzez filtrację.
4. Przygotować roztwór kolagenu I na lodzie: zmieszać 8 części schłodzonego kolagenu I z 1 częścią schłodzonego 10X PBS. Dostosować pH mieszaniny do wartości 7,2-7,6, używając sterylnego 0,1 M NaOH. Sprawdzić pH za pomocą pasków pomiarowych i uzupełnić objętość końcową do 10 części sterylną wodą.
5. Przygotować macierz DQ-collagen I:collagen I poprzez rozcieńczenie DQ-collagen I w roztworze kolagenu I w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 2,4 mg/ml.
6. Przygotować macierz DQ-collagen IV:reconstituted basement membrane (rBM) poprzez rozcieńczenie DQ-collagen IV w rBM (Cultrex lub Matrigel) w uprzednio schłodzonej probówce do końcowych stężeń odpowiednio 25 μg/ml i 12-15 mg/ml. Mieszać na lodzie, delikatnie pipetując, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.

2. Przygotowanie kokultur MAME

Schemat kokultur przedstawiono na Rysunku 1.

1. Umieść dwa prostokątne plastikowe szkiełka nakrywkowe (sterylizowane w 70% alkoholu przez 10 min i wysuszone na powietrzu) w 35-milimetrowej płytce hodowlanej lub użyj naczynia IbiTreat 35-mm μ-Dish. Poniższe instrukcje dotyczą zarówno szkiełek nakrywkowych, jak i naczyń μ-Dish, których używamy do badań pod mikroskopem prostym. Do badań pod mikroskopem odwróconym stosujemy wyłącznie naczynia μ-Dish.
2. Wymieszaj pożądaną liczbę fibroblastów z matrycą DQ-collagen I:collagen I. W przypadku długoterminowych kokultur przedstawionych na Rysunkach 2 i 3 używamy 500 fibroblastów w 10 μl pożywki oraz 60 μl matrycy DQ-collagen I:collagen I.
3. Za pomocą mikropipety 100-μl ostrożnie nanieś i rozprowadź 70 μl mieszaniny fibroblasty:DQ-collagen I:collagen I na całej powierzchni każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie pozostaw w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem, bez CO₂, przez 30 min w celu zestalenia.
4. Przenieś 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 10 min w celu equilibracji.
5. Wyjmij z inkubatora i pozostaw 35-milimetrowe płytki pod dygestorium, aż osiągną temperaturę pokojową.
6. Dodaj 60 μl matrycy DQ-collagen IV:rBM na wierzch zestalonej matrycy DQ-collagen I:collagen I z zatopionymi fibroblastami. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie i równomiernie rozprowadź matrycę DQ-collagen IV:rBM, unikając porysowania matrycy fibroblasty:DQ-collagen I:collagen I.
7. Przenieś 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 10 min w celu zestalenia. Podczas zestalania się matrycy DQ-collagen IV:rBM przeprowadź trypsynizację i zliczenie komórek nabłonkowych.
8. Nanieś 50 μl zawiesiny komórek nabłonkowych/nowotworowych na szkiełka nakrywkowe pokryte matrycą DQ-collagen IV:rBM. Umieść 35-milimetrowe płytki zawierające szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pozostaw na 40 do 60 min, aby komórki przywarły do matrycy DQ-collagen IV:rBM. W przypadku długoterminowych kokultur przedstawionych na Rysunkach 2 i 3 używamy 2500 komórek nabłonkowych lub nowotworowych.
9. Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej 2% rBM do każdej 35-milimetrowej płytki. Jeśli planowane są zabiegi z użyciem leków, należy je dodać na tym etapie.
10. Inkubuj przez pożądany czas przed obrazowaniem. W przypadku kultur długoterminowych pożywkę należy wymieniać co 3-4 dni. Komórki można utrzymywać w ich standardowej pożywce hodowlanej. Dla kokultur MAME linii komórkowych piersi używamy pożywki podstawowej dla komórek nabłonkowych (MEBM-PRF) suplementowanej MEGM SingleQuots.

3. Przeprowadzenie obrazowania 4D (3D + czas) żywych kokultur MAME przy użyciu mikroskopii konfokalnej

1. W celu przeprowadzenia przedstawionych badań dowodzących zasady działania, kokultury MAME znakowano fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek zgodnie z naszą opublikowaną procedurą¹. Po przemyciu PBS, kokultury inkubowano z 5 μM CellTracker Orange w medium MEGM przez 45 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C, ponownie przemyto PBS, a następnie inkubowano w uprzednio ogrzanym medium MEGM przez 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przed obrazowaniem.
2. Należy wykonać obrazy żywych kokultur MAME przy małym powiększeniu (10X, obiektyw immersyjny wodny) na konfokalnym mikroskopie Zeiss LSM-510 META.
3. Przekroje optyczne są rejestrowane w odstępach w całej głębokości struktur. W naszych badaniach rejestrujemy przekroje optyczne w odstępach 10 μm.
4. Należy wykorzystać przekroje optyczne do rekonstrukcji obrazów w 3D. Do generowania rekonstrukcji 3D wykorzystujemy oprogramowanie Volocity.
5. Należy przygotować filmy z rekonstrukcji 3D, aby umożliwić wizualizację struktur, oddziaływań międzykomórkowych oraz interakcji z otaczającymi macierzami. Filmy przygotowaliśmy za pomocą programu QuikTime Player 7.

4. Reprezentatywne wyniki

Opracowane przez nas kokultury MAME stanowią przystępny model eksperymentalny do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, pozwalający na badanie oddziaływań między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi nowotwór piersi i jego mikrośrodowisko. Tutaj demonstrujemy zdolność modeli MAME do odtworzenia oddziaływań komórka-komórka podczas progresji raka piersi oraz możliwość wykorzystania obrazowania żywych komórek do śledzenia tych oddziaływań w czasie. Ilustrujemy możliwość obrazowania interakcji między przedinwazyjną ludzką linią komórkową raka piersi MCF10.DCIS a ludzką linią fibroblastów związanych z rakiem piersi, WS-12Ti, przez okres ponad trzech tygodni hodowli. Obrazowanie kokultur przeprowadzono w 3., 16. i 23. dniu. Przekroje optyczne przez całą objętość kokultur zrekonstruowano w 3D, a reprezentatywne przykłady dla każdego z trzech punktów czasowych przedstawiono na Rysunku 2. Czerwona fluorescencja na Rysunku 2 reprezentuje komórki MCF10.DCIS i WS-12Ti. Aby odróżnić oba typy komórek w przypadku długoterminowych kokultur, można przed ustanowieniem hodowli przeprowadzić transfekcję lub transdukcję poszczególnych typów komórek białkami fluorescencyjnymi. Kokulturę MAME z komórkami MCF10.DCIS i WS-12Ti, które zostały różnie znakowane białkami fluorescencyjnymi w celu ich identyfikacji, przedstawiono na Rysunku 3.

Poprzez wprowadzenie substratów, w tym przypadku kolagenów DQ, do kokultur MAME, możemy oceniać i ilościowo określać zmiany w czasie proteolizy związanej z przejściem w fenotyp inwazyjny. Opracowaliśmy metody ilościowego oznaczania fluorescencyjnych produktów rozszczepienia powstałych w wyniku degradacji kolagenu DQ^2,3. Normalizujemy ilość produktów degradacji w całej objętości 3D kokultur MAME w przeliczeniu na jedną komórkę poprzez znakowanie i liczenie jąder komórkowych. Ponadto możemy zlokalizować degradację w przedziałach zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych oraz ilościowo określić całkowitą ilość produktów degradacji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, zgodnie z naszym wcześniejszym opisem². Zielona fluorescencja na Rysunkach 2 i 3 reprezentuje produkty rozszczepienia dwóch substratów kolagenu DQ. Obecnie niedostępne są kolageny z różnymi znacznikami, które pozwoliłyby nam odróżnić degradację kolagenu typu IV od degradacji kolagenu typu I.

Interakcje w kokulturach MAME są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Aby uzyskać informacje temporalne i dynamiczne, można wielokrotnie obrazować to samo pole widzenia i wykonywać przekroje optyczne przez cały preparat w określonym przedziale czasowym – od minut do tygodni – gromadząc w ten sposób dane w 4D. Na Rysunku 2 przedstawiamy dość gwałtowne zmiany zachodzące w ciągu 23 dni: zmiany w liczbie komórek, migrację komórek i interakcje międzykomórkowe, objętości struktur, kształty struktur, odchylenia struktur od sferyczności, przerosty inwazyjne oraz proteolizę. Ponadto demonstrujemy ogólną zmianę objętości wynikającą z degradacji otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej przez kokultury MAME w tym okresie. W trzeciej dobie, jak pokazano na Rysunku 2A, objętość wynosi 110 000 μm³. W przeciwieństwie do tego, objętość kokultur MAME w 16. i 23. dobie wynosi zaledwie 46 250 μm³, co zilustrowano na Rysunkach 2B i C.

Rycina 1. Schematyczny rysunek kokultur MAME. Plastikowy szkiełko nakrywki jest powlekane kolagenem I, zawierającym DQ-collagen I oraz fibroblasty (kolor magenta). Następnie dodawana jest druga warstwa zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM) zawierająca DQ-collagen IV. Na wierzchu wysiewane są komórki nowotworowe (kolor czerwony), a przy każdej zmianie pożywki nakłada się 2% rBM w pożywce hodowlanej (białe kropki). Kolor zielony reprezentuje fluorescencyjne produkty rozszczepienia DQ-collagen I i IV.

Rysunek 2. Kokultury MAME ludzkich komórek piersi MCF10.DCIS i ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti. Fibroblasty osadzono w kolagenie I/DQ-kolagenie I i przykryto rBM zawierającym DQ-kolagen IV. Następnie na rBM wysiano komórki DCIS i przykryto je pożywką zawierającą 2% rBM. W ciągu 23 dni kokultury przedstawionej na rysunku nastąpiła proliferacja komórek, degradacja DQ-kolagenu IV i I (kolor zielony) oraz macierzy kolagenowych, co objawiło się zmniejszeniem objętości kokultur. Komórki zlokalizowano poprzez znakowanie CellTracker Orange in situ przed obrazowaniem (kolor czerwony). Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej w 3., 16. i 23. dniu kokultury. Uzyskane przekroje optyczne zrekonstruowano w 3D przy użyciu oprogramowania Volocity. Powiększenie, 10X.

Rysunek 3. 16-dniowe kokultury MAME ludzkich komórek piersi MCF10.DCIS oraz ludzkich fibroblastów piersi WS-12Ti, które wykazują ekspresję odpowiednio RFP (czerwony) i YFP (biały). Kokultury przygotowano i analizowano analogicznie jak na Rysunku 2. Przedstawione tutaj dwa typy komórek zostały jednak odmiennie oznakowane, aby umożliwić ich rozróżnienie. Obrazy przy wyższym powiększeniu na tym rysunku, w porównaniu z obrazami na Rysunku 2, ilustrują proteolizę DQ-kolagenu IV na powierzchni komórek DCIS oraz dyfuzyjną proteolizę DQ-kolagenu I w obszarach sąsiadujących z fibroblastami. Powiększenie, 20X.

Dyskusja

Jak wykazano, kokultury MAME mogą być wykorzystywane do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu analizy oddziaływań między różnymi składnikami komórkowymi tworzącymi guz piersi i jego mikrośrodowisko. W prowadzonych w naszym laboratorium badaniach wykorzystaliśmy kokultury MAME do identyfikacji szlaków proteolitycznych związanych z przejściem z DCIS do naciekającego raka przewodowego, a także do analizy oddziaływań między szlakami proteolitycznymi a innymi szlakami zaangażowanymi w ten proces, takimi jak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rekonstruowana błona podstawna (Cultrex)	Trevigen Inc.	3445-005-01	Porównywalna z Matrigel (BD Biosciences)
Kolagen I	Cohesion Laboratories	5005-B
Substraty DQ (kolagen I, IV)	Invitrogen	DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052
Plastikowe szkiełka nakrywkowe 22-mm	Fisher Scientific	12-547	Przeciąć na pół, pozostawić w 70% etanolu na 10 min i wysuszyć na powietrzu przed użyciem.
Pożywka do hodowli komórkowej	Lonza Inc.	MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136	Bez czerwieni fenolowej
ibiTreat μ-Dish	Ibidi	80136
Oprogramowanie Volocity	PerkinElmer, Inc.	Wersja 5.5	Do generowania rekonstrukcji 3D i filmów można użyć oprogramowania do obrazowania innych marek.